補骨脂素加長波紫外線誘導(dǎo)HL-60、NB4細(xì)胞凋亡時對線粒體膜電位的影響

1、補骨脂素加長波紫外線誘導(dǎo)HL-60、NB4細(xì)胞凋亡時對線粒體膜電位的影響         10-02-02 09:59:00     編輯：studa20              作者：陳楠楠，張晨，王偉，張德杰，向陽，黃世林【摘要】  目的 研究補骨脂素（PSO）加長波紫外線（UVA）光化學(xué)療法（PUVA）誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞HL-60、

2、NB4凋亡時對線粒體膜電位（m）的影響。方法 細(xì)胞與不同濃度PSO，接受或不接受UVA照射后共同培養(yǎng)，電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，流式細(xì)胞儀（FCM）檢測細(xì)胞凋亡率和線粒體膜電位變化，采用多因素方差分析法進行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果 PUVA處理后的HL-60、NB4細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變； PSO、UVA照射及PUVA均可使細(xì)胞凋亡率增加，m下降，PUVA的作用顯著強于前兩者（P<0.01）。結(jié)論 PUVA可誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡，誘導(dǎo)凋亡的途徑之一為下調(diào)線粒體膜電位水平。 【關(guān)鍵詞】  光化學(xué)療法；白血?。?HL-60細(xì)胞；NB4細(xì)胞；凋亡；線粒體膜電位 

3、   Abstract： Objective  To study the effects of psoralen (PSO) plus ultraviolet A (PUVA) on mitochondrial membrane potential in HL-60 and NB4 cells.Methods  Cells were incubated with PSO in different concentrations irradiated with or without UVA. The changes in cellular ultrastru

4、cture were observed under electron microscope. The apoptosis ratios and the changes of mitochondrial membrane potential were detected through flow cytometry. The factorial design and analysis of variance were used to analyze the interaction among the factors.Results  There were obvious ultrastr

5、ucture changes in apoptosis in HL-60 and NB4 cells after treatment with PUVA. PSO, UVA and PUVA all increased the apoptosis ratios and decreased the mitochondrial membrane potential, and the effects of PUVA were stronger than any of the others (P<0.01).Conclusion  PUVA can induce the apoptos

6、is of HL-60 and NB4 cells and one of the pathways to induce apoptosis is to downregulate the mitochondrial membrane potential.    Key  words： PUVA; leukemia; HL-60 cell; NB4 cell; apoptosis; mitochondrial membrane potential    補骨脂素(psoralen，PSO)是中藥補骨脂種子中的主要成分，又稱呋喃香

7、豆素，具有光敏性質(zhì)與抗腫瘤活性。PUVA是補骨脂素加長波紫外線光化學(xué)療法，研究表明PUVA對人白血病細(xì)胞HL-60、K562、NB4均有一定的殺傷作用1，但其作用機制尚不清楚，本試驗擬探討PUVA對人白血病細(xì)胞HL-60、NB4細(xì)胞凋亡的作用及部分作用機制，為PUVA的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。    1  材料與方法    1.1  細(xì)胞株  人急性髓細(xì)胞白血?。‵AB-M2）HL-60細(xì)胞由大連醫(yī)科大學(xué)惠贈；人急性髓細(xì)胞白血?。‵AB-M3）NB4細(xì)胞由上海血液學(xué)研究所陳竺院士惠贈。  

8、;  1.2  藥品及主要試劑  補骨脂素由大連理工大學(xué)及我院共同從純中藥補骨脂中提取和制備。二甲基亞砜（DMSO）購自北京化工廠。RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清為Gibco產(chǎn)品。小牛血清系杭州四季青生物材料工程公司產(chǎn)品。JC-1為Molecular Probe公司產(chǎn)品。    1.3  儀器和設(shè)備  流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司，GLY-10型光量子血液平衡治療儀由徐州華衛(wèi)醫(yī)療設(shè)備公司研制。    1.4  細(xì)胞培養(yǎng)  HL-60、NB4細(xì)胞分別常規(guī)培養(yǎng)于

9、含10%小牛血清及10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基（含硫酸慶大霉素0.025 U/ml）中，于37 、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中進行連續(xù)培養(yǎng)。    1.5  透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特點  收集濃度為5.0×105/ml，經(jīng)PUVA處理的HL-60、NB4細(xì)胞10 ml，用PBS清洗2次，轉(zhuǎn)入2.0 ml 離心管，離心（2 000 r/min）3 min，棄上清，緩緩加入2.5%戊二醛2 ml，4 冰箱靜置2 h 以上。磷酸緩沖液沖洗，鋨酸固定，水洗、脫水，浸透、包埋，制定超薄切片，透射電鏡下觀察。  &

10、#160; 1.6  流式細(xì)胞術(shù)測定PUVA 24 h 后細(xì)胞的凋亡情況  取濃度為4.0×105/ml，處于對數(shù)生長期的HL-60、NB4細(xì)胞株5 ml，分別加入補骨脂素0，5，10，20，40 l，使其在反應(yīng)體系中的終濃度分別為0，10，20，40，80 mg/L，放入石英比色皿中，在GLY-10型光量子血液平衡治療儀（=360 nm）上以1J/m2輻射量邊照射邊震蕩，照射時間分別為0 min，5 min。處理后各實驗組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，收集5.0×105細(xì)胞，用PBS洗2次，棄上清，加入100  l 碘化丙啶（PI）染液，避光反應(yīng)

11、30 min，加入PBS 400 l，上機檢測，并用Multicycle軟件分析得出相應(yīng)的細(xì)胞凋亡百分率。    1.7  流式細(xì)胞術(shù)測定PUVA 24 h 后細(xì)胞線粒體膜電位的變化情況  試驗分組及處理方法同前。 收集1×106個細(xì)胞， 重懸于1 ml PBS中， 加入200 mol  JC-1 10 l， 37 、 5%CO2孵育1530 min， 2 ml PBS洗1次， 室溫下離心（1 000 r/min）3 min，棄上清，加500 l PBS，輕搖試管使細(xì)胞重懸，上機檢測，用50 mmol CCCP 1 l，37

12、 孵育5 min，進行熒光標(biāo)準(zhǔn)補償。    1.8  統(tǒng)計學(xué)方法  所有實驗結(jié)果均來自至少3組平行或3次重復(fù)實驗。各種計量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用多因素方差分析；所有統(tǒng)計計算均用SPSS11.5 統(tǒng)計軟件進行，P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。     10-02-02 09:59:00     編輯：studa20    2  結(jié) 果    2.1 

13、透射電鏡下觀察PUVA后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變  HL-60、NB4細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞體積縮小，胞漿濃縮，胞核體積減小，可裂解成一個或數(shù)個致密體，可見核小體碎裂，核染色質(zhì)聚集或邊集，部分染色質(zhì)致密成斑塊狀或沿核膜收縮成新月體狀，整個細(xì)胞可裂解成大小不一的凋亡小體。    2.2  PUVA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用  應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測PUVA后24 h HL-60、NB4細(xì)胞凋亡率，見表1、2。表1  PUVA 后24 h HL-60細(xì)胞凋亡率表2  PUVA 后24 h NB4細(xì)胞凋亡率與0 min 0 mg/L比較，P<

14、0.01;與0 min 同濃度比較，P<0.01    2.3  PUVA對HL-60、NB4細(xì)胞線粒體膜電位的影響  應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測PUVA后24 h 細(xì)胞線粒體膜電位相對熒光強度的變化，見表3、4。表3  PUVA后24 h HL-60細(xì)胞線粒體膜電位的變化表4  PUVA后24 h NB4細(xì)胞線粒體膜電位的變化與0 min 0 mg/L比較，P<0.01;與0 min 同濃度比較，P<0.01    3  討論    PSO具有

15、抗腫瘤、抗白血病的作用，同時又具有光敏活性25，波長范圍在320360 nm 之間的紫外光照射，可激發(fā)PSO的動力效應(yīng)，從而增強其抗腫瘤及抗白血病的作用。電鏡和流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，PUVA可誘導(dǎo)HL-60、NB4白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡。與對照組（0 min 0 mg/L）相比，單純PSO和UVA，以及PUVA均可增加細(xì)胞凋亡率，但多因素方差分析結(jié)果顯示PUVA的作用要顯著強于前兩者，也再一次證明了PSO的光敏效應(yīng)。    線粒體是細(xì)胞內(nèi)ATP的主要生產(chǎn)中心，線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，m）是由于線粒體內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子

16、及其他離子不平衡而形成的，是保持線粒體功能所必需的。在線粒體內(nèi)、外膜交界處存在一種蛋白性孔道，即膜滲透性轉(zhuǎn)換通道(permeability transition pore，PTP)，多種刺激如氧化應(yīng)激、超負(fù)荷、再灌注損傷等均可造成PTP開放6，引起線粒體膜電位的下降，呼吸鏈斷裂，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和死亡。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)PSO、UVA和PUVA處理的HL-60、NB4細(xì)胞線粒體膜電位均有下降，且統(tǒng)計分析結(jié)果顯示PUVA對細(xì)胞線粒體膜電位的影響最強，提示PUVA在誘導(dǎo)HL-60、NB4細(xì)胞凋亡的過程中可能影響了PTP的開放，下調(diào)了細(xì)胞線粒體膜電位水平?！緟⒖嘉墨I】  1 陳楠楠，黃世林，張

17、德杰，等.補骨脂素加長波紫外線對人白血病細(xì)胞株NB4、HL-60、K562作用的研究J.中國中醫(yī)急癥，2007，16（4）：444-446.2 吳少華，張仲海，趙建斌.補骨脂素體內(nèi)外抗癌活性的實驗研究J.中國中藥雜志，1998，23（5）：303-305.3 Garneiro LV, Ferreira SR, Chen CL, et al. Psoralen derivatives and longwave ultraviolet irradiation are active in vitro against human melanoma cell lineJ. J Photochem Pho

18、tobiol B, 2004, 76(1-3):49-53.4 Plumas J, Drillat P, Jacob MC, et al. Extracorporeal photochemotherapy for treatment of clonal T cell proliferationsJ. Bull Cancer, 2003, 90(8-9):63-70.5 Effect T, Fabry U, Osieka R, et al. Induction of apoptosis, depletion of glutathione, and DNA damage by extracorporeal photochemotherap