第十一章 免疫熒光技術(shù)

1、第十一章 免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique）一、 基本原理 免疫熒光技術(shù)是血清抗體以化學(xué)方法與熒光素結(jié)合后，仍保留其免疫特性，當(dāng)帶有熒光素的抗體與抗原結(jié)合后，則在抗原的部位有熒光抗體的沉著，在熒光顯微鏡下觀察就可以看到發(fā)亮的熒光。熒光素可以用來(lái)標(biāo)記抗體，也可以用來(lái)標(biāo)記抗原，但由于抗原結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的多樣性，標(biāo)記條件不易控制，所以多用熒光素標(biāo)記抗體，通常稱為熒光抗體技術(shù)。熒光抗體技術(shù)是一種快速、敏感的診斷方法，可以檢查抗原也可以檢查抗體，同時(shí)還可以對(duì)抗原抗體進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)的定位。目前我國(guó)利用熒光抗體診斷的家畜傳染病有豬瘟、炭疽、鼻疽、馬傳染性貧血病、布氏桿

2、菌病、傳染性胃腸炎、鉤端螺旋體病等。二、 熒光抗體的制備 （一）免疫球蛋白的提取 參看有關(guān)章節(jié)。（二） 熒光素1 熒光色素的基本條件（1） 具有化學(xué)活性基團(tuán)，如異硫氰基（-NCS）等，易與免疫球蛋白結(jié)合形成共價(jià)鍵。（2） 對(duì)免疫球蛋白無(wú)毒性，不影響抗體活性。（3） 熒光效應(yīng)高，與蛋白結(jié)合需要量少。（4） 熒光素性能穩(wěn)定，結(jié)合物性能穩(wěn)定，容易貯藏。（5） 結(jié)合物的顏色必須與背景組織有良好的反襯作用，易于觀察判定。 到目前為止，基本符合上述要求的熒光素只有異硫氰酸熒光素（FITC），麗絲胺羅丹明B200（RB200）。2常用的熒光色素（1）異硫氰酸熒光素 ：又稱異硫氰酸熒光黃，純品為橙黃色粉末。分

3、有結(jié)晶型與粉末型兩種,結(jié)晶型熒光強(qiáng)度大、穩(wěn)定、優(yōu)于粉末型。分子式C21H11O2N5、分子量389，溶于水，易溶于pH8-9.5碳酸鹽緩沖液中。最大吸收波長(zhǎng)為495nm。最大發(fā)射波長(zhǎng)520nm。異硫氰酸熒光黃性質(zhì)穩(wěn)定，于低溫下可保存二年以上，但久置標(biāo)記抗體能力弱，熒光亮度差，故應(yīng)采用新產(chǎn)品。異硫氰酸熒光素借助異硫氰基與蛋白中氨基酸（主要是賴氨酸）的氨基結(jié)合。一個(gè)IgG分子有86個(gè)氨基酸殘基，一般最多能標(biāo)記1620個(gè)熒光素分子。（2）麗絲胺羅丹明：為褐色粉末，不溶于水、易溶于酒精和丙酮。熒光為桔紅色。性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。分子式C23H29O7NaS2，分子量為580，最大吸收波長(zhǎng)570nm，最

4、大發(fā)射波長(zhǎng)為600nm。由于麗絲胺羅丹明熒光效能較低，一般不單獨(dú)使用，多用于與FITC標(biāo)記抗體的反襯染色或雙標(biāo)記配合使用。此染料不能直接與蛋白質(zhì)結(jié)合，必須先用五氯化磷（PCl5）處理，使染料的-SO3Na基變?yōu)?SO3Cl基后，才能在堿性條件下與賴氨酸的氨基結(jié)合，形成穩(wěn)定的硫氨鍵。（三） 標(biāo)記方法異硫氰酸熒光素常用的標(biāo)記法有以下兩種：1 攪拌法（1）取一定量的純IgG液，用0.5Mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋至20mg/ml。（2）按熒光素與蛋白質(zhì)比1201100（一般用1100）稱取異硫氰酸熒光素，用pH9.5碳酸鹽緩沖液溶解。（3）將球蛋白液置于電磁攪拌器上，啟動(dòng)開(kāi)關(guān)，輕輕攪拌，以

5、不起沫為準(zhǔn)。逐滴加入熒光素液（約10min15min加完）。加完后，隨時(shí)用試紙測(cè)定攪拌液的pH值，若低于9.0，則應(yīng)以碳酸鈉溶液調(diào)整。置4攪拌6h12h即可。2 透析法（1）將IgG液以0.5Mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋成1%濃度，裝入透析袋中。（2）將熒光素配成0.1mg/ml，其量為1%蛋白液的10倍，裝入燒杯中。（3）將透析袋置于燒杯中，放電磁攪拌器上4攪拌24即可。透析法的優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記均勻，非特異性熒光少，但所標(biāo)記的時(shí)間長(zhǎng)，熒光素的用量多，約比攪拌法多10倍。3影響標(biāo)記的因素（1）熒光素與蛋白質(zhì)的比值：這也取決于熒光素的質(zhì)量與保存期。一般而言，粉末狀熒光素以0.025mg/mg

6、0.05mg/mg蛋白質(zhì)為宜，而結(jié)晶型則只需0.006mg/mg0.008mg/mg蛋白質(zhì)即可。蛋白含量以20mg25mg/ml為宜，濃度過(guò)低標(biāo)記過(guò)慢。濃度過(guò)高，標(biāo)記效果不好。不過(guò)在實(shí)踐中，以稍高一些蛋白濃度為好。（2）pH值：以pH9.09.5為最好。過(guò)低標(biāo)記速度慢，過(guò)高蛋白質(zhì)容易變性。（3）溫度和時(shí)間：溫度425均可。溫度與時(shí)間是成正比的，溫度低，反應(yīng)慢，溫度高，反應(yīng)快。4需要6h12h，79需要3h4h，2025只需要1h2h。實(shí)踐中可自選。透析法還是以4較長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)為好。（4）熒光素的質(zhì)量及有效期。（四）標(biāo)記抗體的純化標(biāo)記后溶液是一個(gè)混合體，它包括蛋白質(zhì)與熒光素的結(jié)合體，還有游離的熒光

7、素、游離的蛋白質(zhì)以及結(jié)合過(guò)多的蛋白質(zhì)。對(duì)于某些細(xì)菌性的診斷熒光抗體，則只要去除游離的熒光素即可。對(duì)于一般組織染色熒光抗體，則要去除過(guò)度標(biāo)記的抗體即可。只是對(duì)某些特殊要求的組織染色試劑，則必須經(jīng)過(guò)仔細(xì)的處理，包括具有特異性交叉反應(yīng)或非特異性反應(yīng)性的除去。1 去除游離的熒光素（1）透析法：將標(biāo)記好的抗體放入透析袋中于0.01Mol/L pH7.6 PBS中或生理鹽水中4透析數(shù)天，每天換液數(shù)次，直至透析液中無(wú)游離色素為止。通常約需57天才能透析完畢。（2）凝膠過(guò)濾：以G25或G50葡聚糖凝膠裝柱進(jìn)行過(guò)濾。次法速度快，一般1h2 h即可完成。也可以先透析4h5h，讓大部分游離熒光素除去，再過(guò)G25或G

8、50柱。2 去除過(guò)度標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子 可采用DEAE纖維素過(guò)柱法。利用階梯洗脫法進(jìn)行，具體方法如下：（1）以0.01Mol/L pH 7.6 PB液洗脫。（2）以0.01 Mol/L pH 7.6 PBS液（0.05Mol/L NaCl）洗脫。（3）以0.01 Mol/L pH7.6 PBS（0.1Mol/L NaCl）洗脫。（4）以0.01 Mol/L PH 7.6PBS（0.2Mol/L NaCl）洗脫。收集每部分有熒光抗體的洗脫液管，于495nm測(cè)熒光素的OD值，再于280nm測(cè)蛋白的OD值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出各管熒光素和蛋白質(zhì)的濃度，并計(jì)算出F/P比值（見(jiàn)后介紹），將合格者合并，濃縮后分

9、裝小瓶備用。層析柱上滯留的過(guò)度標(biāo)記的蛋白質(zhì)，可用1 Mol/L 的NaCl洗脫。3去除交叉反應(yīng)等非特異性染色因素 非特異性染色的干擾因素，包括免疫血清的不純、類屬抗原以及熒光色素的質(zhì)量不高、標(biāo)本處理不當(dāng)?shù)??？梢砸耘K粉進(jìn)行吸收。具體做法如下：于每ml標(biāo)記抗體中加入臟器干粉（臟粉制法見(jiàn)附錄）100mg，充分混合，于室溫中振蕩約1 h，然后以10 000 r/min離心30min，吸取標(biāo)記抗體。必要時(shí)可減半臟粉用量再處理一次。經(jīng)過(guò)臟粉吸收后的熒光抗體必須加0.1%疊氮鈉防腐（注意不能加硫柳汞，因?yàn)橹亟饘賹?duì)熒光素有影響）。分裝小瓶冷凍保存。（五）標(biāo)記抗體的鑒定1F/P比值鑒定 熒光色素與球蛋白的結(jié)合率

10、即為F/P比值。分別制備熒光色素與蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。g/ml、0.5g/ml.、0.75g/ml、1.0g/ml、2.0g/ml10.0 g/ml的濃度，在495nm波長(zhǎng)測(cè)其OD值，按重量與OD值在坐標(biāo)上制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線是將牛血清蛋白分別配成0.1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.4 mg/ml1.6mg/ml，在280nm測(cè)其OD值，并繪制成曲線。按以下公式計(jì)算F/P比值： 16 104 FITCg/ml FITCg/mlF/P（克分子比值）= =0.41 390 抗體mg/ml 抗體mg/ml 式中16104為抗體蛋白質(zhì)的分子量，390為異硫氰酸熒光素分子量。F/P克分子比

11、值以12為合適，13.5為合格。比值過(guò)低敏感性差，比值過(guò)高，易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。用于檢查組織細(xì)胞抗原成分，F(xiàn)/P以12為好；用于檢查細(xì)菌涂片時(shí)，F(xiàn)/P以23為好。2 免疫電泳測(cè)定 通過(guò)免疫電泳可以測(cè)定熒光抗體的免疫純度。要求在球蛋白的部位上只出現(xiàn)一條沉淀線。3染色性能的鑒定 包括測(cè)定熒光抗體的敏感性與特異性。（1）熒光抗體效價(jià)的測(cè)定：將熒光抗體倍比稀釋，然后用已知抗原制片，分別用各稀釋度去染色，觀察“+”熒光強(qiáng)度的最大稀釋倍數(shù)即為該熒光抗體的染色滴度（或單位）。實(shí)際應(yīng)用時(shí)則取2個(gè)或3個(gè)單位做應(yīng)用的稀釋度。（2）熒光抗體的特異性試驗(yàn)：為了確保熒光抗體的特異性，必須預(yù)先進(jìn)行下列試驗(yàn)。陽(yáng)性標(biāo)本染色試

12、驗(yàn)：即用所制熒光抗體去染色已知的相應(yīng)的抗原，結(jié)果應(yīng)是陽(yáng)性；陰性標(biāo)本染色試驗(yàn)：即用所制熒光抗體去染色已知的非相應(yīng)抗原，結(jié)果應(yīng)是陰性；類屬性抗原染色試驗(yàn)：取與已知抗原相近的類屬抗原（如炭疽桿菌與枯草桿菌或類炭疽桿菌等），用熒光抗體染色，應(yīng)為陰性，說(shuō)明特異性強(qiáng)，如不同程度地出現(xiàn)有熒光，說(shuō)明具有類屬反應(yīng)，特異性不強(qiáng)等；抗體吸收試驗(yàn)：以過(guò)量的相應(yīng)抗原加入熒光抗體中，感作2h4h，4過(guò)夜，離心取上清再對(duì)相應(yīng)抗原染色，應(yīng)無(wú)熒光或熒光顯著消退；染色阻抑試驗(yàn)：用未標(biāo)記的抗體對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行染色，沖洗后，再用熒光抗體對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行染色，結(jié)果觀察，應(yīng)無(wú)熒光。阻抑試驗(yàn)應(yīng)注意抗體與抗原的相應(yīng)比例，未標(biāo)記抗體的比例過(guò)小，結(jié)

13、果抗原結(jié)合有剩余，標(biāo)記抗體仍能被結(jié)合而顯示出阻抑不全。當(dāng)抗體比例過(guò)大，則抗體的一個(gè)結(jié)合點(diǎn)結(jié)合而表現(xiàn)出不牢固，極易被標(biāo)記抗體所置換出來(lái)而又顯示出阻抑不全。三、 染色方法（一）制片 選無(wú)自發(fā)性熒光的石英玻片或普通優(yōu)質(zhì)玻片，洗凈后浸泡于無(wú)水乙醇和乙醚等量混合液中。用時(shí)取出用綢布擦凈。將待檢樣品如組織塊剪成適當(dāng)大小印壓于玻片上。也可采用冰凍切片或石蠟切片樣品。（二）固定 除研究細(xì)胞表面抗原或不穩(wěn)定抗原可不固定外，一般均應(yīng)固定。固定的作用有三：防止標(biāo)本從玻片上脫落；除去防礙抗原抗體結(jié)合的類脂，使抗原抗體結(jié)合物易于獲得良好的染色結(jié)果；固定的標(biāo)本易于保存，如組織切片固定后在-20下可保存一年而不改變其染色特

14、性。標(biāo)本的固定原則是：不能損傷細(xì)胞內(nèi)的抗原；不能凝集蛋白質(zhì)；不能損傷細(xì)胞形態(tài)；固定后應(yīng)保持細(xì)胞膜的通透性，以允許抗體進(jìn)入與抗原結(jié)合。表 11-1 常用抗原物質(zhì)的固定方法抗原物質(zhì) 固定劑固定條件（min） 蛋白質(zhì)抗原95%100%乙醇室溫310酶、激素丙 酮4 30免疫球蛋白四氯化碳病 毒丙酮、四氯化碳、無(wú)水乙醇室溫510或4 3060 多糖、細(xì)菌等 微火加熱，甲醇、10%甲醛、丙酮室溫510或4 3060類 脂 （異嗜性抗原） 10%甲醛，10%佛茂爾（ForMol）室溫310（三）水洗固定后以冷的0.01Mol/L pH7.4PBS液浸泡沖洗，最后以蒸餾水沖洗，防止自發(fā)性熒光。（四）染色染色

15、分直接染色法與間接染色法。1 材料與試劑（1）熒光抗體，稀釋至應(yīng)用濃度。（2）0.01Mol/L pH7.4PBS液（3）9份優(yōu)質(zhì)甘油加1份pH7.4PBS液即為甘油緩沖液。甘油有減少非特異性熒光的作用。（4）帶蓋方盤(pán)2直接染色法（1）將固定好的玻片置于濕盤(pán)中，滴加熒光抗體染色液，以覆蓋為度，加蓋，37感做30 min45min。（2）PBS沖洗3次，每次沖洗3min，即33沖洗。（3）蒸餾水沖洗。（4）滴甘油緩沖液一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。2 間接染色法（1） 檢查抗原：取固定標(biāo)本，加已知的免疫血清，37孵育30min；以PBS液33沖洗；再加熒光標(biāo)記的抗抗體，37孵育30min；PBS

16、33沖洗；H2O沖洗，涼干；加甘油緩沖液，封片、鏡檢。（2） 檢查抗體：以免疫后動(dòng)物的淋巴組織涂片，自然干燥，甲醇固定；滴加相應(yīng)抗原液（按11001500稀釋），37孵育30min；PBS液33沖洗；加熒光抗體，37孵育30min；PBS液33沖洗；水洗，涼干；加甘油緩沖液，封片、鏡檢。四、結(jié)果顯示與標(biāo)本保存（一）結(jié)果顯示熒光顯微鏡所觀察到的圖象，主要以兩個(gè)指標(biāo)判斷結(jié)果，一個(gè)是形態(tài)學(xué)特征；另一個(gè)是熒光的亮度，在結(jié)果的判定中，必須將二者結(jié)合起來(lái)，綜合判定。熒光強(qiáng)度的表示方法如下： ：熒光閃亮，呈明顯的亮綠色。 ：熒光明亮，呈黃綠色。 ：熒光較弱，但清楚可見(jiàn)。 ：極弱的可疑熒光。 ：無(wú)熒光。（二）

17、標(biāo)本保存由于熒光色素和蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性都是相對(duì)的，因此隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，在各種條件影響下，標(biāo)記蛋白可能變性解離，失去其應(yīng)有的亮度和特異性。因此給標(biāo)本的保存帶來(lái)一定的困難，所以在標(biāo)本進(jìn)行熒光染色之后應(yīng)立即觀察。保存的方法可采取以下幾種：固定標(biāo)本片以后低溫保存，隨用隨染；染色片采取優(yōu)質(zhì)封固劑，如特別的熒光封固劑（Fluormount）或堿性優(yōu)質(zhì)純甘油固劑等封固。這些封固劑能防止熒光激發(fā)，封固后低溫保存；可以采用拍照保存照片。四、熒光偏振免疫分析法近些年來(lái)，隨著一系列新儀器的研制成功和新方法的建立，免疫熒光技術(shù)也有很大的改進(jìn)和發(fā)展。主要有熒光偏振分析技術(shù)、熒光激活細(xì)胞分類技術(shù)、利用稀土元素鑭系銪

18、（Eu3+）做為標(biāo)記物建立的時(shí)間分辨熒光技術(shù)以及均相熒光檢測(cè)技術(shù)等。這里僅介紹熒光偏振免疫分析法的原理。 該方法是利用熒光素經(jīng)單一波長(zhǎng)（藍(lán)光）的偏振光照射后，能吸收光能并發(fā)射出相應(yīng)的偏振熒光，其強(qiáng)弱程度與熒光分子的大小呈正相關(guān)。熒光偏振免疫分析常用于測(cè)定半抗原的藥物濃度。反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)除待測(cè)藥物外，同時(shí)加入一定量用熒光素標(biāo)記的相應(yīng)藥物（小分子），使二者與有限量的特異性抗體（大分子）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。當(dāng)待測(cè)藥物濃度高時(shí)，經(jīng)過(guò)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，大部分抗體被其結(jié)合，而熒光素標(biāo)記的藥物多呈游離的小分子狀態(tài)。由于其分子小，在液相中轉(zhuǎn)動(dòng)速度較快，測(cè)量到的熒光偏振程度也較低。反之，如果藥物濃度低時(shí)，大部分熒光素標(biāo)記藥物與抗體結(jié)

19、合，形成大分子的抗原抗體復(fù)合物，此時(shí)檢測(cè)到的熒光偏振程度也較高。根據(jù)熒光偏振程度與藥物濃度呈反比關(guān)系，我們可以建立座標(biāo)系。通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)系中偏振光的大小，從坐標(biāo)曲線上就可以精確地得知樣品中待測(cè)藥物的相應(yīng)含量。五、間接免疫熒光診斷牛流行熱（一）材料與試劑1病毒株 牛流行熱（BEF）北京毒株。2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)牛流行熱的小公犢牛、健康雄性家兔。3被檢血清。（二）操作方法 1特異性陽(yáng)性血清的制備 以BEF強(qiáng)毒脫纖血給小公犢牛靜脈接種10ml，出現(xiàn)典型癥狀后兩周，以同樣劑量做第二次接種，以后每隔一周接種一次，共56次，劑量分別為15ml、20ml、25ml、35ml，末次接種后2周采血清樣品測(cè)效價(jià)，效價(jià)達(dá)1

20、128以上時(shí)即可放血收集血清，-20保存。3 熒光抗體的制備與鑒定（1）健康牛血清IgG的提取 取牛血清以30%飽和（NH4）2SO4提取3次，然后以少量PBS溶解沉淀，4透析18h，過(guò)G25柱，以0.005Mol/L pH7.2PBS液洗脫，收集洗脫液，再透析18h，以0.01Mol/L pH7.2PBS平衡4h，離心去沉淀，過(guò)DEAE纖維素柱，收集IgG，測(cè)其蛋白含量和純度。（2）兔抗牛血清IgG高免血清的制備 取健康家兔數(shù)只，免疫前一周分別于足掌部接種卡介苗1ml（含2mg）兩側(cè)各接種0.5ml。牛IgG加弗氏完全佐劑乳化后，分四點(diǎn)（兩前肢掌部及后肢股內(nèi)側(cè)皮下）各注射0.5ml，每只兔為

21、2ml，共注射6次，每次間隔1周，第5次與第6次間隔2周。6次含IgG及卡介苗的量分別為3.4mg、4.0mg、5.2mg、7.6mg、11mg、22mg和6.6mg、5.0mg、8.0mg、7.6mg、8.8mg、10mg。瓊擴(kuò)法測(cè)血清抗體效價(jià)1641128為合格。（3）兔抗牛IgG高免血清IgG的制備 同提純健康牛血清IgG法。（4）熒光抗體的標(biāo)記及鑒定 按兔抗牛血清IgG量的1/50稱取異硫氰酸熒光黃，將熒光素溶于IgG溶液總量的1/10體積的0.5Mol/L pH9.6碳酸緩沖液中，再緩慢滴加在磁力攪拌器下的IgG溶液中，于1820攪拌3h，然后將熒光抗體結(jié)合物立即通過(guò)葡聚糖凝膠G25

22、柱，以0.005Mol/L pH7.2PBS洗脫，收集第一峰，求出F/P比值，以F/P值為2左右（各批平均比值）合格。將熒光抗體分裝于安瓶中、封口、并置 -40保存。3抗原標(biāo)本片的制備 將BEF病毒接種于BHK21細(xì)胞，當(dāng)CPE達(dá)70%90%以上時(shí)，將細(xì)胞刮取下來(lái)，以1 000r/min離心5min，去上清，加入滅菌鹽水，再離心5min，以沉淀的染毒細(xì)胞作抗原標(biāo)本涂片，自然干燥后，丙酮（室溫）固定10min，PBS液洗一次，再用去離子水洗一次，吹干，即可染色，不染色的抗原標(biāo)本置4保存。以同樣方法把未接毒的細(xì)胞制成抗原對(duì)照標(biāo)本片。4染色方法 取制備的抗原標(biāo)本片及對(duì)照標(biāo)本片，將經(jīng)生理鹽水作10倍稀釋的特異性陽(yáng)性血清、陰性血清分別滴加在抗原標(biāo)本和對(duì)照標(biāo)本上，置濕盒37溫