強力霉素對移植肺缺血-再灌注損傷中細胞凋亡的研究(1)

1、強力霉素對移植肺缺血-再灌注損傷中細胞凋亡的研究(1)】 目的 探討外源性基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases， MMPs)抑制劑強力霉素在移植肺缺血-再灌注損傷中細胞凋亡的影響。 方法 建立大鼠自體左肺肺缺血再灌注模型，16只SD受體大鼠隨機分為兩組:缺血再灌注組和強力霉素組，用免疫組化方法觀察移植肺Bcl-2、Bax和Caspase-3表達情況，并取肺組織平滑肌細胞進行培養(yǎng)，采用熒光技術測定肺組織細胞凋亡。結果 肺缺血再灌注后，與對照組相比，強力霉素組移植肺Bax和Caspase-3表達明顯降低(P0.05)，但Bcl-2/Bax比例升高；熒光圖片顯示，強力霉

2、素組的細胞凋亡明顯較對照組減少。結論 強力霉素可能通過下調Bax、Caspase-3表達，提高Bcl-2/Bax比例而抑制肺缺血再灌注損傷的細胞凋亡，并通過降低基底膜的降解，減輕肺水腫，達到肺保護作用?！娟P鍵詞】 肺；缺血-再灌注損傷；強力霉素【Abstract】 Objective To investigate the effect of exogenous matrix metalloproteinase inhibitor on pneumocyte apoptosis in lung ischemia-reperfusion injury and the mechanism. Meth

3、ods Models of ischemia-reperfusion lung injury in SD rats were randomly divided into two groups. The protein level expression of Bcl-2 、Bax and Caspase-3 was measured by immunohistochemistry methods after 2h transplantation. Apoptotic morphological changes were assayed with Hoechst 33258 staining an

4、d were observed under fluorescent microscope. Results The protein level expression of Bax and Caspase-3 was significantly decreased in doxycycline group than in control group (P0.01)， the expression of Bcl-2 was not significantly increased in doxycycline group， but the ratio of Bcl-2/ Bax was signif

5、icantly increased in doxycycline group (P0.01). After treatment with MMPs inhibitor， PMVECs apoptosis decreased significant. Conclusions Doxycycline can suppress apoptosis and protect lung tissue cell in the lung ischemia-reperfusion injury.肺移植作為治療多種終末期肺疾病的有效方法，于1983年在臨床上首次獲得成功。但越來越多的證據顯示，供肺/移植肺仍然易于

6、受到保存損傷(缺血)和再灌注損傷，導致移植后早期嚴重移植肺功能不全的發(fā)生率高達20%，移植受者術后ICU監(jiān)護時間延長，術后早期死亡率增加1，并與移植后晚期較高的閉塞性支氣管炎（obliterative bronchitis，OB）發(fā)生率相關。因此，研究低溫肺保存后再灌注損傷的機制，改善移植肺功能，仍然是肺移植領域中所急需解決的重點課題之一。眾多研究表明，心肌細胞凋亡是肺缺血再灌注損傷的重表現(xiàn)形式。細胞凋亡受多種因素的調控，尤其是凋亡調控基因Bcl-2、Bax和凋亡執(zhí)行基因Caspase-32，3。本研究旨在通過建立大鼠自體左肺肺缺血再灌注模型移植模型，探討外源性基質金屬蛋白酶(matrix m

7、etalloproteinases，MMPs)抑制劑強力霉素在移植肺缺血-再灌注損傷中細胞凋亡的影響。1 材料與方法1.1 實驗分組、模型建立和取樣1.1.1 實驗分組 健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠16只(武漢大學醫(yī)學院實驗動物中心提供），體重250340g，隨機分為兩組：A組（n=8）：缺血 （IR）組，大鼠左肺經歷原位熱缺血30min、冷缺血3h、熱缺血30min和不同時間的再灌注處理；B 組（n=8）：治療組，術前一次性灌胃，連續(xù)7天，缺血90min，再灌2h于左肺門開放前10min經頸靜脈注入強力霉素30mg/(kgd)，其余操作同IR組。A組和B組給予等體積的生理鹽水

8、。1.1.2 大鼠自體左肺模擬原位移植模型的建立 術前30min肌注阿托品（0.5mg/kg），30g/L的戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔內注射，麻醉成功后，將大鼠右側斜位固定于手術臺上。氣管切開插管連接微型動物呼吸機。輔助呼吸參數(shù)為：潮氣量10ml/kg，呼吸頻率75次/min，吸入氧濃度FiO21.0，呼氣末正壓2.0cmH2O。右側頸動脈插管，用于采集標本、監(jiān)測血壓；右側頸靜脈穿刺備用；尾靜脈微量注射泵持續(xù)補液，速度為4.0ml/(kgh)。經左第5肋間前外側切口進胸并橫斷胸骨，打開縱隔。頸靜脈注射肝素鈉（375.U/kg）后，剝離左肺門，離斷左下肺韌帶；經左向右游離右肺動脈、靜脈及主支氣

9、管，預置阻斷帶。然后用一塑料袋（內徑約2.5cm）套住左全肺，并在肺門處形成反折，連同塑料袋一起用無創(chuàng)傷鉗于吸氣末阻斷左肺門根部1，2，此時潮氣量減至8.0ml/kg，呼吸頻率100次/min，其他參數(shù)不變。30min后，在反折的塑料袋加入冷生理鹽水及小冰塊，把套有塑料袋的左肺上提至切口平面（勿與周圍臟器接觸）。袋內置一溫度計使之保持在4左右。冷缺血3h后去除冷鹽水，使左肺又轉變?yōu)闊崛毖?30min后松開無創(chuàng)傷鉗，形成再灌注。同時頸靜脈給予魚精蛋白（2.43.0mg/kg）。待血壓、呼吸穩(wěn)定后（肉眼上，左肺變得紅潤，約需10min），夾閉右肺門，形成左單肺再灌注。1.1.3 大鼠肺血管內皮細胞

10、（PMVECs）的培養(yǎng)與鑒定 聯(lián)合應用鹽酸氯氨酮(20mg/kg)和安定(2mg/kg)麻醉，開胸在左心室剪一小口，從右心室注入20ml D-Hanks液(在1L去離子水中加入0.4gKCl，0.06g KH2PO4，8.0g NaCl，0.35g NaHCO3，0.08g Na2HPO412H2O，0.01g酚紅調pH 7.2)灌注心臟，使肺臟充盈變白。D-Hanks液中漂洗肺臟后，在0.1%胰酶/0.1鞹A中37消化15min，以除去上皮細胞，再以DMEM漂洗2次，小心剪取肺組織邊緣約23mm的組織并剪成1mm1mm1.5mm的小塊，加入12滴胎牛血清，接種到T25的培養(yǎng)瓶中，37CO2孵

11、箱中放置30min，加入6ml含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。1.2 檢測指標1.2.1 Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白水平變化 移植術后2h每組取移植肺，常規(guī)固定、脫水、包埋、切片，免疫組織化學染色檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白水平變化。采用SABC免疫組織化學方法。采用HMIAS-1000高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)，進行圖像灰度變換，使染色陽性面積與背景分開，并自動測量染色陽性面積。每張切片隨機選5個視野，5個視野面積作為包容空間（或參考空間），將上述檢測分子的陽性面積除以包容空間，取其均值（%）作為“陽性區(qū)域面積”?！菊磕康奶接懲庠葱曰|金屬蛋白酶(ma

12、trix metalloproteinases， MMPs)抑制劑強力霉素在移植肺缺血-再灌注 本篇論文是由3COME文檔頻道的網友為您在網絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯(lián)系我們。1.2.2 細胞凋亡的熒光Hoechst33258染色 細胞凋亡的熒光Hoechst33258染色，用0.25%胰酶消化細胞，調整細胞數(shù)為4105，離心棄上清液，細胞懸浮于100l DMEM培養(yǎng)基后，加入20l的0.5mg/ml Hoechst33258儲存液，室溫放置10min，熒光顯微鏡觀察凋亡細胞并拍片。1.3

13、 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據均以均數(shù)標準差(xs)表示，兩組間比較采用t檢驗。統(tǒng)計學處理由SPSS11.0統(tǒng)計軟件完成。P0.05為有統(tǒng)計學意義。2 結果2.1 Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白水平變化 與對照組相比，強力霉素組Bax和Caspase-3表達明顯降低(P0.01)，Bcl-2表達無明顯增高(P0.05)（表1）。表1 各組Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達（%） (xs，n=8)注:vs Con*P0.012.2 細胞核形態(tài)的Hoechst 33258熒光染色 Hoechst 33258 是與 DNA 特異結合的藍色熒光染料經熒光顯微鏡觀察， 經強力霉素對照組的細

14、胞核呈現(xiàn)均勻的紅色熒光，其細胞核邊界規(guī)則整齊，染色質均勻分布(圖 1)，對照組的PMVECs 細胞核則出現(xiàn)不均勻亮度的藍色熒光， 細胞核先后呈現(xiàn)凋亡早期(波紋狀)、中期(核染色質凝聚， 邊緣化)和晚期(核裂解， 產生凋亡小體)的典型變化，其凋亡的細胞主是肺泡上皮細胞及內皮細胞(圖2)。 3 討論缺血再灌注損傷是肺移植后早期出現(xiàn)原發(fā)性移植物功能不全（primary graft failure，PGF）的主原因，臨床主表現(xiàn)為進行性的低氧血癥，肺順應性降低，毛細血管通透性增加導致肺水腫，在X線胸片上表現(xiàn)為廣泛的肺泡密度增高影2。此外，IR可引發(fā)早期的排斥反應，并與移植后晚期較高的閉塞性支氣管炎（OB

15、）發(fā)生率相關4。因此開展移植肺IR損傷的研究對肺移植的成敗顯得尤為重。凋亡是以DNA發(fā)生特異性的片段化斷裂，形態(tài)上表現(xiàn)為核固縮、胞膜內陷、皺縮、包裹胞質形成凋亡小體為特征，受特定的基因調控。Fischer及Stammberger等都曾提出凋亡為肺缺血再灌注損傷的早期事件5，6。雖然肺缺血再灌注損傷時產生的自由基、細胞因子等是促進細胞凋亡的誘導因素，但這些因素并不直接引起細胞凋亡，而是通過一定的信號傳遞方式激活生存與死亡的相關基因(如Bcl-2、Bax、p53等)，然后將信號傳遞到核內切酶，激活Caspase-3執(zhí)行死亡功能。其中Bcl-2和Bax是兩個重的相關基因，前者抑制細胞凋亡，而后者促進

16、細胞凋亡，并且Bcl-2和Bax蛋白表達的比例是決定細胞凋亡與否的關鍵7。本實驗也證明，再灌注后肺組織細胞凋亡明顯增加，參與肺損傷作用。強力霉素能抑制在體肺缺血再灌注損傷中血管內皮細胞Bax 和Caspase-3表達，對Bcl-2的表達無明顯影響，但Bcl-2/Bax的比例明顯提高，從而發(fā)揮抗肺血管內皮細胞凋亡的作用。缺血-再灌注的損傷機制雖很復雜，但微血管完整性被破壞是其損傷的中心環(huán)節(jié)8。血管基底膜是控制微血管通透性的最重的結構。外源性基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs ）是一類以Zn2 為輔助因子的蛋白酶家族，其中MMP-2和MMP-9能降解肺毛

17、細血管基底膜的基質成分，與微血管完整性密切相關9。生理條件下，大鼠肺組織能表達低水平的proMMP-2及活性MMP-2、proMMP-9，幾乎不表達活性MMP-910。缺血、缺氧條件下能夠誘發(fā)內皮細胞、血管平滑肌細胞等分泌MMPs；同時缺血-再灌注誘發(fā)炎癥反應，此時，炎性細胞成為MMPs的重來源。強力霉素是四環(huán)素類抗生素的一種，大量研究顯示四環(huán)素類及它們經化學改良、非抗生素類似物是一類廣譜的MMP抑制劑。其參與肺缺血再灌注損傷的可能機制表現(xiàn)在以下幾個方面11：(1)抑制肺血管內皮細胞的凋亡；(2)通過清除其他細胞產生的反應性氯化物阻止MMP酶原的激活；(3)抑制其他膠原溶酶（如溶酶體酶、組織蛋

18、白酶）；(4)減少中性粒細胞浸潤至肺間質，抑制中性粒細胞脫顆粒。其機理有待進一步探討。綜合本實驗結果，缺血-再灌注肺損傷中，強力霉素通過抑制MMPs的分泌及激活，降低基底膜的降解，減輕肺水腫及炎癥反應， 抑制肺組織細胞凋亡，達到肺保護作用?！緟⒖嘉墨I】1 Thabut G，Vinatier I，stern JB，et al. Primary graft failure following lung transplantation: predictive factors of mortality. Chest，2002，121(6):1876-1882.2 Budijardjo L，Oliver

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20、risk of late bronchiolitis obliterans syndrome. Ann Thorac Surg，2002，73(4):1041-1047.5 Fischer S，Maclean AA，Liu M et al. Dynamic changes in apoptotic and necrotic cell death correlate with severity of ischemia-reperfusion injury in lung transplantation.Am J Respir Crit Care Med，2000，162(5):19321939.

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