氮酮促進(jìn)脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞及毒性的實驗研究

1、氮酮促進(jìn)脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞及毒性的實驗研究【摘要】目的 探討氮酮（）促進(jìn)脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞的作用及其對細(xì)胞活性的影響。方法 采用細(xì)胞培養(yǎng)方法,利用綠色熒光蛋白基因做報告基因,配制不同轉(zhuǎn)染液，脂質(zhì)體聯(lián)合、氮酮聯(lián)合脂質(zhì)體及、氮酮聯(lián)合 、單純、單純脂質(zhì)體、單純氮酮，分別處理兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)。用方法檢測表達(dá)情況。采用法研究不同轉(zhuǎn)染液對細(xì)胞活性的影響。結(jié)果 單純氮酮、單純脂質(zhì)體及對照組處理的細(xì)胞不表達(dá)綠色熒光蛋白。氮酮聯(lián)合脂質(zhì)體及 對兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為.，脂質(zhì)體聯(lián)合 組的轉(zhuǎn)染效率為.，氮酮聯(lián)合PEGFP-N1組的轉(zhuǎn)染效率為

2、7.2%，單組質(zhì)粒組的轉(zhuǎn)染效率為。氮酮加脂質(zhì)體加組轉(zhuǎn)染效率高于其他轉(zhuǎn)染組（ .）。各組轉(zhuǎn)染液對角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性無影響。結(jié)論 氮酮可促進(jìn)脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞,在有效的轉(zhuǎn)染濃度下對細(xì)胞無明顯毒性，有望成為促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的新型試劑。 【關(guān)鍵詞】 氮酮；角膜；內(nèi)皮細(xì)胞；脂質(zhì)體；基因轉(zhuǎn)染 AO c, I g， HANG , , , China, To study azone-promoting plasmid DNA transfection mediated with liposome and its influence on rabbit corneal endothelia

3、l cells (CECs). Methods The following types of transfection agents were dispensed: liposome+ DNA plasmid pEGFP-N1, azone + liposome + pEGFP-N1, azone+ pEGFP-N1, pEGFP-N1, liposome only and azone only. Rabbit corneal endothelial cells were treated with the previously listed agents. A green fluorescen

4、ce protein (GFP) gene as a report gene was detected by fluorescence microscopy, and EGFP mRNA expression was assessed by RT-PCR. The various transfection agents were added to the culture medium to test their influence on cell vitality using the MTT method. Results GFP was not detected in corneal end

5、othelial cells treated with liposome or azone agents alone. The transfection rate of GFP was 42.6% in corneal endothelial cells treated with the agent azone + liposome + pEGFP-N1. With liposome + pEGFP-N1, the rate of transfection in corneal endothelial cells was 22.4 %. The expression of GFP was 7.

6、2 % in corneal endothelial cells treated with azone + pEGFP-N1. With the agent azone + liposome + pEGFP-N1, a high transfection rate of the GFP gene was obtained. And no significant influence on the vitality of corneal endothelium cells was observed. Conclusion Azone may enhance the transfection rat

7、e of plasmid DNA mediated with liposome. Azone had no inhibitory effect on CECs in vitro with sufficient concentrations and may be a new agent for gene transfection. a; c; e ; l; 氮酮是近年來開發(fā)的一種可以促進(jìn)藥物皮膚通透性的化學(xué)試劑，其作用機(jī)制是使細(xì)胞脂質(zhì)層開裂，有利于藥物通過。以往研究表明，低濃度的氮酮即可使細(xì)菌細(xì)胞膜溶解，因此具有殺滅細(xì)菌的作用。與此相類似的現(xiàn)象為電子穿孔現(xiàn)象，其原理是通過制造暫時開放的細(xì)胞膜裂孔

8、，介導(dǎo)外源基因向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)入，因此氮酮有可能在促進(jìn)眼部藥物通透性和基因轉(zhuǎn)染方面發(fā)揮作用。本研究采用體外實驗的方法，觀察水溶性氮酮對脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞的情況及其對細(xì)胞活性的影響，旨在為氮酮在基因轉(zhuǎn)染方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 材料和方法 動物和試劑 清潔級新西蘭大白兔，同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。主要試劑：水溶性氮酮（湖北襄西化學(xué)工業(yè)有限公司）； （美國 公司）；（美國公司）；培養(yǎng)基及胎牛血清（美國公司）；質(zhì)粒快速提取試劑盒（中國博大泰克公司）。 方法 . 角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 揭膜法取材，撕下帶有內(nèi)皮細(xì)胞的后彈力層， 剪切成 大小組織塊，內(nèi)皮面向上置于培養(yǎng)皿中，加培養(yǎng)液，置于，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)

9、。原代培養(yǎng)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞，每日換液一次，融合后采用.胰蛋白酶消化傳代。 . 質(zhì)粒制備： 轉(zhuǎn)化大腸桿菌，卡那霉素（ ?滋） 篩選陽性菌落，培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒提取基因。所得質(zhì)粒 為.，含量為. ?滋?滋。 . 氮酮配制 以無血清的培養(yǎng)基充分溶解氮酮，使其濃度為. /，室溫避光保存。 . 實驗分組 ?譹?訛脂質(zhì)體 。?譺?訛氮酮脂質(zhì)體 。?譻?訛氮酮 。?譼?訛單純。?譽(yù)?訛單純氮酮。?譾?訛單純脂質(zhì)體。?譿?訛無血清為對照組。 . 轉(zhuǎn)染細(xì)胞 取第第代細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前分別將個角膜內(nèi)皮細(xì)胞接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞生長至融合。脂質(zhì)體 的轉(zhuǎn)染按試劑說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染前用無血清 洗滌細(xì)胞兩次，每

10、種細(xì)胞分別加入上述不同轉(zhuǎn)染液，其中脂質(zhì)體與質(zhì)量比為 ?滋脂質(zhì)體 ?滋 質(zhì)粒，組中氮酮濃度為. /L，體積為 ，與細(xì)胞作用時間均為 min，將氮酮清除干凈，洗滌細(xì)胞兩次，再加入質(zhì)?；蛑|(zhì)體與復(fù)合物。、 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) ，吸去培養(yǎng)液，加入正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 。 以上各孔重復(fù)3次，以排除實驗偶然性的影響 . 熒光顯微鏡觀察及轉(zhuǎn)染效率測定 于倒置熒光顯微鏡下觀察、計數(shù)發(fā)綠色熒光細(xì)胞數(shù)， 每孔取個視野，取其平均值計算轉(zhuǎn)染效率，計算公式為:細(xì)胞轉(zhuǎn)染率（綠色熒光細(xì)胞數(shù) 細(xì)胞總數(shù)）。.胰蛋白酶消化成單細(xì)胞， 液漂洗， 離心 ，重懸于液中，用流式細(xì)胞儀檢測 陽性細(xì)胞的百分率。 . 法檢測細(xì)胞毒性 實驗分組同細(xì)胞

11、轉(zhuǎn)染，增加不接種細(xì)胞的無血清作為空白調(diào)零組，第組作為對照組。將第第代細(xì)胞按每孔個細(xì)胞接種于孔板中，待細(xì)胞長滿至?xí)r轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染液的配制及轉(zhuǎn)染步驟同上，孔板每孔轉(zhuǎn)染液量為6孔板的。轉(zhuǎn)染 后，用微量注液器每孔加入 ，孵育 后將各孔的液體輕輕吸出，再加入二甲基亞砜 。 孔培養(yǎng)板在振蕩器上振蕩 ，以空白調(diào)零組調(diào)零，用酶標(biāo)儀測定 nm波長上每孔的吸光度值。實驗重復(fù)次取平均值。 . 采用說明書 逆轉(zhuǎn)錄酶標(biāo)準(zhǔn)體系， 反應(yīng) 。其中 的上游引物序列為， 下游引物序列為， 擴(kuò)增片段長度 。設(shè)為內(nèi)參照， 上游引物序列:，下游引物序列: ， 擴(kuò)增片段長度 。 擴(kuò)增采用 反應(yīng)體系，內(nèi)含 ，引物 ， ， ， ， ，酶. 。按

12、下述條件進(jìn)行循環(huán): ， ， ， ；擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，觀察并記錄結(jié)果。 . 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用 . 統(tǒng)計軟件， 用?字檢驗對比分析不同組間轉(zhuǎn)染效率，比色法采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。 結(jié)果 . 不同轉(zhuǎn)染液的轉(zhuǎn)染效率 經(jīng)不同轉(zhuǎn)染液處理，兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)粒 的轉(zhuǎn)染效率（見圖1）：在組加轉(zhuǎn)染液（見轉(zhuǎn)染液配制） 處理的細(xì)胞中均可檢測到綠色熒光蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)染效率分別為：轉(zhuǎn)染液?譹?訛組.，轉(zhuǎn)染液?譺?訛組.，轉(zhuǎn)染液?譻?訛組為.，轉(zhuǎn)染液?譼?訛組只有，其他各組轉(zhuǎn)染液處理的細(xì)胞，結(jié)果均無綠色熒光蛋白表達(dá)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué) 檢驗可知，.，.，各組不同轉(zhuǎn)染液的轉(zhuǎn)染效率差異有顯著性。氮酮加脂質(zhì)體加 組轉(zhuǎn)染效率

13、最高。 . 法檢測細(xì)胞毒性 各組轉(zhuǎn)染角膜內(nèi)皮細(xì)胞后，細(xì)胞的生長形態(tài)正常。實驗組與對照組間角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性差別無顯著性（.）（見表）。 . 半定量檢測結(jié)果（見圖）顯示， 組、質(zhì)粒氮酮組未檢測到表達(dá)，而質(zhì)粒脂質(zhì)體組和氮酮質(zhì)粒脂質(zhì)體組均檢測到表達(dá)， 轉(zhuǎn)染液?譺?訛組所得細(xì)胞的 的條帶明顯亮于轉(zhuǎn)染液?譹?訛組。 討論 角膜內(nèi)皮細(xì)胞正常的密度和功能是維持角膜透明的關(guān)鍵，細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、病理學(xué)等各方面的研究表明成人的角膜內(nèi)皮細(xì)胞在體內(nèi)幾乎沒有增殖的能力，。當(dāng)細(xì)胞密度低于個就會出現(xiàn)內(nèi)皮功能失代償，導(dǎo)致大泡性角膜病變。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)使得促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖成為可能。 基因轉(zhuǎn)移根據(jù)所用的載體不同分為病

14、毒和非病毒兩類方法。陽離子脂質(zhì)體屬于非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法，其優(yōu)點是毒性低、安全，它的缺點是轉(zhuǎn)染效率較低，因此限制了其應(yīng)用價值。 氮酮的化學(xué)名稱為：正十二烷基氮雜環(huán)庚烷酮，在低濃度時能極大增強(qiáng)不論是親水性或是疏水性化合物的透皮作用。同時，由于氮酮對細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的溶解作用，它還有對菌及芽孢的抑菌作用。目前雖然氮酮尚未在眼科領(lǐng)域做臨床應(yīng)用，但國內(nèi)外已有動物實驗研究初步證明一定濃度的氮酮對細(xì)胞無毒性作用。張虹等研究發(fā)現(xiàn)：. /氮酮使角膜內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變細(xì)胞膜表面產(chǎn)生暫時性裂隙，與電穿孔轉(zhuǎn)染基因的作用機(jī)制相類似，由此推測氮酮有望用于基因轉(zhuǎn)染的研究。 本研究在將氮酮應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)染實驗之前，就

15、不同氮酮濃度對角膜內(nèi)皮細(xì)胞、小梁細(xì)胞以及晶狀體上皮細(xì)胞增殖活性與形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響進(jìn)行了大量的研究，。結(jié)果證實濃度. /以下氮酮對角膜內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)無影響，濃度. /以下氮酮直接作用于角膜內(nèi)皮細(xì)胞在 內(nèi)是安全的。隨著氮酮濃度的升高，細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)改變，在濃度. /以上可抑制細(xì)胞增殖，使細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變性，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 根據(jù)以上研究，我們在轉(zhuǎn)染實驗中氮酮采用的濃度為. /，考慮到脂質(zhì)體和氮酮對細(xì)胞活性均有一定影響，我們用法測定了各組轉(zhuǎn)染液對角膜內(nèi)皮細(xì)胞的毒性影響，結(jié)果顯示：水溶性氮酮在濃度. /L以下作用 min而后按常規(guī)轉(zhuǎn)染，與對照組及無氮酮轉(zhuǎn)染液組相比較， 下的值無統(tǒng)計學(xué)意

16、義，說明一定濃度的氮酮和脂質(zhì)體組成的聯(lián)合轉(zhuǎn)染試劑對角膜內(nèi)皮細(xì)胞的生長無明顯毒性。 轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果表明，以濃度為. /的氮酮處理角膜內(nèi)皮細(xì)胞 min后，清除氮酮，再加入脂質(zhì)體包被的含綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒，角膜內(nèi)皮細(xì)胞不但可以表達(dá)綠色熒光蛋白，而且轉(zhuǎn)染效率也有提高。原因可能是：當(dāng)?shù)c角膜內(nèi)皮細(xì)胞作用后，引起角膜內(nèi)皮細(xì)胞胞膜的脂質(zhì)層松動及開裂，有利于脂質(zhì)體與胞膜的融合，從而促進(jìn)外源基因進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，提高轉(zhuǎn)染效率。由于氮酮在細(xì)胞表面產(chǎn)生的是瞬時裂孔，因此清除氮酮和加入脂質(zhì)體復(fù)合物之間的時間應(yīng)盡量縮短。 以上結(jié)論通過半定量分析也得到了證實。氮酮聯(lián)合脂質(zhì)體及組，脂質(zhì)體聯(lián)合組中 均有較高的表達(dá)，而在質(zhì)粒組，以及質(zhì)粒氮酮組中卻未檢測到其表達(dá)。這可能與轉(zhuǎn)染入細(xì)胞的質(zhì)粒量過少， 而導(dǎo)致提取的 含量偏少，而且在操作過程中很快降解有關(guān) 從上述的研究中我們認(rèn)為，適當(dāng)濃度的氮酮有促進(jìn)脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染的作用，且對細(xì)胞的活性無影響。 它對角膜內(nèi)皮細(xì)胞的高效安全的轉(zhuǎn)染提示在眼科的基因治療中， 氮酮將有廣泛的應(yīng)用前景?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 ， ， ， et al. . ，（）：. 張虹，李貴剛，謝二娟，等. 水溶性氮酮對體外培養(yǎng)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性及超微結(jié)構(gòu)的影響. 醫(yī)藥導(dǎo)報， ，（）：. ngelmann ， ednarz J， al