多角度激光光散射與GPC聯(lián)接與應(yīng)用技術(shù)

1、美國懷雅特技術(shù)公司多角度激光光散射與凝膠滲透色譜儀聯(lián)接與應(yīng)用技術(shù)MALLS/GPC(SEC)WYATT TECHNOLOG Y CORPORTION(BEIJING OFFICE)地址：北京西直門北大街58號 金暉嘉園7-2302美國懷雅特技術(shù)公司北京代表處郵編：100082電話：8610-82292806傳真：8610-82290337i美國懷雅特技術(shù)公司多角度激光光散射與凝膠滲透色譜儀的聯(lián)接與應(yīng)用WYATT TECHNOLOG Y CORPORATION.一前言近十幾年來，光散射技術(shù)(Light scattering)在高分子特征分析領(lǐng)域的應(yīng)用得到了迅 速的發(fā)展。將光散射技術(shù)和凝膠滲透色譜

2、(Gel Permeation Chromatography, GPC或尺 寸排阻色譜(Size Exclusion Chromatography)分離技術(shù)相結(jié)合，不但可以測得大分子 的絕對分子量，分子旋轉(zhuǎn)半徑與第二維里系數(shù)，還可測得分子量分布，分辨分子量大 小不同的族群以及分子的形狀，分枝率及聚集態(tài)等。目前，該技術(shù)已成為一種非常有 效的工具，在美國，日本及歐洲已廣為使用，國內(nèi)近年來亦引進(jìn)了此項(xiàng)技術(shù)。二光散射簡介早在十九世紀(jì)初，人們就開始對光散射原理進(jìn)行研究。自六十年代激光被發(fā)明以來， 光散射的原理與技術(shù)便得以迅速發(fā)展，至今已成為檢測微小粒子形狀，粒徑大小，分 子量，界面電位及粒子間效應(yīng)的重要

3、工具。隨著電腦技術(shù)的日新月異，許多過去需花 費(fèi)數(shù)小時(shí)甚至數(shù)日才能完成的實(shí)驗(yàn)，如今只需數(shù)分鐘即可完成，而其準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性 也大幅度提高了。光散射現(xiàn)象，如圖1所示，當(dāng)一束光通過一間充滿煙霧的房間就會(huì)產(chǎn)生散射。利用在不同角度，不同時(shí)間所測得的光散射強(qiáng)度，再借助各種光學(xué)理論及軟件，硬件設(shè)備， 就可以測得微粒的許多特性。入射光散射光 圖1光散射現(xiàn)象在光散射發(fā)展的歷程中，以下是一些具有代表性的人物: James Clerk Maxwell (1833-1879)解釋了光是一種電磁波，并正確地計(jì)算出光的速度 Lord Rayleigh(1842-1919)研究了遠(yuǎn)小于波長的微粒散射現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)了散射強(qiáng)度與波長

4、的四次方成反比，并解釋了藍(lán)天被太陽光穿透大氣層所產(chǎn)生的散射現(xiàn)象。 Abert Ein ste in (1879-1955)研究了液體的光散射現(xiàn)象。 Cha ndrasekhara Raman (1888-1970)印度籍物理大師，提出了 Rama n效應(yīng)，其著作多次發(fā)表于印度文期刊，直至第二次 世界大戰(zhàn)結(jié)束后才逐漸被人所知。 Peter Debye( 1884-1966)延續(xù)了 Einstein的理論，描述了分子溶解于溶劑中所產(chǎn)生的光散射現(xiàn)象，提出用Debye plot,求得重量平均分子量Mw。三光散射理論激光照射到樣品時(shí)，會(huì)在各個(gè)方向產(chǎn)生散射光，于是我們可以在一個(gè)角度或多個(gè)角 度收集散射光的

5、強(qiáng)度。1. 光散射所透露的信息在任何方向的光散射強(qiáng)度與分子量和溶液的濃度成正比；散射光角度的變化與分子的尺寸大小有關(guān)。當(dāng)分子小于10nm時(shí)，各個(gè)角度的散射強(qiáng)度都相同；當(dāng)分子介于 10 至30nm時(shí)，散射強(qiáng)度則由低角度向高角度呈直線下降的趨勢； 而當(dāng)分子大于30nm時(shí)， 散射強(qiáng)度則隨角度增大呈曲線下降的趨勢。2. 基本理論由Maxwell，Einstein，Debye及Zimm 等人陸續(xù)發(fā)展起來，有關(guān)溶劑中分子量的 光散射現(xiàn)象可由下列公式表達(dá)：K*c1=+ 2A2CR( )MwP( 1)式中：常數(shù) K =4 n2(dn/dc)2no2(NA X)4)no是溶劑的折光指數(shù)。C是溶質(zhì)分子的濃度(g/

6、mol)。Na是阿佛加德羅常數(shù)。X 0是入射光的波長。DN/DC是溶液折射率與濃度變化的比值，它說明了隨溶質(zhì)濃度變化的溶液折光指數(shù) 變化。R()是單個(gè)角度的散射光(大于溶劑的散射光數(shù)量)除以入射光強(qiáng)度所得的分?jǐn)?shù)即 不同角度光散射強(qiáng)度。Mw是重均分子量。A是第二維里系數(shù)P(是光散射強(qiáng)度的函數(shù) 將P(代入式()展開得:在上式中，R()是測得值，K*c、入°、為輸入值，均為已知值；而 Mw A、rg為未 知值。3. Zimm Plot將K* C/ R o對sin2(q/2)+kc作圖，可得到著名的Zimm曲線，如圖2所示，其中K 為調(diào)整橫坐標(biāo)的設(shè)定值。sin2(O/2) + kc圖 2 Z

7、imm Plo當(dāng)B - O時(shí)，(2)式簡化為斜率即是Ak*R(0)=+ 2A2C當(dāng)C- 0時(shí)，(2)式簡化為斜率是rg2當(dāng)0 - 0, C- 0，(2)式簡化為K*1_R(0)M在縱座標(biāo)上交點(diǎn)的倒數(shù)即為 Mw實(shí)驗(yàn)的方法為配制一組不同濃度的溶液，依次在 不同的角度測量其散射光強(qiáng)度，由計(jì)算機(jī)程序按照上列的公式繪出 Zimm Plot，并求得 Mw <rg2>及A2值，這是極少數(shù)能直接測得絕對分子量的方法之一。但由于結(jié)果僅為單 一平均值，因此較適用于成分單一，分布較窄的分子，對于分布較寬或有不同族群分 布的樣品，則較難看出全貌。四光散射與GPC/SECGPC/SEC可以將溶劑中的分子按重

8、量或尺寸大小依次洗脫出來。利用此項(xiàng)技術(shù)將光散射儀器與GPC/SEC聯(lián)用，除了可以分出不同的族裙，還可測得不同族群的分布, 并且不需要另外標(biāo)準(zhǔn)樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于光散射信號直接與分子量大小有關(guān)，因此可以直接測出重均絕對分子量，并獲得其它許多有關(guān)的信息。Volume (mL)2.0圖4光散射強(qiáng)度與GPC層析圖nrcpreDvnwy16Chromatography with LS Set-upPump GOFilterInjectorColumnsDAWN-EOS or miniDAWNoptiiftb-nsr UVDetector(Optional)Rl DetectorWasteoptiiftb

9、-nsr UV Detector (Optional) 口 iliDTOiTi 口 ComputerPlumbingElectrical圖5光散射強(qiáng)度與GPC/SEC聯(lián)用1 Debye plot通常GPC/SEC的樣品注射濃度就很低，再經(jīng)過色譜柱得到進(jìn)一步的稀釋，圖4中光散射信號上的任何一點(diǎn)，其濃度都極低(趨近于零)。根據(jù)公式，當(dāng)2 A2C - 0,1.00x10-68.00x10-76.00x10-74.00x10-72.00x10-70.000.20.40.60.8將K* C/ Ro對sin2(q/2)+kc作圖6,其縱坐標(biāo)交點(diǎn)即為1/Mw，由直線的斜率可得 到rg2，圖4光散射信號的每點(diǎn)

10、都可以得到上述結(jié)果，由此可以求得分子量及旋轉(zhuǎn)半 徑rg2的分布，如圖7所示：sin? theta/2)1.090? & AUX detectors0.0Peak, Slice : 1, 184Volume : 13.067 mLFit degree : 1Cone. : (1.488 ?0.006)e-5 g/mLMw : (6.505 ?0.088)e+6 g/molRadius : 158.8 ?0.5 nm* HEPARIN2圖 6 Debye plotMolar Mass vs. Volume1.0x16o EL AT ss a M rQKO MI.OxlB8.54o9.09.

11、510.0Volume (mL)10.511.011.5圖7分子量對洗脫體積作圖Cumulative Molar Mass* LT1 LT2* LT3* LT48 6 4 2clo.o.o弓0102亠 1S.glEFIEc?0.0'1.0X1031 .0X10" I1.0x10s1.0X10°l.oxio7Molar Mass (g/mol)圖8積分分子量2分子形狀不論是分布較寬或是多峰分布的樣品，皆可通過測量分子量及分子旋轉(zhuǎn)半徑得到分 子形狀的數(shù)據(jù)。球形分子ri3 xMilog 門=k + 1/3 log Mi無規(guī)則線團(tuán)狀分子ri2 xMilog 門=k + 1/

12、2 log Mi 棒狀分子ri1 xMi log ri = k + 1/1 log Mi將log ri, log Mi作圖，有直線的斜率可以獲知分子的形狀，如圖9所示:0.5-0.6)圖9-1 M、巾與分子形狀的關(guān)系100.010.01.0x10 41.0x10 51.0x10 61.0x10RM S Radius vs. Molar M assGA TC2 011000.00.54 ?0.01Molar Mass (g/mol)圖9-2構(gòu)型判斷，rg對Mw作圖。斜率為0.540.01 o表明分子是具有無規(guī)則線團(tuán)構(gòu)象的線性聚合物SMRM olar M ass (g/mol)構(gòu)型判斷，rg對Mw

13、作圖。斜率大于0.6，表明分子具有伸展結(jié)構(gòu)。斜率為 1.0，表明是棒狀100.0SMR10.01.0x105RM S Radius vs. Molar M assGA TE 2_011.0x106M olar M ass (g/mol)1.0x1071.0x108圖9-4構(gòu)型判斷，rg對Mw作圖。其U型曲線表明為典型的高支化度結(jié)構(gòu)。3需要量多少個(gè)角度在低角度的時(shí)候，有雜質(zhì)所產(chǎn)生的噪音信號干擾會(huì)很大，如圖10所示，所以只取低角度，加上九十度兩個(gè)角度，其誤差就會(huì)相對很大；若只取九十度則只能求得分子 量，無法測得旋轉(zhuǎn)半徑，所以最起碼要加上一組高角度來修正，則誤差會(huì)較少很多。圖10雜質(zhì)較多的GPC層析

14、圖Solvent圖11三個(gè)檢測角度9 scattering angleGlass CellO' Observed angle4光散射儀器最基本的儀器mini DAWN TREOS如圖11所示，在與入射光成45度、90度、135 度角配置三組光電二極管檢測器，同時(shí)檢測不同角度的光散射強(qiáng)度，而激光經(jīng)由樣品 槽的毛細(xì)管通道，樣品槽為石英材質(zhì)。如果要增加測量角度，可以如 DAWN HELEOS 在樣品槽的兩側(cè)以不對稱得方式增加檢測器的數(shù)目， 如圖12所示可高達(dá)18個(gè)角度之多。五應(yīng)用光散射強(qiáng)度與分子的大小及分子量有直接的關(guān)系，而SEC/GPC能分離不同尺寸及分子量的分子，結(jié)合此兩種特性，可以得到

15、許多有用的信息，并廣泛地應(yīng)用于高分子， 生化及動(dòng)力學(xué)等研究領(lǐng)域。圖12十八角度檢測器1高分子聚合物特性利用多角度激光光散射系統(tǒng) 合SEC/GPC不必依賴泵的流速, 分子量及分子量分布等數(shù)據(jù)。(Multi-Angle Laser Light Scattering_ MALLS )結(jié) 校正曲線及其它任何的假設(shè)，即可直接求得重均絕對MAT1 : 3D PlotInt en sit圖13光散射強(qiáng)度，洗脫體積與角度作圖MALLS利用色譜柱分離出的樣品在各個(gè)角度的光散射量（如圖 13）,由RI檢測 器得到的洗脫液濃度及dn/dc值，即可計(jì)算出各個(gè)切片的分子量。 MALLS測得絕對分 子量所需的各種物性均可

16、由實(shí)驗(yàn)直接求得，無需作任何假設(shè)。而 GPC的色譜柱又有分 離雜質(zhì)的功能，可以避免傳統(tǒng)的光散射需極小心準(zhǔn)備樣品的麻煩。圖 14顯示高分子混 合物經(jīng)SEC分離后MALLS及RI的洗脫體積對照圖。由此圖看出RI對大分子量濃度 低的物質(zhì)較不敏感，而對低分子量高濃度者較敏感。Slnp UEhnrt - PEIRTA屋口3D(mL>12.0!1-S.Q圖14這是由ASTRA軟件得到的 miniDAWN （上）和Optilab示差檢測器（下）信號。溶解酵素 14,300 14,600± 3001%亮氨酸腦啡肽556 592± 63%1 OM1 口-I Owl 口 *1! -U.1

17、UC.O呂.口1 口“口 volnunTO <ml_ jt工-口圖15分子量對洗脫體積圖，有四個(gè)明顯的峰Fw1ol=air弓 vs- Volijimc1 BSA 67,000 64,300± 700 1% 23 緩激肽 1,060 1,090± 102% 42.蛋白質(zhì)及其聚合體在各種工業(yè)應(yīng)用中，決定蛋白質(zhì)的絕對特性不僅嚴(yán)格而且必要，例如在生化工程 應(yīng)用上，以蛋白質(zhì)為基質(zhì)的產(chǎn)品必須很純而且無任何聚集存在。而測定蛋白質(zhì)的分子 量和是否有聚集態(tài)存在，光散射法是最理想的工具之一。以往，在水相中用低角度光散射測量法 （LALLS ）受到溶劑中不純的物質(zhì)干擾相當(dāng) 大。而MALLS

18、的多角度測量大大降低了背景噪音的干擾，并能提供完整的信息和良 好的重現(xiàn)性結(jié)果。圖16顯示蛋白質(zhì)混合物的 MALLS和RI的信號。樣品在0.1M NaCI 中含0.05M的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行 RI為Wyatt Optilab 903,流速為0.1mL/min ,色譜柱 為Shodex KW-803和KW-804。雖然此樣品為標(biāo)準(zhǔn)樣品，但 MALLS仍很清楚地檢測 到聚集現(xiàn)象，此現(xiàn)象在RI幾乎無法辨認(rèn)。rBSA-2SBBSA-LSB1.0x101.0x101.0x101.0x101.0x1020.022.024.026.028.030.0Time (min)圖16蛋白質(zhì)洗脫體積及聚集體信號圖Mol

19、ar Mas s vs . Time3分枝高分子聚合物的分枝程度和分布是影響其物理和化學(xué)性質(zhì)的一個(gè)重要因素。采用 多角度激光光散射系統(tǒng)（MALLS ）與GPC/SEC系統(tǒng)聯(lián)用是唯一決定分枝系數(shù)gM的方 法。雖然也有其他確定分枝的方法，但都不能直接且需要眾多假設(shè)及“虛擬因子”。由傳統(tǒng)的RI或Viscometer （粘度檢測器）測定的高枝化分子的分子量與絕對值有很大的差別，若欲做有效的色譜柱校正，則需以一系列與待測物成分相同的標(biāo)準(zhǔn)品作 校正。若標(biāo)準(zhǔn)樣品與待測物的成分或組分不同，則會(huì)產(chǎn)生很大的誤差。例如分子量相 同的球形高分子的洗脫時(shí)間比無規(guī)則線團(tuán)狀分子要長。因?yàn)镸ALLS所求得分子量和大小為絕對值

20、，因此計(jì)算分枝系數(shù)gM不需要任何假設(shè)。由MALLS直接所求得的分子大小會(huì)直接影響分枝率。對分子量相同的長鏈狀分 子而言，其值越小，則分枝程度越大。分枝比的定義為分枝分子的旋轉(zhuǎn)半徑與長鏈分 子的旋轉(zhuǎn)半徑之比，即gM=<r2>b/<r2>i由MALLS測得。圖17為由MALLS測得的分枝狀和長鏈形的高分子（PS）的旋轉(zhuǎn)半徑和分子量對 照圖。由圖中可看出，雖然其分子量相同，但分布明顯不同。圖18為rg對MW做圖。圖17 PS線形與枝化分子的對照圖一亙3逼 SS* AhgiMl*0 谿 土 0 012+ A. gi TnsidiiSitEda £ o.a2/圖18旋轉(zhuǎn)

21、半徑對分子量圖（分子構(gòu)型圖），可以看出樣品（藻酸鈉）在輻射后分子構(gòu)型的變化。6.動(dòng)力學(xué)/反應(yīng)速率MALLS還可以用于如抗原，抗體等反應(yīng)迅速的溶液系統(tǒng)，粒子和蛋白質(zhì)聚集現(xiàn)象 的檢測。因?yàn)镸ALLS內(nèi)部同時(shí)裝有數(shù)個(gè)固定的檢測器，所以不需移動(dòng)任何儀器硬件 來掃描樣品，即可及時(shí)多方位同時(shí)捕捉反應(yīng)速率的現(xiàn)象。使用MALLS，可研究抗原-抗體反應(yīng)，反應(yīng)發(fā)生時(shí)就可決定聚集粒子的大小。當(dāng)改變溫度，濃度或催化劑時(shí)， MALLS可記錄下反應(yīng)發(fā)生時(shí)，分子的特殊變化。Protein Mass vs. Concentration0.20.40 60.8Concentration (mg/niL>圖19濃度變化對蛋

22、白聚集的影響使用DAWN僉測器研究了濃度對分子量為 75KD單分子蛋白質(zhì)聚集作用的影響。圖 19描述了這種特殊蛋白質(zhì)從30ug/ml到1mg/ml范圍內(nèi)得到的濃度相關(guān)性。如圖所示， 該蛋白質(zhì)在低濃度作為單一分子而在濃度大于700ug/ml時(shí)聚集為六聚體。該結(jié)果與由gluteraldehyde高度交聯(lián)技術(shù)所得結(jié)合完全相符。Jia1 .a«icirMo ar3- vs L 口 LimePAV1Volumc (mL)圖20溫度變化對PMMA分子量和大小的影響7低分子量的測定DAWN HELEOS或mini DAWN TREOS的固定光電二極管檢測器可以捕捉到很微 弱的光散射信號，使得分子量的測定成為可能。使用DAWN系列標(biāo)準(zhǔn)配制的任何一款 激光器，都可以輕易地測量分子量低于 2000D的聚合物，并具有相當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確性。