甜菜堿對脫氮假單胞桿菌發(fā)酵產(chǎn)ＶＢ１２的影響

1、甜菜堿對脫氮假單胞桿菌發(fā)酵產(chǎn)的影響         08-11-27 13:36:00     編輯：studa0714王振國曹云峰陳學軍李永亮李昆太張嗣良    摘要 通過研究不同甲基供體（甜菜堿和氯化膽堿）對脫氮假單胞桿菌發(fā)酵產(chǎn)VB12的影響，結(jié)果表明甜菜堿能顯著促進VB12的生物合成；在此基礎(chǔ)上考察了發(fā)酵培養(yǎng)基中甜菜堿濃度對VB12合成的影響，結(jié)果表明15 g/L的甜菜堿下VB12的合成量最高；進一步研究了甜菜堿對脫氮假單胞桿菌發(fā)酵過程的影

2、響，結(jié)果表明發(fā)酵液中一定濃度的甜菜堿可以顯著提高-氨基乙酰丙酸的合成量，從而促進VB12的合成。關(guān)鍵詞 甜菜堿；菌體生長；VB12合成；-氨基乙酰丙酸；脫氮假單胞桿菌Abstract The effect of different methyl-group donors (betaine and choline chloride) on vitamin B12 production in shake flasks with Pseudomonas denitrificans was studied, and the results demonstrated that the addition

3、of betaine to the fermentation medium could greatly stimulate biosynthesis of vitamin B12. Betaine concentration in fermentation medium was further investigated in shake flask, as a result, 15 g/L of betaine was the most beneficial for vitamin B12 synthesis. Moreover, the effect of betaine on the fe

4、rmentation of P. denitrificans was studied, it was found that the -aminolevulinic acid (ALA) biosynthesis could be significantly improved when betaine was kept at certain concentration in the broth, thus the biosynthesis of vitamin B12 was greatly increased.Key words Betaine;Cell growth;Vitamin B12

5、biosynthesis;-aminolevulinic acid,;Pseudomonas denitrificans維生素B12（VB12）通常用來表示鈷胺素類化合物，它是一種重要的生物活性物質(zhì)，可以用來治療惡性貧血癥，同時也是許多微生物和動物的生長因子1。自然界中，VB12的生物合成存在兩種不同的途徑，即好氧途徑和厭氧途徑，但是VB12的生物合成嚴格局限于一些微生物中2，目前用于商業(yè)化生產(chǎn)VB12的微生物主要有謝氏丙酸桿菌（Propionibacterium shermanii）、菲氏丙酸桿菌（P. freudenreichii）和脫氮假單胞桿菌（Pseudomonas denitrif

6、icans）等。P. denitrificans好氧合成VB12的途徑已經(jīng)詳細闡明3。正是由于對VB12合成途徑的了解，所以可以通過誘變和分子生物學等手段來改造菌株，已經(jīng)使得P. denitrificans菌株的VB12生產(chǎn)能力大大提高2。由于VB12產(chǎn)率高, 目前在工業(yè)生產(chǎn)中幾乎都是使用P. denitrificans來作為好氧生產(chǎn)VB12的工業(yè)菌株。P. denitrificans好氧合成VB12的過程一共需要8步甲基化4。氯化膽堿（氯化-羥乙基-N,N,N-三甲基銨）和甜菜堿（三甲基甘氨酸）的每個分子含有三個甲基，它們通常作為生物合成VB12的甲基供體。White等 5第一次報道在P.

7、denitrificans中，甜菜堿-高半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶對VB12的大量合成具有非常重要的作用。甜菜堿-高半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶催化甜菜堿向高半胱氨酸轉(zhuǎn)移一個甲基，分別形成二甲基甘氨酸和甲硫氨酸6，因此甜菜堿在參與VB12生物合成過程中的甲基化具有非常重要的作用。Demain等7-9的研究表明，甜菜堿對P. denitrificans中VB12的合成和卟啉的過量生成起著重要的作用。另外，甜菜堿是一種良好的滲透壓調(diào)節(jié)劑10，有文獻報道甜菜堿和膽堿能促進細胞表面對代謝產(chǎn)物的分泌，從而對細菌產(chǎn)VB12具有刺激效果11。甜菜堿在VB12發(fā)酵過程中具有非常重要的作用，但是目前很少有文獻對甜菜堿所引起的P. d

8、enitrificans代謝變化情況進行分析。本文主要考察了甜菜堿對P. denitrificans菌體生長和VB12合成的影響，并通過研究發(fā)酵過程pH和-氨基乙酰丙酸（ALA）合成量的變化，闡明了甜菜堿所引起的P. denitrificans代謝特征，為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)VB12中的甜菜堿控制工藝提供了重要依據(jù)。1 材料與方法1.1 菌種和培養(yǎng)基菌種：脫氮假單孢桿菌（Pseudomonas denitrificans），石藥集團河北華榮制藥有限公司。種子培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖 40，酵母膏 10， NH4Cl 1.0，MgSO4·7H2O 0.5，ZnSO4·7H2O 0.1

9、，pH 7.27.4。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖 80，酵母膏 30，(NH4)2HPO4 3.0，MgSO4·7H2O 2.0，CoCl2·6H2O 0.1，5,6-二甲基苯并咪唑（DMBI） 0.05，ZnSO4·7H2O 0.1，CaCO3 1.0，pH7.07.2。1.2 儀器與試劑儀器：8453型紫外-可見分光光度計（Agilent公司）；HP 1100型色譜儀(Agilent公司)。 試劑：氰鈷胺對照品(含量99，河北華榮制藥有限公司)，糖蜜（內(nèi)蒙古蘭田糖業(yè)有限公司），甜菜堿(河北華榮制藥有限公司)，DMBI(河北科碩化工有限公司)，CoCl2

10、3;6H2O(山東臨縣匯豐鈷廠)，ALA (Sigma公司)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.3 發(fā)酵培養(yǎng)方法種子培養(yǎng)：用無菌水刮洗下斜面菌體，制成菌懸液。取1 ml菌懸液接入裝有60 ml種子培養(yǎng)基的300 ml三角瓶中，30 ，260 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床振蕩培養(yǎng)至菌體吸光值(OD700)為10左右。搖瓶培養(yǎng)：300 ml三角瓶中培養(yǎng)基裝量為36 ml，接種量10，32 ，于旋轉(zhuǎn)式搖床（260 r/min）培養(yǎng)至96 h。1.4測定方法菌體濃度(DCW)：采用測量菌體干重法(dry cell weight)。吸10 ml發(fā)酵液，經(jīng)離心和洗滌后，菌體烘干至恒重，稱菌體干重。VB12測定：采用HP

11、LC法。將被測樣品中不同形式的VB12轉(zhuǎn)化為氰鈷胺，流動相：V（250 mmol/L磷酸水溶液）V（乙腈）= 3070；色譜柱：大連依利特Hypersil NH2柱（4.6 mm× 250 mm，5 m）；檢測波長：361 nm；進樣量：20 l；流速：1.7 ml/min。甜菜堿測定：比色法12，利用甜菜堿與雷氏鹽發(fā)生反應。-氨基乙酰丙酸(ALA)含量的測定：按照文獻13的方法進行測定。2 結(jié)果與討論2.1 兩種不同甲基供體對菌體生長和VB12合成的影響甜菜堿和氯化膽堿每個分子都含有三個甲基，常常作為發(fā)酵產(chǎn)VB12過程的甲基供體。為了比較二者對P. denitrificans發(fā)酵產(chǎn)

12、VB12的影響，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入10 g/L的甜菜堿、氯化膽堿，結(jié)果如圖1所示：圖1不同甲基供體對P. denitrificans發(fā)酵過程的影響Fig. 1The effects of different methyl-group donors on cell growth（solid）(a), broth pH (dash) (a) and VB12 synthesis (b) of P. denitrificans in shake flask 由圖1a可見，發(fā)酵培養(yǎng)基使用甜菜堿的菌體生長量明顯要高于使用氯化膽堿，其最大DCW分別為23.04 g/L和18.79 g/L。使用甜菜堿作

13、為甲基供體，發(fā)酵過程中的pH較為穩(wěn)定，一直維持在7.0左右。而使用氯化膽堿作為甲基供體，發(fā)酵液的pH急劇下降，第48小時后pH降低至5.0左右，pH的下降很可能是由于氯離子積累而造成的。由圖1b可見，使用氯化膽堿的VB12效價明顯低于使用甜菜堿的VB12效價，二者放瓶時（96 h）的VB12效價分別為20.75 g/ml和48.45 g/ml。2.2 甜菜堿濃度對VB12合成的影響在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入甜菜堿，濃度分別為0、5、10、15、20、30 g/L。發(fā)酵96 h后放瓶，結(jié)果見圖2。圖2 不同濃度的甜菜堿對VB12合成的影響Fig 2. Effect of betaine on the cell growth and vitamin B12 biosynthesis of P. denitrificans從圖2可以看出，在P. denitrificans發(fā)酵過程中，添加