microRNA91慢病毒載體構建及對小鼠骨髓間質干細胞誘…

1、MicroRNA-9-1慢病毒載體的構建及其對小鼠骨髓間質干細胞誘導分化為神經(jīng)細胞的影響*景黎君，賈永林，魯晶晶，韓 瑞，王舒陽，李盡義，彭 濤，賈延劼（鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內科，河南 鄭州 450052）摘 要 目的：探討microRNA-9-1在體外誘導小鼠骨髓間充質干細胞（MSCs）向神經(jīng)細胞分化中的作用。方法: 構建小鼠microRNA-9-1慢病毒載體（microRNA-9-1-LV）并感染小鼠MSCs，篩選最適感染復數(shù)（MOI）；實驗分為未感染組、感染組（感染microRNA-9-1-LV組）、陰性對照組（感染FU-RNAi-NC-LV）；采用-巰基乙醇誘導感染后小鼠MSCs分

2、化為神經(jīng)細胞。倒置熒光顯微鏡下觀察MSCs感染后熒光表達情況；采用免疫細胞化學染色檢測神經(jīng)元烯醇化酶（NSE）、神經(jīng)微管結合蛋白（MAP-2）和膠質纖維酸性蛋白（GFAP）的表達變化；PT-PCR檢測MAP-2 mRNA的表達變化；MTT方法檢測細胞存活率。結果：(1) 陽性克隆PCR證明小鼠microRNA-9-1慢病毒載體構建成功，孔稀釋法測定病毒滴度為1×1012 TU/L。(2) 倒置顯微鏡下觀察小鼠microRNA-9-1慢病毒載體感染成功，MOI值為20，感染4 d時感染率最高，細胞存活率較高，感染率可達91.3% ± 4.2%。(3) -巰基乙醇可以誘導MSC

3、s向神經(jīng)細胞分化，其中以感染組誘導效果最佳，NSE和MAP-2的表達率顯著高于其它各組（P<0.05）。結論：(1) microRNA-9-1可高效感染小鼠MSCs。(2) 感染miRNA-9-1-LV后MSCs經(jīng)-巰基乙醇誘導向神經(jīng)細胞分化比率增加。關鍵詞 MicroRNA-9-1；骨髓間充質干細胞；神經(jīng)元；慢病毒中圖分類號 R329.21 文獻標識碼 A *基金項目 國家自然科學基金資助項目（No. 30770758）；河南省教育廳自然科學研究計劃項目（No. 2008A320032）通訊作者 Tel: E-mail: jiayanjie1971Effe

4、ct of lentiviral vector of microRNA-9-1 on differentiation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells into neuronsJING Li-jun, JIA Yong-lin, LU Jing-jing, HAN Rui, WANG Shu-yang, LI Jin-yi, PENG Tao, JIA Yan-jie(Department of Neurology, The First Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou

5、 450052, China. E-mail: jiayanjie1971)ABSTRACT AIM: To investigate the role of microRNA-9 in inducing bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) to differentiate into neurons. METHODS: The lentiviral vector of microRNA-9-1 (microRNA-9-1-LV) was constructed and transfected into mouse MSCs. The cells w

6、ere divided into non-transfected group, transfected group (transfected with microRNA-9-1-LV) and negative control group (transfected with FU-RNAi-NC-LV). MSCs were treated with -mercaptoethanol (-ME) as an inducer for triggering the cells to differentiate into neurons. The fluorescence expressed by

7、transfected MSCs were observed under inverted fluorescence microscope. The mRNA expression of microtubulin-associated protein 2 (MAP-2) was detected by RT-PCR. The expression of neural cell specific markers, neuron-specific enolase (NSE), MAP-2 and glial fibrillary acidic protein (GFAP), were measur

8、ed by immunocytochemical method. The viability of MSCs was determined by MTT method. RESULTS: The results of PCR confirmed successful construction of mouse microRNA-9-1-LV. The virus titer was 1×1012 TU/L (TU, transduction unit). The best transfection efficiency (up to 91.3% ± 4.2%) and su

9、rvival rate appeared when multiply of infection (MOI) was 20 and on the 4th day. -ME induced MSCs to differentiate into neurons and the best efficiency of the induction was observed in transfected group. The expression levels of NSE and MAP-2 in transfected cells were higher than those in the cells

10、of other groups (P<0.05). CONCLUSION: MicroRNA-9-1-LV has high transfection efficiency in mouse MSCs. Higher differentiation rate from mouse MSCs to neurons is induced by -ME after the cells are transfected with microRNA-9-1-LV.KEY WORDS MicroRNA-9-1; Marrow mesenchymal stem cells; Neurons; Lenti

11、virusmicroRNA是生物體內源的小RNA分子，可以在轉錄水平、轉錄后水平、表觀遺傳學水平等水平調控基因組的表達，參與生命過程中一系列的重要進程1。誘導骨髓間質干細胞（marrow mesenchymal stem cells, MSCs）分化為神經(jīng)細胞有可能成為臨床中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的可行性方法2，但其具體機制尚不清楚，研究發(fā)現(xiàn)MSCs分化為神經(jīng)細胞過程中，microRNA在其中起著重要調控作用3。MicroRNA-9在腦組織中表達較為豐富，研究表明，microRNA-9在神經(jīng)干或前體細胞分化發(fā)育中起著重要作用4。MSCs可以向神經(jīng)細胞方向分化，但是microRNA-9是否在MSCs

12、誘導分化中起作用尚不清楚。本研究根據(jù)確定的miRNA-9-1序列，構建目的microRNA慢病毒載體，將其感染小鼠MSCs，-巰基乙醇誘導各組細胞，觀察microRNA-9在小鼠MSCs橫向分化為神經(jīng)細胞中的作用。材料和方法1 動物SPF級BALB/c小鼠，雌雄不限，6 - 8周齡，18 - 20 g，由河南省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(豫)2005-0001。MSCs由大鼠股骨中分離提取，連續(xù)傳10代以上。293T細胞和大腸桿菌菌株DH5由鄭州大學生物化學教研室惠贈。2 主要試劑Xba I、Hpa I及T4 DNA連接酶購自NEB；RNA干擾載體pFU-GW-RNAi和病毒包裝三質

13、粒：pGC-LV 重組載體（同時可表達綠色熒光蛋白）、pHelper 1.0和pHelper 2.0均購自上海吉凱基因化學有限公司；感染試劑Lipofectamine 2000 購自Invitrogen；DMEM液體培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；神經(jīng)元烯醇化酶（neuron-specific enolase, NSE H-300，sc-15343）、神經(jīng)微管結合蛋白（microtubulin-associated protein 2, MAP-2, sc-20172）、膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP H-50, sc-9065）兔

14、抗多克隆抗體購自Santa Cruz公司；Cy3標記山羊抗兔IgG（H+L）購自上海碧云天公司；RNeasy Mini試劑盒、OneStep RT-PCR試劑盒均為Qiagen產(chǎn)品；凝聚胺、多聚賴氨酸和噻唑藍（MTT）購自Sigma；其他生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。所用引物由上海吉凱基因技術有限公司根據(jù)設計合成，見表1。3 主要方法3.1 MicroRNA-9-1慢病毒載體的構建 根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫獲得microRNA-9-1 (MI0000720)的序列，設計合適的引物序列，PCR方法合成含雙鏈DNA oligo，其兩端含酶切位點黏端。將pFU-GW-RNAi載體Xba I和Hp

15、a I雙酶切后，在T4 DNA連接酶作用下，與雙鏈DNA oligo于4 °C 12 h連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞后進行陽性克隆PCR鑒定。脂質體介導的瞬時感染方法進行慢病毒顆粒的包裝。感染前24 h，調整細胞293T細胞密度為6×108 cells/L，重新接種于15 cm2細胞培養(yǎng)皿，37 °C、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。待細胞密度達70% - 80%時即可感染。DNA溶液（pGC-LV載體20 g，pHelper 1.0載體15 g，pHelper 2.0載體10 g），與相應體積的Opti-MEM混合均勻，調整總體積為2.5 mL，加入

16、離心管中，室溫下溫育5 min。取100 L Lipofectamine 2000試劑在另一離心管中與2.4 mL Opti-MEM混合，室溫下溫育5 min。然后將分別含有DNA和脂質體溶液混合，輕柔混勻，室溫下溫育20 min。將DNA與Lipofectamine 2000 混合液轉移至293T細胞的培養(yǎng)液中，混勻，于37 °C、 5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)8 h后倒去含有感染混合物的培養(yǎng)基，每瓶細胞加入20 mL的PBS液，輕輕左右晃動培養(yǎng)瓶以洗滌殘余的感染混合物，然后倒去。每瓶細胞中加入含10% 血清的細胞培養(yǎng)基25 mL，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內繼續(xù)

17、培養(yǎng)48 h。收集感染后48 h的293T細胞上清液，于4 °C、4 000×g離心10 min，除去細胞碎片。0.45 m濾器過濾上清液于40 mL 超速離心管中，再離心濃縮病毒液至所需濃度。收集病毒液，分裝后-80 °C長期保存。取其中1支用孔稀釋法進行病毒滴度測定。同樣方法制備僅含GFP報告基因的陰性對照慢病毒載體。3.2 感染復數(shù)（multiply of infection, MOI）值測定 取培養(yǎng)10代以上的小鼠MSCs，以2×109 cells/L的密度接種至24孔板，培養(yǎng)2 d至細胞融合度達到30% - 50%。分為5個不同梯度的MOI值。

18、在完全培養(yǎng)基中加入含有microRNA-9-1和GFP（綠色熒光報告基因）的慢病毒載體上清，對照組B組加入僅含GFP的陰性對照慢病毒載體上清，兩組均加上終濃度為5 mg/L的凝聚胺（polybrene）。共感染24 h，換新鮮培養(yǎng)基。感染后每天倒置熒光顯微鏡下觀察各組細胞GFP表達情況，并計數(shù)GFP陽性細胞的百分比。3.3 小鼠MSCs感染及實驗分組 取microRNA-9-1-LV以最適MOI值感染小鼠MSCs，同時，取同一MOI值的FU-RNAi-NC-LV感染陰性對照組置于37 °C、5% CO2培養(yǎng)箱內孵育，孵育24 - 72 h。根據(jù)感染情況將同時間點的MSCs細胞分為3組

19、：未感染組：不進行感染，其它培養(yǎng)條件同各感染組；感染組：感染microRNA-9-1-LV，即含有microRNA-9-1病毒和GFP；陰性對照組：感染FU-RNAi-NC-LV，即只含有GFP。在倒置熒光顯微鏡下觀察感染后24 h、48 h、72 h、96 h觀察GFP熒光表達情況，評價細胞感染效率。3.4 體外誘導MSCs分化為神經(jīng)細胞 取各組細胞進行誘導實驗。去除DMEM完全培養(yǎng)基，D-Hanks液清洗3次，加入預誘導液（DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1 mmol/L -巰基乙醇)置于37 °C、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。預誘導后，加入誘導液（DMEM培養(yǎng)基，5 mmo

20、l/L -巰基乙醇），37 °C、5% CO2條件下培養(yǎng)5 h。3.5 MTT比色法 將感染microRNA-9-1-LV和FU-RNAi-NC-LV前后各時間點的MSC移入96孔培養(yǎng)板，加入MTT（5.0 g/L）50 µL/well、置入培養(yǎng)箱孵育4 h，離心棄上清，加入二甲基亞砜200 µL，采用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光值，評價細胞存活率。3.6 免疫細胞化學染色法 將各組細胞用PBS清洗之后，迅速經(jīng)4%多聚甲醛的固定液中于 4 °C固定過夜，0.2% Triton X-100處理10 min，并用封閉液封閉1 h。然后分別用NSE抗體（1.0

21、mg/L）、MAP-2抗體（1.0 mg/L）和GFAP抗體（1.0 mg/L）4 °C孵育24 h。用PBS 洗3遍后，用Cy3標記山羊抗兔IgG（1500）在室溫下進行染色標記、觀察。細胞圖像通過顯微鏡用 ×10或 ×20攝取。每組獨立的實驗都會采集超過30個區(qū)域的細胞。而且，在明視野下所采集的每幅圖像都盡量包含相同的細胞數(shù)目。應用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件分析各實驗組的熒光圖片單個細胞的累積吸光度值，進行統(tǒng)計學分析。3.7 RT-PCR 采用RNeasy Mini試劑盒分離純化各組細胞的總RNA，分光光度法測定計算提取的總RNA含量

22、及濃度。參照OneStep RT-PCR試劑盒實驗操作說明進行RT-PCR，總反應體積50.0 L，其中5× OneStep RT-PCR buffer 10.0 L，dNTP Mix 2.0 L，OneStep RT-PCR Enzyme Mix 2.0 L，5× Q-Solution 10.0 L， RNase inhibitor 10 U， RNA 1.0 g，引物 0.6 mol/L。擴增條件為：50 °C逆轉錄30 min，95 °C初始化15 min，94 °C變性1 min，55 °C 1 min，72 °C

23、1 min，30 - 35個循環(huán)，72 °C 10 min。然后，取RT-PCR產(chǎn)物10.0 L，加上樣緩沖液2.0 L，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，70 V 40 min，凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝保存實驗結果，凝膠圖像分析系統(tǒng)（GelPro Analyzer 3.0）分析各目的基因與-actin基因條帶吸光度值。4 統(tǒng)計學處理用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。結 果1 MicroRNA-9-1慢病毒載體的構建pFU-GW-RNAi載

24、體經(jīng)Hpa I 和Xho I酶切后，瓊脂糖凝膠電泳顯示載體中位于兩酶切位點間的原有片段被分離，載體被切割成線性，見圖1。挑選陽性克隆送測序，陽性克隆測序結果，見圖1。證明大鼠miRNA-9-1慢病毒載體構建成功。慢病毒載體系統(tǒng)的3個質粒pGC-LV、pHelper 1.0和pHelper 2.0按一定比例共感染293T細胞，收集感染后48 h的293T細胞上清液，進行離心濃縮。取濃縮的病毒液用孔稀釋法進行病毒滴度（titer，T）測定，T= 1×1012 TU/L（TU, transduction unit）。2 MicroRNA-9-1慢病毒感染 本研究采用含有綠色熒光報告基因（G

25、FP）標記的病毒載體觀察、評估感染效率。倒置熒光顯微鏡觀察感染24 h，可以觀察到部分綠色熒光，感染4 d時GFP表達最理想，感染組和陰性對照組GFP感染率沒有明顯差異，見圖2、表2。3 MTT結果感染前各組MSCs的MTT結果無顯著差異（P>0.05）；感染24 h，感染組MTT值顯著下降，與各對照組MTT值比較均有顯著差異（P<0.05），各對照組之間無顯著差異。感染48 h、72 h、96 h后MTT值雖較24 h有所上升（P<0.05），但與其他組MTT比較仍有顯著差異（P<0.05），見表3。4 -巰基乙醇體外誘導MSCs分化為神經(jīng)細胞未感染組MSCs誘導5

26、h，部分細胞出現(xiàn)神經(jīng)細胞改變，胞體收縮呈多角形或圓形，突起細長，有數(shù)個分支，部分在局部形成網(wǎng)絡。感染micro-RNA-9-1-LV組誘導后，細胞形態(tài)變化更為迅速和顯著，誘導5 h多數(shù)細胞胞體收縮呈圓形、錐形，細胞突起細長，交織成網(wǎng)，形成較典型的神經(jīng)細胞結構，少量細胞脫落、死亡。陰性對照組和未感染組類似，見圖3。5 免疫細胞化學染色法感染組誘導5 h，NSE和MAP-2的表達率分別為87.2% ± 2.0%和85.5% ± 0.8%，顯著高于其它各組（P<0.05）。各組GFAP表達率均小于1%，無顯著性差異，見圖4、表4。6 RT-PCR結果3組分別誘導分化5 h均

27、表達MAP-2 mRNA，未轉染組和陰性對照組無顯著差異，感染microRNA-9-1組表達MAP-2 mRNA較前2組明顯增高，有顯著差異，見圖5、圖6。討 論1 慢病毒載體感染技術 慢病毒基因轉導載體包容量大，能夠感染任何類型神經(jīng)細胞，其攜帶的目的基因可整合到宿主細胞基因組使外源基因獲得長期穩(wěn)定表達，且不編碼病毒蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也不會引起免疫反應5。在人和小鼠腦組織中成熟的microRNA-9有3種不同形式，microRNA-9-1、-9-2和-9-3，其原始轉錄本分別位于3、13、7號染色體上。通過用維甲酸處理小鼠P19細胞發(fā)現(xiàn)，microRNA-9-1在誘導后有明顯變化，經(jīng)歷急劇

28、上升至迅速下降過程，且處理后神經(jīng)特異性標志物MAP-2逐漸上升，提示microRNA-9-1在神經(jīng)分化中起著重要調控作用和生物指示作用6。據(jù)此本研究采用采用三質粒表達系統(tǒng)即pGC-LV載體、pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體來構建慢病毒載體，建立microRNA-9-1增強體外模型，并探討其在MSCs誘導分化為神經(jīng)細胞中的作用。2 MicroRNA-9在MSCs向神經(jīng)細胞分化中的作用 MicroRNA可以作為發(fā)育開關以及微調發(fā)育程序來調控生物體內多種發(fā)育過程7。MicroRNA-9是腦組織特異表達的一種小RNA，它在小鼠胚胎干細胞和腫瘤細胞的分化中其重要調控作用8。研究發(fā)現(xiàn)

29、，microRNA-9在神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化過程中起重要調控作用9，通過影響轉錄激活因子STAT3信號通路來促進神經(jīng)分化5。通過Fgf信號通路調控中腦后腦交接區(qū)（midbrain-hindbrain boundary，MHB）的組織活性10。 Krichevsky等4研究發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育的第5階段microRNA-9/9*表達較高，此階段是神經(jīng)元前體向神經(jīng)元和膠質細胞分化的關鍵時期，抑制神經(jīng)前體細胞中microRNA-9表達可使神經(jīng)元數(shù)量減少29% - 31%。MicroRNA-9調控著由胚胎干細胞衍生來的神經(jīng)祖細胞的增殖和遷移，由其直接調控的一個靶基因可以編碼一種19 kD的磷酸蛋白stat

30、hmin，該蛋白特異性在神經(jīng)祖細胞上表達，可以增加微觀的不穩(wěn)定性，從而促進細胞定向遷移11,12。本研究發(fā)現(xiàn)感染microRNA-9-1慢病毒載體的MSCs向神經(jīng)細胞分化效率增加，考慮可能和microRNA-9的上述作用有關。MSCs是一種成體干細胞，可以向骨、軟骨、脂肪等多種組織分化，研究發(fā)現(xiàn)其可以向神經(jīng)細胞分化13,14。與神經(jīng)干細胞定向分化所不同，MSCs分化為神經(jīng)細胞是一種橫向分化方式，其調控因子目前了解較少。Greco等3發(fā)現(xiàn)在人MSCs分化為神經(jīng)細胞過程中，microRNA在其中起著重要調控作用。但與神經(jīng)干細胞分化機制是否相同，microRNA-9是否參與分化過程尚未見報道。本研究

31、首次采用感染microRNA9-1慢病毒載體，構建microRNA-9-1增強模型，觀察其在MSCs誘導分化中的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-9-1慢病毒載體可高效感染小鼠MSCs，感染后報告基因GFP可穩(wěn)定表達。本研究MTT結果發(fā)現(xiàn)，感染microRNA-9-1慢病毒后，MSCs存活率下降，但感染僅含有報告基因的慢病毒載體后MSCs存活率變化不大，表明microRNA-9在MSCs保持細胞自我更新、分裂、凋亡等生理功能中起到一定作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與未感染和感染僅含有GFP的慢病毒的MSCs相比感染microRNA9-1慢病毒后，MSCs向神經(jīng)細胞分化效率顯著提高，神經(jīng)細胞早、中期標志物

32、NSE和成熟神經(jīng)細胞特異性標志物MAP-2表達均明顯增高，且未見GFAP表達。這提示microRNA-9-1可能在MSCs橫向分化神經(jīng)細胞中起作用，提高microRNA-9-1的表達，可以促進MSCs向神經(jīng)細胞分化。單獨感染microRNA-9-1慢病毒并不能使MSCs向神經(jīng)細胞分化，還必須在誘導劑（-巰基乙醇等）的作用下才能分化。這說明microRNA9-1在MSCs在橫向分化為神經(jīng)細胞過程中不是唯一的，可能是對一些信號途徑調控，如Notch信號途徑15，從而提高誘導效率。但是具體機制尚不明確。綜上所述，本研究采用慢病毒感染技術，建立microRNA-9-1過表達細胞模型，從而促進MSCs向

33、神經(jīng)細胞的分化效率，提示microRNA-9-1在MSCs誘導分化為神經(jīng)細胞過程中可能起促進作用。參考文獻1 Lagos-Quintana M, Rauhut R, Yalcin A, et al. Identification of tissue-specific microRNAs from mouseJ. Curr Biol, 2002, 12 (9):735-739.2 原清濤, 鄧宇斌, 李樹濃. 骨髓間質干細胞誘導分化為神經(jīng)元及其應用的研究進展J. 中國病理生理雜志, 2004, 20(11):2139-2142.3 Greco SJ, Rameshwar P. MicroRNAs

34、 regulate synthesis of the neurotransmitter substance P in human mesenchymal stem cell-derived neuronal cellsJ. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104 (39):15484-15489.4 Krichevsky AM, Sonntaq KC, Isacson O, et al. Specific microRNAs modulate embryonic stem cell-derived neurogenesisJ. Stem Cells, 2006,

35、 24 (4):857-864.5 Simmons A, Whitehead RP, Kolokoltsov AA, et al. Use of recombinant lentivirus pseudotyped with vesicular stomatitis virus glycoprotein G for efficient generation of human anti-cancer chimeric T cells by transduction of human peripheral blood lymphocytes in vitroJ. Virol J, 2006, 3:

36、8.6 Ko MH, Kim S, Hwang do W, et al. Bioimaging of the unbalanced expression of microRNA9 and microRNA9* during the neuronal differentiation of P19 cellsJ. FEBS J, 2008, 275 (10):2605-2616.7 Krol J, Loedige I, Filipowicz W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay J. Nat

37、Rev Genet, 2010, 11 (9):597-610.8 Delaloy C, Gao FB. microRNA-9 multitasking near organizing centersJ. Nat Neurosci, 2008, 11 (6):625-626.9 Conaco C, Otto S, Han JJ, Mandel G. Reciprocal actions of REST and a microRNA promote neuronal identityJ. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103 (7):24222427.10 Le

38、ucht C, Stiqloher C, Wizenmann A, et al. MicroRNA-9 directs late organizer activity of the midbrain-hindbrain boundaryJ. Nat Neurosci, 2008, 11 (6):641-648. 11 Delaloy C, Liu L, Lee JA, et al. MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitorsJ

39、. Cell Stem Cell, 2010, 6 (4):323-335.12 Nobuko U. microRNA-9 controls a migratory mechanism in human neural progenitor cellsJ. Cell Stem Cell, 2010, 6 (4):294-296.13 Cho KJ, Trzaska KA, Greco SJ, et al. Neurons derived from human mesenchymal stem cells show synaptic transmission and can be induced

40、to produce the neurotransmitter substance P by interleukin-1J. Stem cells, 2005, 23 (3):383-391.14 施雪英, 陳先文, 胡慧敏, 等. 三七總皂苷和維甲酸聯(lián)合誘導大鼠MSCs分化為神經(jīng)元樣細胞J. 中國病理生理雜志, 2007, 23(3):612-613.15 Wang Z, Li Y, Kong D, et al. Cross-talk between miRNA and Notch signaling pathways in tumor development and progression

41、J. Cancer Lett, 2010, 292 (2):141-148.Figure 1. PCR results for constructed microRNA-9-1-LV vector. A: enzyme-digested product. 1: marker; 2: the pFU-GW-RNAi plasmid without digestion; 3: the pFU-GW-RNAI plasmid digested by Xba I and Hpa I. B: PCR for cloned target gene. 1: the group with ddH2O; 2:

42、the group with empty vector; 3: the group with GAPDH; 4: marker; 5-12: the groups with transformants of microRNA-9-1.圖1 慢病毒載體構建PCR結果Figure 2. The cell infection rate (48 h after transfection, ×200). A: transfected group; B: negative control group.圖2 慢病毒感染24 h細胞感染率Figure 3. -ME induced MSCs into

43、 neurons (×200). A: transfected group; B: negative control group.圖3 -巰基乙醇誘導各組MSCs向神經(jīng)細胞分化Figure 4. Expression of MAP-2 in -ME-induced differentiation of MSCs into neurons (5 h after induction, ×200). A: transfected group; B: negative control group.圖4 -巰基乙醇誘導各組MSCs向神經(jīng)細胞分化過程中MAP-2的表達Figure 5. The RT-PCR for MAP-2. A: transfected group；B: negative control group; C: non-transfected group.圖5 MAP-2 RT-PCR結果Figure 6. MAP-2 mRNA expression. Mean±SD. n = 15. * P<0.05 vs other groups