白毛茛中生物堿的提取和高效液相色譜分析

1、白毛茛中生物堿的提取和高效液相色譜分析上一篇 / 下一篇  2008-06-19 12:48:48 查看( 97 ) / 評(píng)論( 1 ) / 評(píng)分( 0 / 0 ) 出于新藥開發(fā)的目的，制藥企業(yè)對(duì)天然產(chǎn)物產(chǎn)生了很大興趣。白毛茛是美洲本土的一種草本藥用植物，由美國印第安人傳入歐洲，它的名稱來源于該植物金黃色的根。據(jù)稱白毛茛有抗炎、抗生等生理活性，吸引了人們的關(guān)注。生物堿是白毛茛的活性成分，主要包括黃連素和黃連堿。非洲防已堿是一種與黃連素聯(lián)系密切的生物堿。白毛茛不含有該生物堿，但是人們?cè)谥兴廃S連中發(fā)現(xiàn)了它的存在。天然產(chǎn)物的管理部門和廠家面臨的主要任務(wù)就是如何評(píng)價(jià)草藥中活性成分的安全性和有

2、效性以及如何對(duì)其中的活性成分進(jìn)行定性和定量。本文描述的高效液相色譜分析法被證明是一種行之有效的分析測(cè)試方法。There is always a keen interest in natural products by the pharmaceutical industry in order to increase the store of therapeutic products for sale to the public. Goldenseal is a native herbal medicinal plant invoduced to European settlers by Nati

3、ve Americans. In name is derived from the bright yellow color of its roots. Goldenseal is of current interest for in purported allti-inHammatory and antibiotic properties. The primary active ingredienn are berberine and hydrastine alkaloids, among others. Palmatine, which is closely related to berbe

4、rine, is not found in Goldenseal, but is found in the Chinese medicinal plant Huanglian. Both regulators and users of herbal products are faced with the tasks of assessing the safety of such products and verifying the truth in labeling regarding the quality and quantity of the active ingredients.Acc

5、ordingly, the HPLC procedure described in this article provides an effective means of analysis.        白毛茛(hydrastis canadenis L)1，2是美洲本土的一種草本藥用植物，由切羅基族印第安人傳入歐洲3。它的名稱來源于該植物金黃色的根(見圖1)。據(jù)稱白毛茛有抗炎、抗生等生理活性，因此吸引了人們的關(guān)注。它也被用來治療鼻子堵塞、感冒、流感和各種腸道失調(diào)等疾病。隨著白毛莫應(yīng)用領(lǐng)域的拓寬，其需求也大大增加，預(yù)計(jì)年銷

6、售額在250000英鎊以上。生物堿是白毛茛的活性成分，主要包括黃連素和黃連堿。還有一些低豐度的生物堿，如白毛茛分堿、5-羥(基)小檗堿和氫化小檗堿(結(jié)構(gòu)式見圖2)。非洲防已堿是一種與黃連素聯(lián)系密切的生物堿。北美黃連(H. cannadenis)一般不含有非洲防已堿，但是人們已經(jīng)從中藥?黃連(Coptis chinensis)、 日本藥?金線(Gildthread)4(Coptis japonica)和其他含有黃連素的植物中發(fā)現(xiàn)了非洲防已堿。 1 分析方法的建立草藥的療效是建立在活性成分的基礎(chǔ)上的?，F(xiàn)在，管理部門和廠家面臨的兩個(gè)主要任務(wù)就是：    (1)

7、如何評(píng)價(jià)草藥中活性成分的安全性和有效性；    (2)如何對(duì)草藥中活性成分進(jìn)行定性和定量。對(duì)白毛茛而言，為了質(zhì)量控制的需要，必須建立一個(gè)快速、高質(zhì)量、等度洗脫的分析方法來鑒定和測(cè)定生物堿的種類和含量。Betz5，Anderson和Burney6等在以前的工作中已經(jīng)通過常溫萃取后用高效液相色譜法測(cè)定了H. canadensis中的生物堿含量。除了快速測(cè)定白毛茛中主要生物堿以外，人們還需要新的方法來測(cè)定非洲防已堿。非洲防已堿可用作標(biāo)記物來區(qū)分白毛茛和其他含黃連素的植物。我們用Zorbaxrapod-resolution Eclipse XDB-C18色譜柱(Agile

8、nt Technologies，Palo Alto，CA，USA)， 以醋酸氨緩沖液和乙腈為流動(dòng)相，測(cè)定了白毛茛中主要的生物堿和非洲防已堿。該方法能夠得到理想的分辨率和峰形，滿足以上要求，而且還能夠用于其他含黃連素植物的分析。Zorbax Eclipse色譜柱非常適合研究中使用的乙睛水流動(dòng)相的中度pH環(huán)境(485)。在該pH值下，硅膠表面殘留的硅逐基可以電離，與生物堿中帶正電的含氮基團(tuán)發(fā)生離子交換，從而導(dǎo)致色譜峰的展寬和拖尾，降低了分辨率。為了避免這一問題，對(duì)Eclipse色譜柱的硅膠表面殘留的硅經(jīng)基進(jìn)行了封尾，使其電離減至最小。該色譜柱另一個(gè)特性是它采用了金屬含量很低的高純硅膠。硅膠中的金屬

9、雜質(zhì)不但能夠促進(jìn)硅經(jīng)基的電離，而且與流動(dòng)相中的分析物相互作用，影響分離。總的看來，填料的這些改進(jìn)提高了色譜柱的使用壽命。實(shí)現(xiàn)了6種生物堿的高分辨分離，峰形良好。2 實(shí)驗(yàn)部分樣口的提取樣品的提取步驟如下：(1)稱取約05g白毛茛根粉末；(2)加入100mL乙腈：水：磷酸(體積比為70：30：01)的混合溶液溶解樣品粉末；(3)超聲5min，振蕩(搖床)10min，離心過濾；(4)濾液用乙腈：水(體積比為30：70)的混合溶液稀釋5倍；(5)將樣品溶液注入液相色譜儀進(jìn)行分析。3結(jié)果與討論優(yōu)化后的色譜分離圖見圖3。如圖所示，重現(xiàn)性非常好。分離溫度穩(wěn)定在30，能夠保證重現(xiàn)的保留時(shí)間7。 &#

10、160;該方法也被用來評(píng)價(jià)提取步驟的合理性。表1列出了線性關(guān)系、精密度和生物堿的回收率。生物堿的精密度和92一102回收率都非常好，能夠用于定量測(cè)定。線形回歸結(jié)果、靈敏度也不錯(cuò)(見圖4)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出黃連素的檢出限和定量限分別是050mgmL和165mgmL。這一結(jié)果表明：即使在白毛茛提取物質(zhì)量濃度很低的情況下，該方法也能夠?qū)ι飰A進(jìn)行高精密度的定量分析。 表2列出了來源于5個(gè)不同供應(yīng)商的9批白毛茛粉末的生物含量測(cè)定結(jié)果。結(jié)果表明：在不同供應(yīng)商提供的樣品中生物堿的含量存在明顯的差異，因此發(fā)展該分析方法是非常必要的。4 結(jié)論隨著非處方藥物中天然產(chǎn)物使用范圍的擴(kuò)大，草藥或者植物藥質(zhì)

11、量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化引起了人們的廣泛關(guān)注。質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化涉及到藥物成分的穩(wěn)定性和一致性，確保公眾不受假藥和非法有害藥物的侵害。白毛真是眾多草藥的一個(gè)代表，提取工藝和高效液相色譜分離是建立在分析方法的基礎(chǔ)上的。當(dāng)前，人們已經(jīng)利用高分辨zorbax色譜柱(選擇合適的pH值和流動(dòng)相)發(fā)展了多種液相色譜方法，并將常溫提取液相色譜分離的分析方法應(yīng)用于許多草藥如人參小連翹屬植物，也用于很多有重要生物活性的植物成分，如黃酮、二氫黃酮和酚酪、植物雌激素和異黃酮、花青素。更多的分析方法正在發(fā)展中(見補(bǔ)充報(bào)道)。補(bǔ)充報(bào)道醫(yī)學(xué)知識(shí)的發(fā)展，信息渠道的多樣化和自我意識(shí)的增強(qiáng)促使人們開始轉(zhuǎn)向傳統(tǒng)藥物以外的領(lǐng)域去尋找治療和

12、保健的新藥。在美國，一大批高素質(zhì)的、富裕的人群即將進(jìn)入退休年齡，這一現(xiàn)狀更增加了新藥開發(fā)的動(dòng)力。新藥研究一個(gè)很重要的領(lǐng)域是已經(jīng)使用了幾個(gè)世紀(jì)之久的植物藥，它們已被證明對(duì)許多疾病有療效。在很多時(shí)候，支持使用植物藥的觀念與基于現(xiàn)代藥物的科學(xué)準(zhǔn)則是不一致的。這一區(qū)別造成兩種思維之日的障礙。不過，新藥或替代藥研究催生了一個(gè)新的產(chǎn)業(yè)，它們將天然產(chǎn)物作為飲食類補(bǔ)品和或飲食療法。這一產(chǎn)業(yè)所占有的市場(chǎng)已經(jīng)達(dá)到157億美元8，但隨之而來的監(jiān)管不利、危險(xiǎn)物質(zhì)超標(biāo)、假藥泛濫等問題促使美國和其他國家采取措施保護(hù)公眾健康。國家研究院下屬的藥品、食品和營養(yǎng)品研究所提交了關(guān)于這一問題的官方報(bào)告。在它的支持下，飲食補(bǔ)品成分安

13、全評(píng)價(jià)委員會(huì)正在建立一個(gè)體系以供美國食品藥品管理局評(píng)價(jià)飲食補(bǔ)品的安全性。在這些目標(biāo)中，該體系包括一個(gè)科學(xué)有效測(cè)定飲食成分的歸類系統(tǒng)9?？紤]到基于同一天然產(chǎn)物不同品牌的產(chǎn)品間成分差異較大，以及不同分析方法可能造成的產(chǎn)品組成的差異，該體系最后會(huì)使用統(tǒng)一的分析標(biāo)準(zhǔn)10。這就是Agnent Technologies和它的用戶們致力于建立植物藥和其他領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)分析方法的最終目的。參考文獻(xiàn):1. Weber HA, Joseph M.Extraction and HPLC analysis of alkaloids in goldenseat. Palo Alto,CA: Agilent Technolo

14、gies. Applic note 5988-7136 EN, SeIJt 18, 2002.2. Weber HA, Zart MK, Hodges AE, et al. Method validation for determination of alkaloid content in gotdenseal root powder. J AOAC Int 2002;86:476-83.3. Herbal Information Center4.5. Betz JM, Musser SM, Larkine GM. Differentiation between goldenseal Hydr

15、astis canadcnsis L.)and possible adulterants by LC/MS. Presellted at the 39th Annual Meeting ofthe AmericanSociety of Pharmacognosy, Orlando, FL6. Anderson ML, Burney DP. J AOAC Int t998;81:1005-IO.7. Weber HA, Zart MK, Ferguson SL, et al. J Liq Chromatogr Rel Tcch 2001 ; 24(I):87-95.8.9.10. Released for comment:Executive summary,Pp. 39-40. Proposed framework for evaluating the sa