海洋放線(xiàn)菌S1001中抗腫瘤活性成分的研究(1)

1、    海洋放線(xiàn)菌S1001中抗腫瘤活性成分的研究(1)    ： 一株來(lái)源于海泥的放線(xiàn)菌S1001發(fā)酵產(chǎn)物具有致細(xì)胞壞死活性，本文采用溶劑萃取、硅膠柱層析及制備HPLC等分離手段對(duì)該菌株發(fā)酵產(chǎn)物的活性部位進(jìn)行了活性追蹤分離，共分離得到8個(gè)化合物，通過(guò)理化性質(zhì)及波譜學(xué)手段，鑒定其結(jié)構(gòu)分別為4，5，7三羥基異黃酮(1)，4(2，4二羥基苯酰胺基)苯甲酸(2)，環(huán)(甘氨酸丙氨酸)(3)，環(huán)(甘氨酸脯氨酸)(4)，環(huán)(亮氨酸酪氨酸)(5)，環(huán)(纈氨酸亮氨酸)(6)，環(huán)(纈氨酸異亮氨酸)(7)，環(huán)(苯丙氨酸甘氨酸)(8)。

2、并用SRB法初步評(píng)價(jià)了化合物18的抗腫瘤活性，結(jié)果表明化合物4、5和7在10mol/L濃度時(shí)對(duì)K562細(xì)胞表現(xiàn)出了一定的抑制活性。關(guān)鍵詞： 海洋放線(xiàn)菌； 次級(jí)代謝產(chǎn)物； 異黃酮； 環(huán)二肽； 抗腫瘤活性    The antitumor active component from marine derived actinomycete S1001KEY WORDS Marine actinomycete; Secondary metabolites; Isoflavone; Cyclodipeptides; Antitumor activity海洋微生物由

3、于生活在高鹽、高壓及寡營(yíng)養(yǎng)的特殊環(huán)境中，具有獨(dú)特的代謝方式，因此能產(chǎn)生許多結(jié)構(gòu)新穎、活性獨(dú)特的次級(jí)代謝產(chǎn)物。近20年來(lái)，有關(guān)海洋微生物產(chǎn)生新的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的報(bào)道逐漸增多，海洋微生物作為活性物質(zhì)的新來(lái)源正日益被國(guó)內(nèi)外海洋研究工作者重視。本實(shí)驗(yàn)室以小鼠乳腺癌tsFT210細(xì)胞為活性篩選模型，對(duì)我國(guó)青島沿海采集的海泥樣品中分離純化的微生物菌株進(jìn)行篩選1，得到一株放線(xiàn)菌S1001具有壞死性細(xì)胞毒作用。為闡明它的抗腫瘤活性成分，采用活性追蹤的方法，對(duì)其發(fā)酵物進(jìn)行研究，迄今為止，共分離得到9個(gè)化合物，利用理化性質(zhì)和波譜學(xué)方法鑒定了其中8個(gè)化合物。本文著重報(bào)道化合物18的提取分離，結(jié)構(gòu)鑒定及活性研究。1

4、 材料與方法    1.1 試驗(yàn)試劑和儀器熔點(diǎn)用日本Yanaco公司MP500D型顯微熔點(diǎn)儀測(cè)定(未校正)；質(zhì)譜用QTOF ULTIMA GLOBAL GAA076 LC型質(zhì)譜儀，核磁共振譜用日本JEOL JNMECP600型核磁共振儀測(cè)定；制備用高效液相色譜儀采用日本島津公司產(chǎn)品LC6AD泵，SPDM20AVP檢測(cè)器，SCL10AV型系統(tǒng)控制器，Shinpak C18柱(20mm×250mm，5m)，4ml/min；Sephadex LH20和層析用硅膠H(1040m)分別為Pharmacia公司和青島海洋化工廠(chǎng)產(chǎn)品；活性測(cè)試采用小鼠溫敏型乳

5、腺癌tsFT210細(xì)胞；胎牛血清(FBS)和RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基分別為Hyclone公司(Cat.No.STF721)和GIBCOBRL公司產(chǎn)品?；酋Ａ_丹明B(SRB)為Sigma公司產(chǎn)品。    1.2 菌株的分離與培養(yǎng)    1.2.1 產(chǎn)生菌株 放線(xiàn)菌S1001從青島沿海的海泥中分離得到，其發(fā)酵液的總提物對(duì)小鼠乳腺癌tsFT210細(xì)胞表現(xiàn)出壞死性細(xì)胞毒活性。    1.2.2 培養(yǎng) 從28培養(yǎng)4d的高氏1號(hào)培養(yǎng)基上取適量菌體，接種于種子培養(yǎng)基(葡萄糖2%，可溶性淀

6、粉1%，豆粉0.5%，蛋白胨2%，酵母提取物0.4%，牛肉膏0.1%，K2HPO4 0.05%，CaCO3 0.2%，陳海水配制，pH值調(diào)至7.0)，于28，120r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)2d得到種子培養(yǎng)液。將該種子培養(yǎng)液按10%的接種量，接種于150瓶每瓶含100ml液體培養(yǎng)基(成分同上)的500ml三角瓶中，28，120r/min搖床培養(yǎng)5d，發(fā)酵15L。    1.3 活性測(cè)試    1.3.1生物活性測(cè)試方法 按照文獻(xiàn)2，3采用SRB(sulforhodamine B，磺酰羅丹明B)法，結(jié)合顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞

7、形態(tài)變化(順鉑做陽(yáng)性對(duì)照)。    1.3.2有效部位的確定 取發(fā)酵液1ml，減壓濃縮蒸干，然后溶于甲醇，該甲醇提取物在1mg/ml的濃度下，顯示了強(qiáng)的壞死性細(xì)胞毒抗腫瘤活性。將甲醇提取物配制成10mg/ml的蒸餾水混懸液，取混懸液三份分別加入等體積的乙酸乙酯和正丁醇萃取并測(cè)試活性。結(jié)果表明，只有乙酸乙酯萃取物具有與粗提物相應(yīng)的生物活性，故確定為有效部位。1.4 提取分離培養(yǎng)物用濾紙抽濾，分為上清液和菌絲體兩部分。上清液15L濃縮至約5L，等體積乙酸乙酯萃取三次；菌絲體先用80%丙酮提取，提取液濃縮至無(wú)丙酮后所得的水相再用等體積乙酸乙酸萃取三次，合并兩部

8、分的乙酸乙酯萃取物得總浸膏2.6g。浸膏拌硅膠過(guò)柱，以石油醚丙酮、氯仿甲醇梯度洗脫，收集各餾分，減壓濃縮、合并，得到9個(gè)色譜組份Fr1Fr6。每個(gè)組分經(jīng)活性測(cè)試，確定Fr3、Fr4和Fr6為活性組分。經(jīng)反復(fù)的正反相硅膠、Sephadex LH20柱色譜和高效制備液相色譜等分離手段，從Fr3得到化合物2(4mg)、6(11mg)，從Fr4得化合物1(5mg)、5(13mg)、7(9mg)，從Fr6得化合物3(28mg)、4(18mg)、8(10mg)。2 結(jié)果與討論    2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定化合物1 無(wú)色針晶，ESIMS(Negative)：m/z 2

9、69MH-。1HNMR(600MHz，CD3OD)：8.04(1H，s，H2)，735(2H，d，J=86Hz，H2，6)，682(2H，d，J=86Hz，H3，5)，632(1H，d，J=22Hz，H8)，620(1H，d，J=22Hz，H6)；13CNMR(150MHz，CD3OD)：1822(s，C4)，1659(s，C7)，1638(s，C5)，1597(s，C9)，1588(s，C4)，1548(d，C2)，1313(d，C2，6)，1247(s，C1)，1233(s，C3)，1162(d，C3，5)，1062(s，C10)，1001(d，C6)，947(d，C8)，參照文獻(xiàn)4確定結(jié)

10、構(gòu)為4，5，7三羥基異黃酮(4，5，7trihydroxyisoflavone)?；衔? 無(wú)色針晶，ESIMS(Positive)：m/z 274 M H 。1HNMR(600MHz，C6D5Nd5)：805(1H，d，J=86Hz，H6)，736(2H，dt，J=66，22Hz，H2，6)，693(1H，dd，J=86，22Hz，H5)，685(1H，d，J=22Hz，H3)，684(2H，dt，J=66，22Hz，H3，5)，結(jié)構(gòu)鑒定為4(2，4二羥基苯甲酰胺基)苯甲酸54(2，4dihydroxybenzamido)benzoic acid?；衔? 白色粉末，1HNMR(600MHz

11、，CD3OD)：400(1H，brq，J=69Hz，H6)，391(2H，dd，J=47，11Hz，H3)，142(3H，d，J=69Hz，CH37)；13CNMR(150MHz，CD3OD)：1716(s，C1)，1687(s，C4)，517(d，C6)，454(t，C3)，194(q，C7)，參照文獻(xiàn)6確定結(jié)構(gòu)為環(huán)(甘氨酸丙氨酸)cyclo(GlyAla)?；衔? 無(wú)色片狀結(jié)晶，1HNMR(600MHz，CD3OD)：423(1H，brt， J=82Hz， H9)， 409(1H，d，J=179Hz，H3a)，372(1H，d，J=179Hz，H3b)，348357(2H，m，H6)，2

12、29233(1H，m，H8a)，200204(1H，m，H8b)，190198(2H，m，H7)，確定結(jié)構(gòu)為環(huán)(甘氨酸脯氨酸)cyclo(GlyPro)。化合物5 無(wú)色針晶，1HNMR(600MHz，DMSOd6)：690(2H，d，J=84Hz，H2，6)，664(2H，d，J=84Hz，H3，5)，406(1H，m，H3)，344(1H，m，H6)，301(1H，dd，J=136，32Hz，H11a)，269(1H，dd，J=136，48Hz，H11b)，142(1H，m，H8)，075(1H，m，H7a)，012(1H，m，H7b)，064(3H，d，J=66Hz，CH39)，064(3

13、H，d，J=66Hz，CH310)；13CNMR(150MHz，DMSOd6)：1674(s，C4)，1662(s，C1)，1564(s，C4)，1312(d，C2，6)，1259(s，C1)，1149(d，C3，5)，557(d，C6)，522(d，C3)，437(t，C11)，377(t，C7)，229(s，C8)，228(q，C9)，213(q，C10)，參照文獻(xiàn)7確定結(jié)構(gòu)為環(huán)(亮氨酸酪氨酸)cyclo(LeuTyr)?；衔? 無(wú)色針晶，1HNMR(600MHz，CD3OD)：397(1H，brt，J=68Hz，H6)，381(1H，d，J=37Hz，H3)，230(1H，m，H11)

14、，184(1H，m，H8)，166175(2H，m，H7)，104(3H，d，J=73Hz，CH312)，094(9H，d，J=66Hz，CH39，10，13)；13CNMR(150MHz，CD3OD)：1716(s，C1)，1702(s，C4)，612(d，C3)，542(d，C6)，431(t，C7)，336(d，C11)，252(d，C8)，233(q，C9)，225(q，C10)，188(q，C12)，169(q，C13)，結(jié)合文獻(xiàn)8確定結(jié)構(gòu)為環(huán)(纈氨酸亮氨酸)cyclo(ValLeu)?；衔? 無(wú)色針晶，1HNMR(600MHz，CD3OD)：393(1H，dd，J=94，47Hz

15、，H6)，376(1H，dd，J=40，13Hz，H3)，221(1H，m，H11)，185(1H，m，H7)，173(1H，m，H8a)，159(1H，m，H8b)，104(3H，d，J=73Hz，CH310)，096(3H，d，J=60Hz，CH312)，095(3H，d，J=44Hz，CH39)，094(3H，d，J=60Hz，CH313)，結(jié)合文獻(xiàn)7確定為環(huán)(纈氨酸異亮氨酸)cyclo(ValIle)。化合物8 無(wú)色針晶，1HNMR(600MHz，DMSOd)：725729(3H，m，H2，4，6)，717(1H，d，J=80Hz，H3，5)，406(1H，dd，J=73，47Hz，H

16、6)，334(1H，dd，J=172，29Hz，H3a)，309(1H，dd，J=132，47Hz，H7a)，287(1H，dd，J=132，47Hz，H7b)，274(1H，d，J=172Hz，H3b)，結(jié)合文獻(xiàn)8并與實(shí)驗(yàn)室已有樣品對(duì)照確定結(jié)構(gòu)為環(huán)(苯丙氨酸甘氨酸)cyclo(PheGly)(Fig.1)。            作者：劉睿 朱天驕 朱偉明 李冬 崔承彬，顧謙群 【關(guān)鍵詞】海洋放線(xiàn)菌；,次級(jí)代謝產(chǎn)物；,異黃酮；,環(huán)二肽；,抗腫瘤  

17、60;      本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。        2.2 抗腫瘤活性采用SRB法并結(jié)合顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，測(cè)定了化合物18對(duì)人慢性髓原白血病細(xì)胞K562腫瘤細(xì)胞的抑制活性，結(jié)果表明環(huán)二肽類(lèi)化合物4、5和7在10mol/L時(shí)即能觀(guān)查到細(xì)胞壞死活性，抑制率分別為15.4%、19.3%和18.6%，

18、其他化合物在100mol/L高濃度時(shí)也未檢測(cè)到相關(guān)活性。    3 討論本文采用活性追蹤的方法從一株海洋放線(xiàn)菌S1001的活性部位分離鑒定了1個(gè)異黃酮類(lèi)化合物，1個(gè)苯甲酸類(lèi)衍生物，以及6個(gè)環(huán)二肽類(lèi)化合物，并經(jīng)活性測(cè)試闡明了環(huán)二肽類(lèi)化合物為該菌株的主活性相關(guān)成分。文獻(xiàn)報(bào)道也顯示環(huán)二肽類(lèi)化合物可作為免疫功能調(diào)節(jié)劑和抗腫瘤制劑，并且體內(nèi)體外試驗(yàn)證明均有效9，10，值得進(jìn)一步研究。菌株S1001的次級(jí)代謝產(chǎn)物比較單一，主為環(huán)二肽類(lèi)化合物且產(chǎn)量較大，因此可以考慮作為環(huán)二肽的生產(chǎn)菌株加以利用。參考文獻(xiàn)    1 Zhu T J

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