大腸癌前哨淋巴結(jié)定位切除及其微轉(zhuǎn)移檢測(cè)

1、大腸癌前哨淋巴結(jié)定位切除及其微轉(zhuǎn)移檢測(cè)作者：張敏, 譚最， 菅志遠(yuǎn)， 江斌， 蘭明銀， 曾少波， 李恒， 王耕 摘要 目的：探討大腸癌前哨淋巴結(jié)定位切除及檢測(cè)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的方法，并分析其臨床意義。方法：對(duì)60例大腸癌患者采用亞甲藍(lán)染法淋巴結(jié)示蹤，尋找染色的前哨淋巴結(jié),切除后行HE染色和細(xì)胞角蛋白20免疫組織化學(xué)檢測(cè),并與前期直接行淋巴結(jié)清掃的60例患者對(duì)比。 結(jié)果：60例中可識(shí)別前哨淋巴結(jié)者54例,檢出率為90.0%，高于前期直接清掃組的24例(40%)(P<0.05);其中常規(guī)HE染色檢出36例陽(yáng)性，18例前哨淋巴結(jié)陰性者應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)，6例檢出有微轉(zhuǎn)移灶,其陽(yáng)性率大大高于對(duì)照組

2、(P<0.05)。結(jié)論：聯(lián)合應(yīng)用亞甲藍(lán)和細(xì)胞角蛋白20進(jìn)行大腸癌前哨淋巴結(jié)定位優(yōu)于單用其中一種方法;免疫組化方法是檢測(cè)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的敏感方法;前哨淋巴結(jié)定位和微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)對(duì)大腸癌的治療有重要意義。 關(guān)鍵詞 大腸癌;淋巴結(jié)示蹤;前哨淋巴結(jié);微轉(zhuǎn)移 Lymphatic Mapping，Sentinel Node Biopsy and Micro-metastasis Detection in the Patients with Colorectal Cancer and their Clinical Significance ZHANG Min,TAN Zui,JIAN Zhi-yuan,J

3、IANG Bin,LAN Ming-yin,ZENG Shao-bo,LI Heng,WANG Geng (Department of General Surgery,Zhongnan Hospital,Wuhan University,Wuhan,Hubei 430072;Department of General Surgery, Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China) Abstract: Objectives To identify the sentinel lymph nodes(SLN)in

4、patients with colorectal cancer and evaluate their clinical significance.Methods Sixty patients with colorectal cancer underwent lymphatic mapping using methylene blue staining,the SLN was identified and removed,the micro-metastases in sentinel lymph node were also detected with HE and immunohistoch

5、emical staining technique.Results Fifty-four SLN were successfully identifed in sixty patients,with a detection rate 90.0%,higher than that of control group;thirty-six positive SLN were dectected by HE staining,six micro-metastases in Sentinel lymph node were found in eighteen negative SLN with Cyto

6、keratin 20 immuno-histochemical staining. Conclusion The success rate achieved by combining methylene blue staining and cytokeratin 20 immunohistochemical staining is higher than that by using either technique alone;immunohistochemical assay is a sensitive way to detect micrometastases in lymph node

7、s,and this may have clinical significance for the treatment of colorectal cancer. Key words: Colorectal cancer; Lymph nodes trace; Sentinel lymph node; Micrometastasis 周?chē)馨徒Y(jié)的轉(zhuǎn)移情況直接關(guān)系到腫瘤的病理分期、預(yù)后判斷和術(shù)后輔助治療方案的選擇。傳統(tǒng)的大腸癌前哨淋巴結(jié) (Sentinel lymph node，SLN) 活檢可能會(huì)將已有轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)遺漏在切除的標(biāo)本或體內(nèi)，而無(wú)法檢出淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移灶(1ymph node micr

8、ometastasis，LNMM)1;細(xì)胞角蛋白(Cytokeratinl 20,CK20)作為細(xì)胞骨架廣泛分布于胃腸上皮組織及其來(lái)源的腫瘤組織胞漿中,在大腸癌中高度表達(dá)2。如何聯(lián)合應(yīng)用這兩種方法對(duì)前哨淋巴結(jié)進(jìn)行準(zhǔn)確定位，并了解陰性淋巴結(jié)的微轉(zhuǎn)移情況，本文應(yīng)用亞甲藍(lán)在術(shù)中對(duì)大腸癌進(jìn)行前哨淋巴結(jié)的示蹤和定位，并結(jié)合CK20免疫組化法(Immunothistochemical,IHC)對(duì)其進(jìn)行淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移LNMM檢測(cè)，以探討SLN在大腸癌的臨床意義。 1 資料和方法 1.1 臨床資料2004年10月-2006年6月在我院住院行腫瘤切除手術(shù)的大腸癌患者60例為亞甲藍(lán)組，其中男性36例，女性24例，年

9、齡3278歲，平均年齡55歲。部位：升結(jié)腸癌16例，橫結(jié)腸癌4例，降結(jié)腸癌14例，乙狀結(jié)腸癌20例，直腸上段癌6例。病理分型：高分化腺癌20例，中分化腺癌26例，低分化腺癌14例。另以2005年之前未行亞甲藍(lán)顯影的60例大腸癌患者做對(duì)照組，兩組患者在年齡、性別以及腫瘤部位之間無(wú)明顯差別。 1.2 試劑所用亞甲藍(lán)系江蘇濟(jì)川制藥集團(tuán)公司生產(chǎn),批號(hào)H32024827，安瓿瓶裝，2 ml/支,濃度1%(20 mg/2 ml)。細(xì)胞角蛋白抗體(CK20 鼠抗人，即用型)、抗原修復(fù)液及SP試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物制品公司。 1.3 方法60例患者在全麻下手術(shù)，開(kāi)腹探查腹腔，證實(shí)無(wú)腹腔以及肝臟廣泛轉(zhuǎn)移后，距

10、腫瘤邊緣11.5 cm上下左右四點(diǎn)，在腸壁粘膜下層及漿肌層分別注射亞甲藍(lán)染色劑0.5 ml，共計(jì)2 ml，注射完畢1020 min后開(kāi)始手術(shù)根治。凡術(shù)中被藍(lán)染的淋巴結(jié)均確定為SLN，切除后送檢行HE染色，如結(jié)果陰性，則用細(xì)胞角蛋白抗體(CK20，鼠抗人)行免疫組化(IHC)檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒操作。結(jié)果判斷：CK20以胞漿黃染為陽(yáng)性。對(duì)照組行常規(guī)SLN辨認(rèn)、清掃，病理學(xué)檢驗(yàn)方法同亞甲藍(lán)組。 1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均采用四格表2檢驗(yàn),用SPSS 13.0軟件完成統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以P<0.05有顯著性差異。 2 結(jié)果 2.1 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分析對(duì)照組(未行亞甲藍(lán)示蹤)60例大腸癌患者術(shù)中

11、共取得淋巴結(jié)874枚。HE染色發(fā)現(xiàn)22例SLN轉(zhuǎn)移，CK20檢測(cè)又發(fā)現(xiàn)2例，共有24例(40%)患者為陽(yáng)性。 亞甲藍(lán)組60例大腸癌患者中，共取得淋巴結(jié)812 枚，54例發(fā)現(xiàn)SLN，檢出率為90.0%，高于前期直接清掃組的24例(40%)(P<0.05)。經(jīng)HE染色則發(fā)現(xiàn)有36例出現(xiàn)SLN微轉(zhuǎn)移,檢出率為66.67%(36/54)，18例未發(fā)現(xiàn)。但用CK20作組化染色檢測(cè)又發(fā)現(xiàn)6例患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶,故SLN陽(yáng)性患者增至42例,占總檢測(cè)患者的77.78%(42/54)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，兩者在陽(yáng)性率方面存在顯著差異(P<0.05)，見(jiàn)表1。 2.2 SLN形態(tài)學(xué)變化對(duì)各組送檢的SLN，

12、肉眼觀察淋巴結(jié)被藍(lán)染，HE染色可見(jiàn)轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)藍(lán)染，大腸癌細(xì)胞CK20染色時(shí)胞漿呈黃色，以周邊部最顯著(如圖1、圖2)。 表1 大腸癌亞甲藍(lán)示蹤前哨淋巴結(jié)腫瘤一般情況分析(略) 3 討論 大腸癌是胃腸道常見(jiàn)的惡性腫瘤。癌細(xì)胞在腹腔內(nèi)、淋巴結(jié)、骨髓及外周血中的微轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致大腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要因素3。前哨淋巴結(jié)SLN是惡性腫瘤淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的第一站淋巴結(jié)，有學(xué)者認(rèn)為大腸癌淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移亦遵循這一模式4，正確識(shí)別、判斷淋巴轉(zhuǎn)移程度并合理清掃就顯得十分重要。但臨床上對(duì)腫瘤淋巴結(jié)切除往往是根據(jù)術(shù)者自己的經(jīng)驗(yàn)估計(jì)清掃的部位和范圍,受各種主觀、客觀因素的影響其準(zhǔn)確性并不高。這種盲目性可能導(dǎo)致雖然清掃了大

13、量的淋巴結(jié)，而有轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)未被清掃或未完全清掃。因此識(shí)別SLN對(duì)于確定合理術(shù)式有非常重要的意義,而淋巴結(jié)顯像技術(shù)(sentinel lymph node mapping,SLNM)對(duì)于尋找那些最早被轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)有很高的準(zhǔn)確性。SLNM對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的定位和示蹤有三種方法：藍(lán)染法、同位素法和聯(lián)合法。后二者檢出率較高,但需設(shè)備特殊,價(jià)格昂貴,有放射污染危險(xiǎn)。藍(lán)染法常用的染料是亞甲藍(lán),能較久地維持淋巴結(jié)藍(lán)染狀態(tài)(可達(dá)6 h),其通過(guò)淋巴管擴(kuò)散速度快，往往在瘤體注射后30 min之內(nèi)即可擴(kuò)散至腫瘤周?chē)牧馨徒Y(jié)，因此并不增加手術(shù)時(shí)間;且具有無(wú)需特殊設(shè)備,操作簡(jiǎn)便,費(fèi)用低廉,能提供可視性導(dǎo)向等優(yōu)點(diǎn)，常常被

14、臨床醫(yī)生選用以識(shí)別大腸癌SLN。陳夏5等報(bào)道214例大腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者為57%，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)的百分率為9.69%，均低于本研究結(jié)果，進(jìn)一步肯定了亞甲藍(lán)染色在判定淋巴結(jié)清掃范圍的意義。盡管如此，但因?yàn)槲改c道腫瘤存在著復(fù)雜的淋巴引流系統(tǒng)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的多向性及"跳躍性"，有時(shí)對(duì)進(jìn)展期腫瘤行根治術(shù)也可能因切除范圍不夠而存留轉(zhuǎn)移灶，但亦并不構(gòu)成對(duì)SLNM的障礙，將SLNM用于大腸癌LNMM檢測(cè)是簡(jiǎn)單、有效的方法6。傳統(tǒng)上對(duì)SLN的常規(guī)檢測(cè)是行組織切片HE染色，該方法能查及淋巴結(jié)的大部分組織，但有可能忽略淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的存在，檢測(cè)SLN是否存在微轉(zhuǎn)移癌目前常用的方法有免疫組織化學(xué)

15、(IHC)法、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR法)等，IHC法可以發(fā)現(xiàn)常規(guī)HE染色所不能發(fā)現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移灶的存在，RT-PCR會(huì)使假陰性率降至最低，因而對(duì)LNMM檢測(cè)常?？梢酝ㄟ^(guò)組合使用來(lái)提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。細(xì)胞角蛋白(CK20) 作為細(xì)胞骨架廣泛分布于胃腸上皮組織及其來(lái)源的腫瘤組織胞漿中,在大腸癌中高度表達(dá),在正常間葉組織中無(wú)表達(dá),且在侵襲、轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散到其它組織器官時(shí)始終保持穩(wěn)定，此特點(diǎn)使其成為了檢測(cè)大腸癌微轉(zhuǎn)移的敏感而又特異的腫瘤標(biāo)志物。劉波7運(yùn)用該方法分析了331 枚HE染色呈陰性淋巴結(jié)，用CK20重新檢查又發(fā)現(xiàn)36枚淋巴結(jié)存在微轉(zhuǎn)移灶。說(shuō)明單純HE染色并不能全面的反映SLN的真實(shí)情況，必須結(jié)

16、合IHC檢測(cè)才可以提高檢測(cè)微轉(zhuǎn)移癌的準(zhǔn)確性。本研究亦證實(shí)聯(lián)合應(yīng)用亞甲藍(lán)和CK20進(jìn)行大腸癌前哨淋巴結(jié)定位優(yōu)于單用其中一種方法,免疫組化方法是檢測(cè)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的可靠而又敏感的方法。本研究通過(guò)應(yīng)用亞甲藍(lán)，并結(jié)合CK20免疫組化法在術(shù)中對(duì)大腸癌進(jìn)行SLN的示蹤、定位和LNMM檢測(cè)，可以簡(jiǎn)便、快速地發(fā)現(xiàn)SLN微轉(zhuǎn)移灶，以對(duì)腫瘤進(jìn)行正確的臨床分期，為合理制定手術(shù)方案、指導(dǎo)手術(shù)清掃淋巴結(jié)及后續(xù)治療提供了科學(xué)保證。在手術(shù)過(guò)程中還必須注意以下幾點(diǎn)：在打開(kāi)腹腔探查完畢后，宜盡早注射亞甲藍(lán)，以便在開(kāi)始清掃淋巴結(jié)前有足夠的擴(kuò)散時(shí)間;必須在腫瘤周?chē)⑸洌瑑H僅瘤體內(nèi)注射往往不宜擴(kuò)散，會(huì)出現(xiàn)假陰性。亞甲藍(lán)注射劑量不宜過(guò)多

17、，否則造成組織大片蘭染，往往影響清掃效果;清掃時(shí)，必須仔細(xì)尋找蘭染的區(qū)域或線條，并適當(dāng)根據(jù)指示的方向擴(kuò)大清掃范圍，以免遺漏轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)。 (文中圖12見(jiàn)封四)(略) 參考文獻(xiàn) 1 程黎陽(yáng)，陳曉東，用宏鋒，等.專(zhuān)利藍(lán)示蹤胃癌前哨淋巴結(jié)及其微轉(zhuǎn)移檢測(cè)J.腫瘤,2006,26(l)：71-73. 2 Wong LS,Cantrill JE,Odogwu S,et al.Detection of circulating tumour cells and nodal metastasis by reverse transcriptase-polymerase chain reaction techniqueJ.Br J Surg,1997,84(6):834-839. 3 龔麗明.大腸癌微轉(zhuǎn)移檢測(cè)的現(xiàn)狀及展望J.大腸肛門(mén)病外科雜志，2OO3，9(2)：137-142. 4 Tsioulias G，Wood TF，Morton DL，et a1.Lymphatic mapping and focused analysis of sentinel lymph nodes upstage gastrointestinal neoplasmsJ.Arch Surg，2000，135(8)：926-932. 5 陳 夏,陳惠珠.大腸癌臨床特征與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移規(guī)律分析J.現(xiàn)代