大鼠局灶性腦缺血細(xì)胞因子介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞化學(xué)吸附劑的動(dòng)態(tài)觀察

1、    大鼠局灶性腦缺血細(xì)胞因子介導(dǎo)的中性 粒細(xì)胞化學(xué)吸附劑的動(dòng)態(tài)觀察        【摘要】目的：探索細(xì)胞因子介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞化學(xué)吸附劑（CINC）在腦缺血損傷中的作用。方法：用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型，觀察不同腦缺血時(shí)程血漿（sera）和腦組織內(nèi)CINC濃度與髓質(zhì)過(guò)氧化物酶（MPO）活性。結(jié)果：缺血組，血漿中CINC濃度的高峰在缺血6小時(shí)，腦組織內(nèi)CINC濃度和髓質(zhì)過(guò)氧化物酶（MPO）活性均呈低水平，其中CINC濃度高峰在缺血12小時(shí)，與對(duì)照組比較，差異均

2、有極顯著性意義（P<0.01）；血漿中MPO活性隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，缺血6小時(shí)以上各組與對(duì)照組比較差異均有極顯著性意義(P<0.01)；腦組織內(nèi)各組MPO活性差異無(wú)顯著性意義(P<0.05)。結(jié)論：缺血時(shí)，腦組織內(nèi)表達(dá)的CINC可能是啟動(dòng)缺血性腦損傷的因素之一?！娟P(guān)鍵詞】細(xì)胞因子介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞化學(xué)吸附劑 髓質(zhì)過(guò)氧化物酶局灶性腦缺血Dynamic investigation of cytokin-induced neutrophil chemoattractant in rats with focal cerebral ischemiaCao Xuebing,Huan

3、g Huaijun,Wang Fenxia.Department of Neurology.the Union Hospital of Tongji Medical University,Wuhan 430022【Abstract】Objective： To explore the effect of cytokin-induced neutrophil chemoattractant(CINC)in ischemic cerebral injury.Methods： In different time,the concentrations of CINC and the activities

4、 of myeloperioxidase(MPO)were observed in rats with focal cerebral ischemic model rats made by thread embolism method.Results： The peaks of the CINC concentrations in sera were in 6 hour and cerebral tissue in 12 hour after ischemia respectively,which were significantly higher than those of the cont

5、rol(P<0.01);The MPO activities of cerebral tissues in ischemic groups were no significant change(P>0.05),Following the ischemia,the MPO activities in sera elevated accordingly.the MPO activities after 6 hour ischemia were significantly higher than those of the control(P<0.01).Conclusion： Th

6、e CINC may be a trigger resulting in ischemic cerebral injury during the cerebral ischemia.【Key words】Cytokin-induced neutrophil chemoattractant(CINC)Myeloperioxidase Focal cerebral ischemia腦缺血造成的腦損傷是目前腦缺血研究的熱點(diǎn)之一，缺血灶中炎性細(xì)胞的出現(xiàn)被認(rèn)為是缺血性腦損傷的重要因素。中性粒細(xì)胞是體內(nèi)炎性反應(yīng)時(shí)白細(xì)胞浸潤(rùn)早期的主要細(xì)胞，而近年研究發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞化學(xué)吸附劑(CINC)是一種

7、特異性趨化中性粒細(xì)胞的細(xì)胞因子。本實(shí)驗(yàn)觀察了局灶性短時(shí)腦缺血時(shí)缺血側(cè)大腦中動(dòng)脈（MCA）供血、大腦前動(dòng)脈（ACA）供血區(qū)（即同側(cè)未缺血區(qū)）以及血漿（Sera）中CINC、髓質(zhì)過(guò)氧化物酶（MPO）含量變化，以探討CINC在腦缺血時(shí)的作用。1材料和方法健康雄性Sprague-Dawley（SD）大白鼠，由湖北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供。CINC測(cè)定試劑由日本國(guó)崗山大學(xué)免疫系李君武博士贈(zèng)送。1.1動(dòng)物模型：采用Zea Longa報(bào)道1的大白鼠局灶性腦缺血再灌注線栓模型。1.2動(dòng)物分組：將64只雄性SD大白鼠，體重225g250g，隨機(jī)分為對(duì)照組、缺血1、3、6、12、24、48、72小時(shí)（h）共8

8、組。每組動(dòng)物均為8只。其中每組6只大鼠用作免疫及生化檢測(cè)，其余則用于組織病理學(xué)觀察。1.3髓質(zhì)過(guò)氧化物酶（MPO）測(cè)定：缺血區(qū)MPO活性測(cè)定用Barone等2報(bào)道的方法。MPO活性用標(biāo)準(zhǔn)溶液計(jì)算。IU MPO定義為：25下每分鐘分解1mol過(guò)氧化物。1.4CINC水平測(cè)定：處死動(dòng)物前行心臟采血留取血標(biāo)本待檢：采血完畢立即斷頭取腦，MCA梗死區(qū)、ACA區(qū)腦組織按時(shí)間點(diǎn)切除；每組腦組織都先經(jīng)TTC染色以確定缺血區(qū)范圍。用5倍體積PBS（含0.5%小牛血清,0.05%Tween-20）用勻漿器(100mg 濕重/0.5ml)搗碎腦組織,勻漿液離心3000rpm×15min，4。收集上清于-

9、80保存待檢。按ELISA法測(cè)定標(biāo)本中CINC水平。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（±s）；采用非配對(duì)資料的t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.052結(jié)果2.1 各組缺血區(qū)腦組織內(nèi)和血漿中MPO活性都處于較低水平。缺血3h內(nèi)測(cè)不出MPO活性，缺血12h才開(kāi)始升高，高峰在缺血24h，高峰期后MPO活性逐漸下降。MCA、ACA區(qū)活性在缺血6h72h各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。血漿中MPO活性于缺血6h后逐漸升高，缺血72h達(dá)高峰。缺血6h以上各組MPO活性對(duì)照組比較，差異均有極顯著性意義（P<0.01）。見(jiàn)表1表1不同缺血時(shí)間MCA、ACA區(qū)和血漿MPO

10、活性變化缺血時(shí)間(小時(shí))MCA區(qū) (U/g)ACA區(qū) (U/g)SERA (U/ml)對(duì)照組00 0.01±0.0021 0 0 0.01±0.0023 00 0.01±0.0026 0.025±0.002 0.02±0.003 0.02±0.002*12 0.03±0.0020.025±0.0020.05±0.01*24 0.04±0.0050.030±0.0020.08±0.01*48 0.04±0.002 0.020±0.002 0.10±

11、0.005*72 0.03±0.003 0.020±0.0050.15±0.01*注：與對(duì)照組比較*P<0.012.2不同缺血時(shí)間,腦組織內(nèi)和血漿中的CINC濃度都處于較低水平。缺血側(cè)腦組織內(nèi)CINC開(kāi)始出現(xiàn)于缺血3h，高峰期位于缺血12h，以后逐漸下降，缺血72h時(shí)仍明顯高于對(duì)照組。缺血3h以上各組MCA和ACA區(qū)CINC濃度都高于對(duì)照組，差異分別都有極顯著性意義（P<0.01）,缺血12h24h組MCA區(qū)CINC濃度都高于同期ACA區(qū)CINC的濃度,差異也分別都有極顯著性意義(P<0.01)。血漿中CINC于缺血3h開(kāi)始升高，缺血6h達(dá)高峰，

12、以后逐漸下降并于缺血48h后恢復(fù)正常，而缺血72h已檢測(cè)不出。缺血3h以上各組血漿CINC濃度均高于缺血1h組，差異分別都有極顯著性意義（P<0.01）。見(jiàn)表2 表2不同缺血時(shí)間MCA、ACA區(qū)和血漿中CINC水平缺血時(shí)間(小時(shí))MCA區(qū)(U/g)ACA區(qū)(U/g)sera (ng/ml)對(duì)照組0.12±0.020.11±0.02010.15±0.030.14±0.040.06±0.0230.58±0.08*0.40±0.04*0.15±0.0561.10±0.22*0.80±0.15*0

13、.55±0.05124.97±0.63*¤ 3.66±0.41* 0.25±0.06243.50±0.40*¤2.08±0.54* 0.11±0.04482.11±0.60*1.20±0.58*0.06±0.03721.50±0.50*0.80±0.24* 0注：與對(duì)照組比較*P<0.01;與同期ACA比較¤P<0.01 與缺血1h比較P<0.01 3討論腦缺血引起的急性時(shí)相反應(yīng)包括炎性反應(yīng),如細(xì)胞因子的產(chǎn)生、發(fā)熱、補(bǔ)體激活、白

14、細(xì)胞聚集、急性時(shí)相蛋白合成、組織內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等。腦缺血及缺血再灌注早期向腦組織內(nèi)浸潤(rùn)的白細(xì)胞是以中性粒細(xì)胞為主，中性粒細(xì)胞向腦組織內(nèi)的浸潤(rùn)是受到多種細(xì)胞趨化物質(zhì)所引導(dǎo)的，如C5a,LTB4,PAF以及其它細(xì)胞因子等。鼠CINC趨化中性粒細(xì)胞的作用與人TL-8相同，被認(rèn)為是一種人類IL-8樣分子3。CINC能特異性地引導(dǎo)中性粒細(xì)胞向血管外移動(dòng)，但是鼠腦缺血時(shí)的炎性反應(yīng)中CINC濃度的動(dòng)態(tài)變化及其作用的報(bào)道甚少。在本研究中，MCA區(qū)的血供被線栓阻斷成為缺血區(qū)域，而其同側(cè)的ACA區(qū)并未缺血，可以作為同側(cè)未缺血區(qū)的代表。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦缺血既能引起缺血區(qū)CINC濃度升高也能誘導(dǎo)同側(cè)周邊未缺血區(qū)C

15、INC的產(chǎn)生而缺血對(duì)側(cè)腦組織不受影響。Karakurun等4報(bào)道,低氧或缺氧狀態(tài)可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞,單核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生CINC/IL-8,但其幅度不高而同時(shí)伴有IL-8 mRNA表達(dá)增加；我們推測(cè)較長(zhǎng)時(shí)間的缺血是啟動(dòng)細(xì)胞分泌CINC的因素之一，較長(zhǎng)時(shí)間的缺血也誘導(dǎo)了CINC的產(chǎn)生，但產(chǎn)生量很少。Wang報(bào)道5，缺血6h后缺血側(cè)腦內(nèi)細(xì)胞因子，如TNF-及IL-I產(chǎn)生增多。鼠CINC3最初是在IL-I和TNF-刺激NRK-52E細(xì)胞株時(shí)被發(fā)現(xiàn)的，兩者具有強(qiáng)烈的誘生CINC的能力。Liu6和Yamasaki等7報(bào)道腦內(nèi)在缺血早期即有CINC mRNA的表達(dá)。隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，這兩種因素的作用

16、逐漸減弱，致使CINC濃度衰減。外圍血中CINC的變化可能與氧濃度變化因素占主導(dǎo)作用有關(guān)。Abe等8報(bào)道在急性心肌梗死早期，血清中IL-8濃度呈短暫性升高，可作為心肌梗塞的早期預(yù)報(bào)指標(biāo)。本組資料中，外周血CINC濃度短暫升高的意義仍有待觀察。MPO是中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞所特有的細(xì)胞內(nèi)酶，而單核細(xì)胞內(nèi)此酶的活性較低，因此，以MPO活性反映組織內(nèi)中性粒細(xì)胞積聚并作為炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的定量指標(biāo)是很有價(jià)值的2。Matsuo等9認(rèn)為缺血1h提供了足夠的刺激誘導(dǎo)缺血腦區(qū)血管內(nèi)中性粒細(xì)胞聚積。本實(shí)驗(yàn)中，各組缺血區(qū)腦組織內(nèi)MPO活性都處于較低水平，間接表明腦缺血時(shí)中性粒細(xì)胞的出現(xiàn)得晚且數(shù)量可能也較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還

17、發(fā)現(xiàn)CINC與MPO的變化存在著一個(gè)時(shí)間差，提示CINC在腦缺血時(shí)可能起著中性粒細(xì)胞趨化劑的作用并與缺血性腦損傷有密切的關(guān)系。中性粒細(xì)胞在腦缺血病理變化中的作用包括10：阻塞微血管，釋放血管收縮介質(zhì)，增加血管通透性，釋放水解酶破壞腦實(shí)質(zhì)和活性氧的產(chǎn)生等。通過(guò)這一部分的研究，我們初步探討了局灶性腦缺血損傷時(shí)CINC的濃度變化以及作用。隨著對(duì)CINC的研究，我們認(rèn)識(shí)到在積極爭(zhēng)取血管再通的同時(shí)不應(yīng)忽略CINC引起的腦缺血損傷作用。作者單位：430022同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院98級(jí)博士生曹學(xué)兵孫圣剛湖北醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科黃懷鈞王風(fēng)霞參考文獻(xiàn)1Longa EZ,Weinstein PR,Ca

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