含親電基團(tuán)的熒光探針的合成及其在生物分析中的應(yīng)用

1、含親電基團(tuán)的熒光探針的合成及其在生物分析中的應(yīng)用大多數(shù)生物分子本身沒(méi)有熒光或熒光較弱,直接檢測(cè)靈敏度較低,為使之高靈敏的檢出,人們常用熒光染料或熒光探針與待測(cè)物進(jìn)行標(biāo)記或反應(yīng),生成具有強(qiáng)熒光的共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的物質(zhì),使檢出限大大降低。熒光探針技術(shù)在分析化學(xué),特別是生物分析中有較廣泛的應(yīng)用。利用熒光分析法對(duì)生物體系中蛋白質(zhì)、核酸、金屬離子及自由基的分析測(cè)定已引起人們的廣泛重視。生物體中的巰基化合物(包括半胱氨酸、高半胱氨酸和還原型谷胱甘肽等)在調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化還原動(dòng)態(tài)平衡上起了非常重要的作用。血液中巰基化合物的缺乏可引發(fā)多種疾病,例如：艾滋病、心臟病、阿爾茨海默氏癥和心血管疾病等。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(

2、Glutathione S-transferase, GST)作為相解毒代謝酶,其主要功能是催化某些內(nèi)源性或外來(lái)有害物質(zhì)的親電子基團(tuán)與還原型谷胱甘肽的巰基結(jié)合,增加其疏水性使其易于排出體外,從而達(dá)到解毒的目的。熒光分析法具有靈敏度高、選擇性好及可用于原位分析等優(yōu)點(diǎn)而在分子檢測(cè)中受到人們的廣泛關(guān)注。因此設(shè)計(jì)合成具有選擇性好、靈敏度高、可用于實(shí)時(shí)檢測(cè)巰基化合物和GST活性的熒光探針具有非常重要的意義。本文分別以香豆素、熒光素為母體設(shè)計(jì)合成對(duì)巰基化合物和GST具有有專(zhuān)一響應(yīng)的熒光探針。論文分五章,分別包括以下內(nèi)容：第一章緒論。主要介紹了含親電基團(tuán)的熒光探針檢測(cè)生物體系中毓基化合物及還原型谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)

3、移酶活性的研究進(jìn)展,并提出本論文的研究設(shè)想。第二章4-甲基傘形酮類(lèi)熒光探針檢測(cè)巰基化合物的應(yīng)用研究。本文設(shè)計(jì)合成了一種檢測(cè)巰基化合物的新型熒光探針1,該探針是由4-甲基傘形酮與2,4,6三硝基氯苯一步反應(yīng)完成。化合物1是一種無(wú)熒光的物質(zhì),在pH=7.4的水溶液反應(yīng)體系中,其與巰基分子發(fā)生親核取代反應(yīng),使化合物1中硝基苯環(huán)上的C-O鍵斷裂釋放出強(qiáng)熒光物質(zhì)4-甲基傘形酮,導(dǎo)致反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)?；谏鲜鲈?本章建立了一種檢測(cè)人血清中生物巰基的熒光分析法。第三章測(cè)定巰基化合物的熒光素類(lèi)熒光探針的研究。本文分別以2,4,6三硝基氯苯、2,4-二硝基氯苯和對(duì)硝基氯苯作為羥基的保護(hù)基團(tuán)合成了化合物

4、3、化合物4和化合物5三種弱熒光的物質(zhì)。在生理pH條件下,化合物3可與巰基分子發(fā)生親核取代反應(yīng),使化合物3中硝基苯環(huán)上的C-O鍵斷裂釋放出強(qiáng)熒光物質(zhì)熒光素,導(dǎo)致反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。與化合物3相比,化合物4與巰基分子發(fā)生親核取代反應(yīng)的活性顯著降低,而化合物5不能與巰基分子發(fā)生親核取代反應(yīng)。我們以化合物3作為檢測(cè)巰基化合物的熒光探針,其最大發(fā)射波長(zhǎng)513 nm(可見(jiàn)區(qū))?；谏鲜鲈?本章建立了一種測(cè)定生物巰基的熒光分析法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法選擇性好,靈敏度高。第四章一種檢測(cè)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶活性的熒光素類(lèi)熒光探針。文獻(xiàn)報(bào)道,還原型谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)可有效增強(qiáng)還原型谷胱甘肽(GSH)

5、的反應(yīng)活性。由于第三章所合成的化合物4與巰基分子發(fā)生親核取代反應(yīng)的活性較低,但在GST的催化下,GSH可有效進(jìn)攻化合物4中與硝基苯環(huán)相連的醚鍵的碳位,釋放出強(qiáng)熒光物質(zhì)熒光素,導(dǎo)致體系熒光強(qiáng)度增加。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下,GSH不能與化合物5發(fā)生親核取代反應(yīng)。因此我們以第三章合成的化合物4作為檢測(cè)GST活性的熒光探針,建立了一種測(cè)定谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶活性的新型熒光分析法。除了以上工作外,我們還開(kāi)發(fā)了一種檢測(cè)水溶液中鋅離子的熒光傳感器,具體內(nèi)容如下：第五章以香豆素為母體的Zn2+熒光傳感器的合成及應(yīng)用研究。本文以香豆素為母體設(shè)計(jì)合成一種檢測(cè)Zn2+的化學(xué)傳感器6?；衔?本身是一種弱熒光物質(zhì),在30%的

6、乙醇水溶液中,其與Zn2+形成1：1的配合物。由于Zn2+與化合物6之間的配合作用,束縛了化合物6分子中N原子上的孤對(duì)電子,從而抑制了化合物6中的光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移過(guò)程,導(dǎo)致反應(yīng)體系熒光信號(hào)增強(qiáng)?；谏鲜鲈?本章設(shè)計(jì)合成了一種測(cè)定水中Zn2+的熒光傳感器,該傳感器檢測(cè)Zn2+靈敏度高,選擇性好。同主題文章1.蘇美紅,聶麗華,馬會(huì)民. pH熒光探針的研究進(jìn)展 J. 分析科學(xué)學(xué)報(bào). 2005.(02)2.郁美娟,孟慶華,任吉存,張萬(wàn)斌,黃德音. 基于生命體系中氨基鍵合標(biāo)記的熒光探針研究進(jìn)展 J. 染料與染色. 2004.(03)3.曹秋娥,徐其亨. 有機(jī)熒光探針試劑的進(jìn)展 J. 云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科

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