植物病害標(biāo)本采集與制作指導(dǎo)書

1、標(biāo)本米集與制作綜合實(shí)習(xí)（植物病害）指導(dǎo)教師：丁曉帆適用專業(yè)：植保植物病害標(biāo)本是對(duì)其癥狀的最直觀的記載和描述。它在教學(xué)中具有直觀、不受季節(jié)和區(qū)域限制的特點(diǎn)。因此，植物病害標(biāo)本的采集、制作和保存是植物病理學(xué)科實(shí)驗(yàn)（習(xí)）教學(xué)中必不可少的基礎(chǔ)知識(shí)和技能。在植物病害標(biāo)本的采集和制作過程中，應(yīng)對(duì)癥狀的變化情況給以特殊的注意。例如，癥狀可能表現(xiàn)為典型癥狀，也可能表現(xiàn)為非典型癥狀，在采集時(shí)，均應(yīng)加以注意。一種病害，在同一種植物上，可以同時(shí) 表現(xiàn)出多種不同類型的癥狀；在植物生長(zhǎng)發(fā)育的不同時(shí)期，也可以先后表現(xiàn)出多種不同類型的癥狀，如橡 膠白粉病。標(biāo)本采集后，除去需要及時(shí)分離和鑒定的標(biāo)本外，其余的一般都要經(jīng)過制作之

2、后保存起來，以備需要時(shí)進(jìn)行分離和鑒定；或者是在教學(xué)和研究時(shí)，供觀察和識(shí)別，要求是能盡量保持原來的性狀。一、目的要求學(xué)會(huì)采集植物病害標(biāo)本的基本方法。通過對(duì)常見的葉片和果穗等干標(biāo)本以及對(duì)柔嫩果實(shí)的浸漬標(biāo)本的制作，同時(shí)訓(xùn)練真菌玻片標(biāo)本的制作，學(xué)習(xí)并掌握標(biāo)本干燥制作、浸漬制作以及玻片標(biāo)本制作等基本方法。二、基本原理室外采集標(biāo)本是獲取植物病害標(biāo)本的重要途徑，也是熟悉植物病害的癥狀，了解植物病害發(fā)生情況的 最好方式。標(biāo)本的制作是為了日后能較為方便地觀察植物病害的癥狀，無論用干燥制作法保存標(biāo)本，還是 用浸漬制作法保存標(biāo)本，都是為了盡量減緩所保存標(biāo)本變質(zhì)的速度或不使其腐爛霉變。同時(shí)也是為了盡量 使標(biāo)本保持其原

3、色，以延長(zhǎng)標(biāo)本的使用時(shí)間和提高標(biāo)本的保存質(zhì)量。真菌玻片標(biāo)本的制作是為了直觀地觀 察病原物、輔助診斷、鑒定病害種類，并通過永久玻片標(biāo)本的制作為后續(xù)教學(xué)工作提供基本素材。三、采集和制作標(biāo)本用具1 采集標(biāo)本的用具 采集夾、采集袋、標(biāo)本夾、標(biāo)本紙、標(biāo)本箱（筒）、剪刀、修枝剪、高枝剪、手鋸、手鏟、紙袋、標(biāo)簽、手持放大鏡及采集記錄本、海拔儀、刀片、載玻片、蓋玻片、小木板、挑針、鑷子、滴瓶、各種試劑等。（1）采集夾。在野外臨時(shí)收存新采標(biāo)本的輕便夾子。一般由兩個(gè)對(duì)稱的用一些木條按適當(dāng)?shù)拈g距平行排列的柵狀板（亦有用膠合板或硬紙板組成的 ），其上附有背帶，在接近四個(gè)角落的地方，設(shè)有長(zhǎng)短可以調(diào)整 的活動(dòng)固定帶或彈簧

4、，以適應(yīng)采集過程中標(biāo)本逐漸增多的需要。（2）采集箱。用于臨時(shí)收存新采集的果實(shí)等柔軟多汁的標(biāo)本。是由鐵皮制成的扁圓箱，內(nèi)側(cè)較平，外側(cè) 較鼓，箱門設(shè)在外側(cè)，箱上設(shè)有背帶。（3）標(biāo)本夾。是用來翻曬、壓制標(biāo)本的木夾。由兩個(gè)對(duì)稱的一些平行排列的柵狀板組成。每塊柵狀板在接近上下端處釘一根厚實(shí)的方木條，木條端部向外突出約5cm長(zhǎng)，以便于用繩捆綁標(biāo)本夾。標(biāo)本夾上：應(yīng)附有約6m長(zhǎng)的一條繩子。（4）標(biāo)本紙。主要用來吸收標(biāo)本的水分，使標(biāo)本逐漸干燥。一般用草紙或麻紙作標(biāo)本紙，它們的吸水性較好。舊報(bào)紙也可代替，但因其上有油墨吸水性較差。（5）修枝剪。主要用于剪取較硬或韌性較強(qiáng)的枝條，高處的枝條要使用高枝剪，難于折斷的枝

5、干則要借助于手鋸。手鏟用來挖掘地下患病植物器官（如根、塊根、塊莖等）。2 制作植物標(biāo)本用具及試劑 剪刀、標(biāo)簽、標(biāo)本瓶、玻璃瓶、玻璃板、塑料繩、標(biāo)本盒、水浴鍋（或簡(jiǎn)單的加熱裝置）、水、硫酸酮、亞硫酸、甲醛溶液、明膠、石蠟等。四、實(shí)驗(yàn)操作（一）室外采集1 .病葉用剪刀剪取病植物上的發(fā)病葉片。如小麥（玉米、美人蕉等）銹病的病葉、水稻稻瘟病的病 葉、玉米葉斑?。ù蟆⑿“卟。┑牟∪~、大豆（瓜類）霜霉病的病葉、馬鈴薯晚疫病的病葉、丁香（九里 香）白粉病的病葉及香蕉黑星病的病葉等，裝入采集夾中。盡量剪取整個(gè)病葉，同時(shí)，對(duì)于每一片葉上的 病斑，在顏色、大小以及形狀方面都應(yīng)是較為一致的。2病穗用剪刀剪取水稻稻曲

6、病的病穗、玉米絲黑穗病的病穗及玉米瘤黑粉病的病穗等，裝入采集筒 中。對(duì)于黑粉類的病穗，每種病穗要及時(shí)放入小的采集袋中，同時(shí)注意隔離，以防黑粉散落和不同病穗間 相互混雜。3 病果用剪刀剪取茄子褐紋病的病果、番茄（柑橘）潰瘍病的病果、辣椒炭疽病的病果以及香蕉黑星?。ㄌ烤也。┑牟」?，裝入采集筒中。對(duì)于此類標(biāo)本，特別是對(duì)于像番茄一類多汁的病果，要特別加 以注意，應(yīng)先以標(biāo)本紙分別包裹后，置于采集筒（箱）中，以防相互擠壓而變形。4 .病根用鐵鏟挖取植物根結(jié)線蟲病的病根以及白菜根腫病的病根等，裝入采集筒中。在挖取此類病 害的標(biāo)本時(shí)，要注意挖取點(diǎn)的范圍要比較大一些，以保證取得整個(gè)根部。同時(shí)，對(duì)于像根結(jié)線蟲病

7、害一類 的病根，在除去根須上的泥土?xí)r，操作要謹(jǐn)慎，保證其根須上的小根結(jié)和卵塊不散落。一般情況下，各種病害的標(biāo)本最好采集10份以上。對(duì)于較薄的較易失水的葉片，如小麥和水稻的葉片，在采集時(shí)應(yīng)隨時(shí)攜帶吸水紙或廢舊的書，隨采隨壓，以免葉片迅速打卷而不易展開。提示：在采集病斑類的葉片標(biāo)本時(shí)，一個(gè)葉片上應(yīng)只有一種類型的病斑。尤其是在各種病害混合發(fā)生 時(shí)采集標(biāo)本，更需進(jìn)行仔細(xì)的選擇；對(duì)于真菌病害，標(biāo)本應(yīng)帶有子實(shí)體，無子實(shí)體在回到室內(nèi)后，鑒定將 非常困難。（二）采集記錄采集時(shí)，要隨時(shí)作標(biāo)記。臨時(shí)標(biāo)簽上一般應(yīng)記錄如下項(xiàng)目：寄主名稱：俗名和學(xué)名都有時(shí)，應(yīng)同時(shí)記下。采集時(shí)間：一般應(yīng)記錄年、月、日。采集地點(diǎn)：一般記錄

8、到省、市 （縣）即可，需要時(shí)也可記錄到鎮(zhèn) （鄉(xiāng)）等。采集人：姓名。海拔高度：按海拔儀指示記錄。（可不記）生態(tài)環(huán)境：按照山坡地、平坦地、沼澤地；砂質(zhì)土、肥沃土等記錄。采集序號(hào)：一般按照采集時(shí)間的先后順序記錄。提示：寄主名稱如有不清楚的，能及時(shí)向當(dāng)?shù)厝藛柮鞲?；如不能，?yīng)記下采集地的位置以及寄主的 一些主要性狀，以備鑒定時(shí)參考。必要時(shí)還應(yīng)將寄主的花、果實(shí)以及其他部位標(biāo)本一起采得，以便憑借寄 主的標(biāo)本對(duì)該寄主進(jìn)行分類鑒定。（三）標(biāo)本的攜帶田間采集后，莖或葉片類的標(biāo)本裝入采集袋中，每一種病葉放入一個(gè)小袋內(nèi)之后，最好再放入一個(gè)大 一點(diǎn)的采集袋內(nèi)；對(duì)于根或果實(shí)類的標(biāo)本，各種標(biāo)本在裝入采集筒之前應(yīng)分別用小采

9、集袋裝好密封或用紙 包裹好，然后，再裝入采集筒中。對(duì)于黑粉類的標(biāo)本（如玉米絲黑穗的病穗），或腐爛類的標(biāo)本（如茄子褐紋病病果）等，要特別注意，標(biāo)本間不要相互接觸沾污，否則，對(duì)于病原的鑒定和病害的診斷會(huì)有影響。（四）標(biāo)本的整理在完成田間采集的過程之后，首先要在室內(nèi)進(jìn)行標(biāo)本的取舍和初步的整理。對(duì)于同一種病害的標(biāo)本， 應(yīng)盡量保留帶有典型癥狀的標(biāo)本。同時(shí)，對(duì)于真菌性病害，在發(fā)病部位應(yīng)帶有子實(shí)體，葉片或果實(shí)要保持 完整。在整理時(shí)，應(yīng)使其形狀盡量恢復(fù)自然狀態(tài)。對(duì)于采集到的比較稀少的標(biāo)本，如癥狀不典型，或暫時(shí) 觀察不到子實(shí)體，也不要舍棄。應(yīng)該同樣制作成標(biāo)本，以備日后采取措施進(jìn)行鑒定。如果外出采集，每天 晚上都

10、要將當(dāng)天采集的標(biāo)本進(jìn)行整理、壓制，第二天及時(shí)換紙或晾曬，防止霉變。（五）干燥標(biāo)本的制作1 含水量小的標(biāo)本的壓制 對(duì)于像水稻和小麥等植物，其葉片比較薄，它們的葉片病害標(biāo)本，需要經(jīng) 過整理后，立即進(jìn)行壓制。對(duì)于此類標(biāo)本，在壓制時(shí)，標(biāo)本間的標(biāo)本紙最好要多放幾層，一般每層至少用35張標(biāo)本紙，以利于標(biāo)本中水分的快速散失。2 含水量大的標(biāo)本的壓制 對(duì)于像甘藍(lán)、大白菜、馬鈴薯等比較厚、不易失水的葉片，最好經(jīng)過一段 時(shí)間（12d）的自然散失水分，然后，再進(jìn)行壓制。自然散失水分的時(shí)間不宜過長(zhǎng)。在具體操作時(shí)，最好是 在葉片將要卷曲但還未卷曲時(shí)進(jìn)行，這與具體植物和環(huán)境條件有關(guān)。3 附臨時(shí)標(biāo)簽 在壓制時(shí)，每份標(biāo)本都要

11、附上臨時(shí)標(biāo)簽，即將臨時(shí)標(biāo)簽隨著標(biāo)本壓在吸水紙之間。臨 時(shí)標(biāo)簽上的項(xiàng)目不必記載過多，一般只需記錄寄主名稱和順序號(hào)即可，以防標(biāo)本間相互混雜。寫臨時(shí)標(biāo)簽 時(shí)，應(yīng)使用 鉛筆記錄，以防受潮后字跡模糊，影響識(shí)別。4 標(biāo)本整理 在第1次換紙前，要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行形狀的整理，盡量使其舒展自然。在整理時(shí)，要十分小 心。特別對(duì)于比較柔嫩的植物標(biāo)本，更應(yīng)多加注意，以免破損。5 換紙 一般情況下，前一周的時(shí)間里要每天換干燥的吸水紙1次。以后的時(shí)間，可隔天換紙，視情況而定，直至標(biāo)本完全干燥為止 (在正常的晴好的天氣條件下，一般經(jīng)過10d左右的時(shí)間即完全干燥)。在換紙時(shí)，注意不要遺失臨時(shí)標(biāo)簽；要特別注意不要混用已經(jīng)污染了的紙張

12、；對(duì)于完全干燥的標(biāo)本，要特別小心移動(dòng)，以防破碎。6 果穗及較粗大莖的標(biāo)本的干燥對(duì)于這類標(biāo)本應(yīng)置于朝陽 (但應(yīng)避免強(qiáng)光直射)通風(fēng)處，置于吸水紙上，進(jìn)行自然干燥。同時(shí)，也要定期進(jìn)行翻動(dòng)，使其整體較為均勻地干燥。對(duì)于此類標(biāo)本的干燥，開始時(shí)， 就要選擇在比較寬敞的空間內(nèi)進(jìn)行，以免其整個(gè)形狀被擠壓而發(fā)生變形。7裝袋保存 用重磅道林紙(也可用牛皮紙，對(duì)于不用作交流的標(biāo)本，也可報(bào)紙代替)，折成紙袋如下圖，紙袋的大小可據(jù)標(biāo)本的大小而定，其折疊方式也可據(jù)標(biāo)本的不同形狀而做適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)。在裝袋時(shí)，要 隨時(shí)貼上正式標(biāo)簽。(六) 浸漬標(biāo)本的制作此法制作的標(biāo)本易保持標(biāo)本原來的形態(tài)和色澤，但保存的時(shí)間有限，且需占用比較大的

13、空間。一般用 于制作教學(xué)和示范標(biāo)本。1 .常用的浸漬液(1) 防腐漂白浸漬液。此種浸漬液是由亞硫酸飽和溶液、酒精和水按照一定比例配制而成。亞硫酸飽和 溶液，即指二氧化硫的飽和水溶液。(2) 保存綠色的浸漬液。常用的有如下幾種：醋酸銅浸漬液。反復(fù)用多次后保色能力會(huì)逐漸減弱，需定期補(bǔ)加適量的醋酸銅。硫酸銅亞硫酸浸漬液。用于保存綠色植物組織的效果很好，但應(yīng)注意密封容 器，必要時(shí)每年換1次亞硫酸浸漬液。此種方法也是實(shí)驗(yàn)室較為常用的液浸標(biāo)本的保存方法。瓦查(Vacha)浸漬液。由亞硫酸、硫酸銅、酒精、乙酰水楊酸、福爾馬林、丁香油和水等成分按比例配制而成。適于保 存葉片和果實(shí)的綠色，也可保存梨和蘋果等的黃

14、色。(3) 保存黃色和橘紅色標(biāo)本的浸漬液。配制方法是將亞硫酸(含二氧化硫5%6 % )配成4%10%的水 溶液(二氧化硫0 2%0. 5% )。可保存如杏、梨、柿、黃蘋果、柑橘和紅辣椒等標(biāo)本。(4) 保存紅色的浸漬液。瓦查(Vacha)保存紅色的浸漬液。此種浸漬液分兩部分：浸漬液 1的主要成分為硝酸亞鈷、福爾馬林、氯化錫等；浸漬液2的主要成分為福爾馬林、亞硫酸、酒精等。將標(biāo)本洗凈后，在浸漬液1中浸兩周，然后在浸漬液2中保存?？捎糜诒４娌葺?、辣椒、馬鈴薯以及其他紅色的植物組織， 是一種效果比較好的浸漬液。2 浸漬標(biāo)本的保存 浸漬標(biāo)本一般保存在標(biāo)本瓶、玻璃瓶或試管中。浸漬標(biāo)本最好置于暗處，以減緩

15、藥液的氧化，或防止氣溫過高時(shí)瓶口碎裂。瓶口一般需要密封，臨時(shí)性封口時(shí)，可用蜂蠟、松香和凡士林 配成的混劑封口；永久性封口時(shí)，可用酪膠和消石灰配成的混劑封口；也可用明膠、重鉻酸鉀和熟石膏調(diào) 制而成的混劑進(jìn)行永久性的封口。(1)配制硫酸銅溶液。 根據(jù)需要，一般配制 1000m1 5%的硫酸銅水溶液，在適當(dāng)?shù)牟Ａ萜髦?。配制溶液前，要考慮到所浸標(biāo)本的大小，保證所浸標(biāo)本全部位于液面下。預(yù)浸病果。從室外采來新鮮的辣椒炭疽病的病果，在盛有5%的硫酸銅溶液的玻璃瓶中浸24h。浸病果時(shí)，需臨時(shí)將病果用塑料繩縛在玻璃板上，一起放入溶液中。否則，病果易浮在液面上，特別是對(duì)于 像辣椒這樣的空心的果實(shí)，更易漂浮在液面

16、上。（3）漂洗病果。從5%的硫酸銅溶液中取出病果，用清水漂洗6h?？晒潭ㄔ谒\頭下，打開水閥用流水進(jìn)行沖洗。在沖洗時(shí)，水流不宜太急，否則，易破損標(biāo)本，或?qū)⒆訉?shí)體沖刷掉。配制亞硫酸溶液。在標(biāo)本瓶中將含5%-6%二氧化硫的亞硫酸溶液15ml加水1 000ml（也可用如下方法配制，即將濃硫酸 20m1，稀釋在1000ml水中然后加亞硫酸鈉 16g）。提示：配制溶液時(shí)，要記住，將濃硫酸沿瓶壁緩緩倒入水中，切不可將水倒入濃硫酸中，以防發(fā)生事 故。（5）固定病果。將沖洗后的病果用塑料繩將其縛在玻璃板上，一起浸入配制好的亞硫酸溶液中。固定時(shí),要小心操作，盡量不要損壞標(biāo)本，保持其完整。（6）封口。先配制封口劑

17、，具體方法是：取明膠 200g，石蠟50g（此兩試劑的量可據(jù)需要量而定，一般 按照明膠：石蠟=4 : 1取量）。將明膠置于玻璃瓶中，用水浸 6h,濾去水分。之后，在水浴鍋中加熱熔化； 再加入石蠟，熔化后即可成為膠狀物，趁熱進(jìn)行涂抹封口。提示：封口劑配制好后，要趁熱及時(shí)涂抹封口。否則影響封閉效果。（七）貼標(biāo)簽無論是裝干標(biāo)本的紙袋，還是裝液浸標(biāo)本的玻璃瓶，都需在其適當(dāng)位置貼上正式標(biāo)簽（標(biāo)簽?zāi)０嬗芍?導(dǎo)老師提供）。對(duì)于紙袋，應(yīng)貼在其右上角的位置；對(duì)于玻璃瓶，應(yīng)貼在瓶體的中央位置。標(biāo)簽的大小和 位置，應(yīng)根據(jù)具體的紙袋的大小和玻璃瓶的大小而定。同時(shí)，要兼顧標(biāo)本袋或標(biāo)本瓶的整體協(xié)調(diào)性和美觀 性。（八）真菌

18、永久玻片標(biāo)本的制作固定劑：70%酒精、福爾馬林、冰醋酸、FAA固定液、納瓦興氏固定液、鉻酸、醋酸固定液等。染色劑：天然染色劑：蘇木素、胭脂紅、地衣紅，在真菌染色中主要用蘇木素。人工染料：番紅 O,固綠、結(jié)晶紫苯胺藍(lán)（棉藍(lán)）、酸性品紅等脫水劑：酒精、丁醇、甘油透明齊U: 二甲苯、氯仿、甲苯、香精油等粘貼劑：蛋白一一甘油粘貼劑、明膠粘貼劑、火棉膠粘貼劑等。 浮載劑：水、乳酚油、希爾液、甘油、乳酸、3%氫氧化鉀等封藏劑：乳酚油、希爾液 一甘油、甘油、甘油明膠、聚乙烯醇膠。封固劑：中性樹膠、達(dá)瑪樹膠等。方法1 :甘油明膠法希爾液（沙氏液：Shear）配方:醋酸鉀（2%）水溶液300毫升甘油120毫升酒

19、精甘油明膠配方：明膠 5克甘油180毫升35毫升水30毫升制成的甘油明膠，每100毫升可加苯酚1克，有的不加苯酚。明膠在水中浸透，加熱至35C熔化,加甘油和苯酚攪和，紗布過濾后盛在玻璃瓶中。方法2 :聚乙烯醇（PVA）法：封藏劑和封固劑配方一：聚乙烯醇粉末 2g 丙酮7ml甘油5ml孚L酸5ml水20ml配方二：聚乙烯醇粉末 3g，水20ml （水浴補(bǔ)足水）溶化一一母液，加等量乳酸及按母液1/10加甘油,攪勻即成。染液用苯胺藍(lán)或酸黃1g溶于100ml孚L酸。（九）真菌臨時(shí)玻片的制作臨時(shí)玻片制作方法很多，如涂、撕、粘、挑和切片等，可以根據(jù)病原物的類型選擇使用。1 ）涂抹法：細(xì)菌和酵母菌的培養(yǎng)物常

20、用涂抹法制片。將細(xì)菌或酵母菌的懸浮液均勻地涂在潔凈的載 玻片上，在酒精燈火焰上烘干、固定，再加蓋玻片封固。加蓋玻片前還可進(jìn)行染色處理，使菌體或鞭毛著 色而易于觀察。2 ）撕取法：用小金屬鑷子仔細(xì)撕下病部表皮或表皮毛制成臨時(shí)玻片。3）粘貼法：將塑料膠帶紙剪成邊長(zhǎng) 5mm左右的小塊（注意膠帶上不要印有指?。?，使膠面朝下貼在 病部，輕按一下后揭下制成玻片。4 ）挑取法：用挑針從病組織或基物（如培養(yǎng)基）上挑取表面的霉?fàn)钗?、粉狀物或孢子團(tuán)制成玻片。5）組織透明法： 將少量病組織材料切成細(xì)絲后放在載玻片上，滴加乳酚油后在酒精燈上徐徐加熱至 蒸氣出現(xiàn)。如此處理數(shù)次使組織透明，冷卻后加蓋玻片進(jìn)行鏡檢。此法可以

21、觀察到病原物在寄主內(nèi)的原有 狀態(tài)。6）徒手切片：徒手切片時(shí)選取病狀典型、病征明顯的病組織材料，先在病征明顯處切取病組織小塊（邊長(zhǎng)5-8mm），放在小木塊上，用食指輕輕壓住，隨著手指慢慢地后退，用刀片的刀尖將壓住的病組 織小塊切成很薄的絲或片，用沾有浮載劑的挑針或接種針挑取薄而合適的材料放在一干凈載玻片上的浮載 劑液滴中央，蓋上蓋玻片，仔細(xì)擦去多余的浮載劑（注意浮載劑過多會(huì)使觀察物出現(xiàn)晃動(dòng)不穩(wěn)定現(xiàn)象）， 即制成一張臨時(shí)玻片。浮載劑：水：溢菌、線蟲活動(dòng)、真菌孢子萌發(fā)、大小測(cè)量。優(yōu)點(diǎn)：方便；缺點(diǎn)：產(chǎn)生氣泡；易干燥。孚L酚油：除上述外均可用。優(yōu)點(diǎn)：殺菌固定、孢子膨脹復(fù)原、組織透明；缺點(diǎn)：不易封固、有毒

22、。（十）線蟲永久玻片的制作永久玻片標(biāo)本的制作方法比較復(fù)雜，所經(jīng)過的步驟較多，時(shí)間較長(zhǎng)。但是保存的時(shí)間也比較長(zhǎng)，可使 線蟲長(zhǎng)時(shí)間保持原有狀態(tài)，是線蟲標(biāo)本的重要保存方式。主要包括幾個(gè)步驟：殺死-固定-脫水-玻片制作,其中制備方法和試劑選擇不同，所制玻片中線蟲的蟲態(tài)和內(nèi)臟清晰度不同。1試劑TAF固定液（三乙醇胺-福爾馬林固定液）福爾馬林（40%甲醛）7ml三乙醇胺（Triethanolamin）2ml蒸餾水91mlFG固定液（福爾馬林-冰醋酸）福爾馬林（40%甲醛）8ml甘油（丙三醇）2ml蒸餾水90ml2脫水液甲溶液：福爾馬林（40%甲醛）8ml甘油（丙三醇）蒸餾水2ml乙溶液：酒精（95 %）甘

23、油（丙三醇）90ml95ml5ml乳酸配制45%的乳酸。2. 線蟲的殺死與固定 （1-1）常溫殺死與固定先將線蟲離心（2000r/min離心3min），用移液器吸出上清液，吸出的上清液要在體視顯微鏡下觀察， 確保沒有線蟲被吸出，每管裝1ml的線蟲濃縮液，然后加入等量的FG固定液或TAF固定液。常溫下放置24h。（1-2）加熱殺死與固定 將裝有線蟲的指型管放在離心機(jī)里，以2000r/min離心3min ； 用移液器吸出上清液，每管裝1ml的線蟲濃縮液； 將TAF或FG固定液分裝在10ml指型管中，與線蟲濃縮液同時(shí)放在65C的恒溫水浴鍋中加熱 150s，加熱過程中不斷搖晃指型管，使線蟲液和固定液受

24、熱均勻； 將等量的固定液分別與線蟲懸液混勻，注意動(dòng)作要輕，常溫下放置24h。3. 脫水（甘油酒精脫水法）參考武楊和劉斌的方法 6并做適當(dāng)修改。 將固定 24h的線蟲放在離心機(jī)上 2000r/min，離心3min ; 在體視顯微鏡下，用移液器小心將上清液吸出（注意不要將線蟲移出）； 將剩余的線蟲懸液用移液器移至經(jīng)過消毒的染色皿中，并將染色皿傾斜放置，保證線蟲都聚集在一起； 用移液器將甲溶液慢慢加入染色皿中，至染色皿的2/3處，染色皿傾斜放置，使線蟲盡量聚集在甲溶液的底部； 在塑料盒或者干燥器中加入95%酒精，至容器的1/3處。將染色皿蓋上蓋子并保持原來狀態(tài)斜放在塑料盒或者干燥器的隔板上； 將塑料

25、盒蓋上蓋子并慢慢放進(jìn)恒溫箱中，保持恒溫箱的溫度在35 C -43 C,過夜。注意：在線蟲放入恒溫箱時(shí)將乙溶液一并置于恒溫箱中，防止操作過程中溫差變化過大； 將過夜的染色皿移出并保持原來傾斜狀態(tài)，在體視顯微鏡下將甲溶液吸出，再慢慢加入乙溶液。蓋上蓋子并留點(diǎn)縫隙，傾斜放入加有純甘油的密封塑料盒或者干燥器中，41C下，放置5h； 將放置5h的染色皿取出，吸出乙溶液，向染色皿中加入幾滴純甘油，蓋上染色皿的蓋子，將染色皿置于加有純甘油的密封塑料盒中，41 C過夜； 將過夜的染色皿的蓋子拿掉，并放回加有純甘油的密封塑料盒中，41 C下放置5h后，線蟲標(biāo)本即可用于制作永久玻片；本方法采用濃度梯度脫水法，將線

26、蟲逐級(jí)轉(zhuǎn)入濃度更高的甘油中，最后轉(zhuǎn)移至純甘油中，保證了在整 個(gè)制片過程中蟲體所處環(huán)境的連續(xù)性，避免了蟲體的變形和觀察效果的失真。本實(shí)驗(yàn)過程中染色皿一直處 于傾斜狀態(tài)是為了將線蟲聚集在皿低，盡量減少吸出溶液時(shí)將線蟲吸出。更換脫水液或者甘油時(shí)都要在體 視顯微鏡下觀察線蟲是否因?yàn)槊撍^快而變的干癟，若發(fā)生這種情況可重復(fù)前一步的脫水環(huán)節(jié)，這樣可使 發(fā)生皺縮的線蟲標(biāo)本在一定程度上得以恢復(fù)。4. 永久玻片的制作參考JF Southey的方法7并做適當(dāng)修改。（1 ）準(zhǔn)備直徑1.5cm、長(zhǎng)10cm的T型打孔器，低熔點(diǎn)的石蠟（熔點(diǎn) 54C）；（2）把打孔器端部在酒精燈火焰上加熱約10s,盡量使端部受熱均勻，趁熱迅速將打孔器端部插到蠟盤中蘸取少許石蠟；（3 ）將熔化的蠟盡快粘附在潔凈的載玻片中央。如果第一次蘸取的石蠟太少，可以按上述步驟重復(fù)2到3次5。待蠟圈凝固后即可使用；（4）用挑針蘸取一小滴純甘油放在蠟圈中央；（5）在體視顯微鏡用挑針將數(shù)條已脫水的線蟲挑至載玻片中央的浮載劑中，將載玻片置于體視顯微 鏡下觀察，用挑針小心地將線蟲排勻，并使線蟲沉于浮載劑底部；（6 ）取干凈的蓋玻片，在體視顯微鏡下，輕輕蓋上蓋玻片，使蓋玻片置于蠟圈正上方；（7）待磁