維生素E對(duì)噪聲所致耳蝸毛細(xì)胞表達(dá)NF-κB的調(diào)節(jié)

1、維生素E對(duì)噪聲所致耳蝸毛細(xì)胞表達(dá)NF-B的調(diào)節(jié)         【摘要】  目的 探討維生素E在噪聲暴露引起的大白鼠聽力損傷有明顯的保護(hù)作用及機(jī)制。方法 以聽閾、耳蝸基底膜鋪片及免疫熒光染色為指標(biāo)，觀察大白鼠在穩(wěn)態(tài)噪聲持續(xù)暴露之前30天至暴露后7天，灌維生素E或生理鹽水，對(duì)大白鼠聽覺腦干電位分析和耳蝸外毛細(xì)胞（OHC）丟失率分析及NF-B在耳蝸毛細(xì)胞中表達(dá)定量分析。結(jié)果 維生素E在噪聲暴露后大白鼠聽力閾值明顯低于單純?cè)肼暯M，OHC丟失率也明顯降低，免疫熒光染色結(jié)果顯示VitE干預(yù)組的耳蝸細(xì)胞表達(dá)NF-B的

2、強(qiáng)度低于單純?cè)肼暯M（P0.05）。結(jié)論 維生素E在噪聲暴露引起的大白鼠聽力損傷有明顯的保護(hù)作用，通過(guò)上調(diào)耳蝸毛細(xì)胞中NF-B的表達(dá)。 【關(guān)鍵詞】  噪聲； 耳蝸; 毛細(xì)胞；維生素E；NF-B   【Abstract】  Objective  To discuss the protection and mechanism of vitamin E in the rats hearing impairment induced by noise exposure.Methods  Take the audibility threshold、

3、basilar membrane stretched preparation and immunofluorescence stain as the index, observing that the rats were put in the stationary noise before 30days until after that for 7days, have vitamin E and sodium chloride , check the auditory brain stem potential and the lost rate and NF-B of the OHC in t

4、he cochlea hair cells expression quantitative analysis.Results  After the noise exposure, the rats which have vitamin E have significant lower auditory acuity threshold than the purely noise exposure, and much lower lost rate of OHC.Immunofluorescence stain demonstrate that the group have vitam

5、in E have lower intensity of NF-B expression in the cochlea hair cells, （P0.05）.Conclusion  Vitamin E has obvious protection in the hearing impairment of rats, working out by up-regulation of NF-B expression in the cochlea hair cells.   【Key words】  noise; cochlea; hair cell; vit

6、amin E; NF-B   噪聲可產(chǎn)生可恢復(fù)的暫時(shí)性閾移（TTS）或不可恢復(fù)的永久性閾移（PTS），甚至造成噪聲性耳聾。對(duì)噪聲性聽力損傷機(jī)制迄今尚無(wú)明確報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在大白鼠噪聲暴露前30天至暴露后7天灌胃維生素E，對(duì)其防止TTS轉(zhuǎn)變?yōu)镻TS及促進(jìn)聽力恢復(fù)有無(wú)保護(hù)作用進(jìn)行探討。分析維生素E干預(yù)噪聲聽覺損傷與耳蝸毛細(xì)胞中NF-B表達(dá)的關(guān)系，確定VitE減少噪聲引起的毛細(xì)胞死亡的分子機(jī)制。1  材料與方法   1.1  動(dòng)物分組與處理  選擇鼓膜正常, 聽覺腦干電位儀測(cè)4000Hz頻率雙耳聽閾在2328dB的健康雄性Wistar

7、大白鼠36只，體質(zhì)量180200g（購(gòu)自高新開發(fā)區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，清潔級(jí)）；隨機(jī)分為3組；正常組12只（24耳），維生素E組12只（24耳），單純暴露組12只（24 耳）。維生素E組在暴露前30天至暴露后7天連續(xù)灌胃4mg/（kg·d）。單純暴露組在暴露前30天至暴露后7天連續(xù)灌胃生理鹽水5ml/（kg·d）。 噪聲暴露：連續(xù)用藥30天后即行噪音暴露，將動(dòng)物置于小籠內(nèi)（40cm×30cm×30cm ），每籠2只，放入暴露艙（0.5m×1.5m×0.5m），用UZ-3型噪聲發(fā)生器發(fā)生， A-K200功率放大器放大，有位于暴露艙四周的揚(yáng)聲器

8、向暴露艙播放。暴露時(shí)用聲壓計(jì)進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)，噪音保持在頻率為4000Hz，平均聲強(qiáng)為116dB SPL（sound pressure level）。動(dòng)物暴露范圍內(nèi)聲揚(yáng)不均勻度為±2dB。持續(xù)暴露6h。   1.2  聽閾測(cè)試  測(cè)試在隔音屏蔽室內(nèi)進(jìn)行，10%水合氯醛（330mg/kg）腹腔注射，麻醉生效后安插針式電極，記錄電極的安裝是用不銹鋼針刺入前顱頂正中穿透皮膚至顱骨骨膜，置于冠狀縫中點(diǎn)處，同時(shí)給聲耳及對(duì)側(cè)耳后皮下分別刺入不銹鋼針，作為參考電極和接地電極。TDH-39型耳機(jī)給聲，聲源距耳廓1cm，誘發(fā)電位用信號(hào)處理機(jī)疊加處理，進(jìn)行測(cè)試：刺激聲

9、為交替短聲（clicks），重復(fù)率10次/s。實(shí)驗(yàn)選用主要參數(shù)為：帶道濾波為32Hz3kHz，掃描時(shí)間為10ms，疊加為512次。測(cè)試聲強(qiáng)由110dB SPL開始，接近閾值后按5dB SPL漸檔遞減，電生理反射由針式電極引出，經(jīng)放大及處理后以波形的方式顯示于熒光屏，閾值是以肉眼剛能辨認(rèn)的腦干電位波群中以波的聲強(qiáng)表示。   1.3  耳蝸基底膜鋪片  三組動(dòng)物完成最后一次聽閾測(cè)試后（噪聲暴露停止后第7天）處死動(dòng)物立即取出顳骨,打開聽泡,4%甲醛固定24h,10%EDTA脫鈣1周,分離出基底膜, 三組動(dòng)物隨機(jī)抽出各6只（12耳）,在常規(guī)蘇木素染色,在放大40

10、0倍的光學(xué)顯微鏡下，以目鏡中0.24mm顯微測(cè)微尺為測(cè)量尺度，逐個(gè)視野從蝸底向蝸?lái)斶M(jìn)行OHC記數(shù)。以O(shè)HC境界模糊或消失、細(xì)胞碎裂或缺失為OHC死亡標(biāo)志。鉤部和蝸尖各有4個(gè)視野不做記數(shù)。所得數(shù)據(jù)分析OHC損失分布情況。   1.4  免疫熒光染色  三組動(dòng)物基底膜各6只（12耳），用0.1mol/L PBS洗滌3次，每次5min，加入0.1% Triton X-100處理15min，5%羊血清封閉1h，加入一抗（NF-B 工作濃度1：100），室溫孵育1h，用0.1mol/L PBS洗滌3次，每次15min，加入，Alexa Fluor555 Goat

11、anti-rabbitIgG（工作濃度1：400），室溫、避光放置1h，0.1mol/L PBS洗滌3次，每次15min，輕輕搖動(dòng)。棄掉洗滌液，最后樣品均再用1g/ml的Hoechst 33342室溫染色5min，甘油封片。用Fluoview FV 1000激光掃描共聚焦顯微鏡觀察（PMT電壓值為650，CA針孔值為160）。NF-B陽(yáng)性表達(dá)為紅色熒光，細(xì)胞核為藍(lán)色熒光。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，用PBS代替第一抗體，排除非特異性的二抗結(jié)合。2  結(jié)果   2.1  ABR閾值  暴露組在噪聲暴露前和噪聲暴露結(jié)束后不同時(shí)間的聽閾閾值見表1；結(jié)果表明,單純

12、暴露組和補(bǔ)VitE均有明顯聽力損失,表現(xiàn)為聽閾上移（P0.01）,按完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多個(gè)樣本均數(shù)比較的方差分析表明,噪聲暴露結(jié)束后1h、1天、2天、3天、7天, 單純暴露組和補(bǔ)VitE相比，除噪聲暴露后1h相差不顯著外（P0.05），差異均有顯著性（P0.05）,表1為兩組動(dòng)物在噪音暴露后閾值的恢復(fù)變化,可見噪聲暴露后1h相差不顯著外補(bǔ)VitE組ABR閾值恢復(fù)明顯高于單純暴露組。見圖1。 表1  ABR閾值dB SPL注：相同時(shí)間與單純?cè)肼暯M比較，*P0.01   2.2  耳蝸基底膜鋪片毛細(xì)胞變化  耳蝸基底膜鋪片蘇木素胞核染色顯色結(jié)果：正常組耳

13、蝸HC形態(tài)正常，其3排OHC和內(nèi)毛細(xì)胞（IHC）排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)缺失。補(bǔ)VitE在噪聲暴露第7天OHC有散在缺失，且以第三排為主，單純暴露組出現(xiàn)細(xì)胞境界模糊或消失，且在3排OHC中以第三排OHC損傷為重，缺失明顯，第二排、第一排均有不同程度的缺失，IHC也有丟失。對(duì)耳蝸基底膜鋪片進(jìn)行全長(zhǎng)OHC記數(shù)，繪制耳蝸圖，觀察其OHC損失分布情況，補(bǔ)VitE組OHC缺失率明顯低于單純暴露組（P0.05）。見圖2、圖3。   2.3  耳蝸毛細(xì)胞NF-B的表達(dá)  單純?cè)肼暯M、VitE干預(yù)組以及正常組在暴露后7天處死動(dòng)物，分離耳蝸基底膜，進(jìn)行NF-B表達(dá)定量分析。

14、結(jié)果見表2，圖4。VitE干預(yù)組的耳蝸毛細(xì)胞表達(dá)NF-B的強(qiáng)度低于單純?cè)肼暯M。圖1  各組ABR閾值的比較（dB SPL）表2  維生素E對(duì)噪聲暴露后耳蝸毛細(xì)胞中NF-B表達(dá)的影響注：與單純?cè)肼暯M比較，*P0.01   3  討論   噪音對(duì)聽覺的損傷是一個(gè)復(fù)雜的多因素的機(jī)制，各種因素又相互關(guān)聯(lián)，相互影響。目前傾向于將噪聲對(duì)聽覺的損傷歸納為機(jī)械性、血管性和代謝性三個(gè)方面。超高強(qiáng)度130dB NHL以上的噪聲對(duì)HC的損傷主要以機(jī)械損傷為主，中高強(qiáng)度110130dB NHL噪聲暴露以血管性和代謝性損傷為主。已經(jīng)證實(shí)，強(qiáng)噪聲刺激作

15、用下耳蝸血管可發(fā)生一系列改變：血管痙攣收縮或擴(kuò)張，血流速度變慢，局部血液灌注量減少；內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、通透性增加，血液濃縮粘滯度顯著增高，血小板和紅細(xì)胞聚集、血栓形成15；這些變化導(dǎo)致微循環(huán)障礙，耳蝸血流下降,內(nèi)耳供血不足,內(nèi)外淋巴液氧張力下降6，7。血管改變引起的局部缺血缺氧，造成了耳蝸內(nèi)環(huán)境的代謝紊亂，HC代謝障礙，酶系統(tǒng)的功能障礙，從而細(xì)胞出現(xiàn)包括Corti器形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷和聲電轉(zhuǎn)換的功能障礙等一系列病理生理改變。持續(xù)的噪聲一方面使耳蝸血管收縮、微循環(huán)受損，局部缺血缺氧；另一方面導(dǎo)致耳蝸HC的ATP需要量、耗氧量以及耗葡萄糖量增加，出現(xiàn)局部相對(duì)缺血，自由基的增加及細(xì)胞內(nèi)鈣離子的超載，引起細(xì)胞

16、結(jié)構(gòu)、靜纖毛、DNA及蛋白質(zhì)的異常，導(dǎo)致細(xì)胞壞死及凋亡；強(qiáng)噪聲尚可引起HC及支持細(xì)胞酶系統(tǒng)的嚴(yán)重紊亂，造成氧和能量代謝障礙。最近研究表明8，噪聲引起代謝性損傷首先對(duì)兩個(gè)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，一是可影響靜纖毛結(jié)構(gòu)，從而造成耳蝸微機(jī)械結(jié)構(gòu)的改變，二是使IHC過(guò)量釋放神經(jīng)介質(zhì)，從而影響神經(jīng)傳導(dǎo)。有研究表明，噪聲暴露可破壞耳蝸的抗氧化體系，導(dǎo)致氧化和抗氧化失衡，從而在耳蝸產(chǎn)生大量活性氧自由基。過(guò)量的氧自由基可以攻擊生物膜，使膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化（LPO），誘發(fā)LPO的大量產(chǎn)生，影響細(xì)胞內(nèi)的重要生化反應(yīng)，對(duì)耳蝸組織產(chǎn)生損傷。VitE通過(guò)自身被氧化成生育醌，從而將ROO-轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)性質(zhì)不活潑的ROOH，中斷脂類過(guò)氧化

17、的連鎖反應(yīng)，有效抑制脂類過(guò)氧化作用，保護(hù)細(xì)胞免受不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)生的毒性物質(zhì)的傷害，在防止衰老、抗腫瘤等方面起著重要的作用。VitE本身具有產(chǎn)生酚氧基的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生的酚氧基能夠猝滅并能同單線態(tài)氧反應(yīng)，保護(hù)不飽和脂肪酸免受單線態(tài)氧損傷。還可以被陰離子自由基和羥自由基氧化，使不飽和脂肪酸免受自由基攻擊，從而抑制脂肪酸的自動(dòng)氧化。VitE不僅對(duì)生物膜的結(jié)構(gòu)和功能有較好的保護(hù)作用9，還能迅速捕捉自由基，生成的生育酚自由基又可進(jìn)一步與另一個(gè)分子自由基反應(yīng)生成非自由基生育醌，故抗氧化能力較強(qiáng)10。          

18、  NF-B是一類具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子，存在于多種組織的多種細(xì)胞中，具有廣泛的生物學(xué)活性激活后參與許多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在感染、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增生等過(guò)程中發(fā)揮作用。近年的研究表明NF-B與細(xì)胞凋亡的關(guān)系密切，其參與多種凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。多種細(xì)胞外刺激信號(hào)可激活NF-B，如細(xì)胞因子IL-1，TNF-及活性氧自由基等11，12，席愷等采用豚鼠耳蝸缺血-再灌注損傷模型，觀察耳蝸組織形態(tài)功能變化與NF-B、TNF-表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺血組及缺血再灌注各組的NF-B在耳蝸各轉(zhuǎn)SV、IHC、OHC和SGC各部位表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增

19、強(qiáng)，再灌注24 h組達(dá)高峰。而TNF-表達(dá)水平與NF-B表達(dá)一致。認(rèn)為耳蝸缺血過(guò)程中大量產(chǎn)生的活性氧刺激，NF-B被激活，誘導(dǎo)TNF-分泌增加，而缺血再灌注各組TNF-水平加強(qiáng)，反過(guò)來(lái)會(huì)進(jìn)一步激活NF-B，形成惡性循環(huán)，加重缺血損傷的程度13。Fujioka 等采用RT-PCR方法分析噪聲暴露后大鼠耳蝸組織細(xì)胞因子表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)噪聲暴露后早期TNF-、IL-1和IL-6表達(dá)急劇增加14。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，噪聲暴露后7天的耳蝸毛細(xì)胞中表達(dá)NF-B的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于正常耳蝸。我們推測(cè)噪聲引起TNF-增高，TNF-與其特異性跨膜受體TNFR結(jié)合后，在胞質(zhì)中形成腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（TRADD）受體，作用蛋白（RIP）腫瘤壞死