BioEdit及MEGA分析序列同源性簡介

1、利用系統(tǒng)進(jìn)化分析軟件對序列進(jìn)行同源性分析1.0 目的1.1 為了保持國際上各個耐藥性實驗室的高檢驗水準(zhǔn)，進(jìn)行分子進(jìn)化分析是有很重要作用的。它不僅可以保證流行病學(xué)目的順利實現(xiàn)，而且有利于發(fā)現(xiàn)檢測階段可能產(chǎn)生的潛在的交叉污染。1.2 利用此軟件進(jìn)行分析所得的信息對于進(jìn)行艾滋病毒在人群中傳播的流行病學(xué)研究具有十分重要的意義。1.3 通過對實驗室之前分析的數(shù)據(jù)與當(dāng)前數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)在此前實驗過程中由于標(biāo)本處理不當(dāng)所導(dǎo)致的潛在的實驗室污染。1.4 對于確保得到高質(zhì)量的實驗結(jié)果并及時發(fā)現(xiàn)可能出現(xiàn)在實驗室里的問題具有重要意義。 2.0 儀器設(shè)備2.1 計算機一臺。2.2 Windows 95以上的操作

2、系統(tǒng)。2.3 BioEdit 以及 MEGA 4 分析軟件。2.3.1 均為免費軟件，可以從互聯(lián)網(wǎng)上下載，在計算機上進(jìn)行安裝。3.0 操作過程3.1 局限及要求3.1.1 經(jīng)過序列編輯軟件拼接處理后的txt文件或fasta文件均可，例如ChromasPro軟件。3.1.2 可以在MEGA上分析的分子序列或距離矩陣數(shù)據(jù)。3.1.3 Mega 4軟件只能將長度相等的序列轉(zhuǎn)換為MEGA輸出文件，因此，任何多序列文件必須通過BioEdit軟件進(jìn)行對齊修剪，然后才能進(jìn)入通過Mega軟件轉(zhuǎn)換成*.meg格式進(jìn)行分析。3.1.4 該數(shù)據(jù)集的大小受限于計算機上可用的物理（RAM）和虛擬內(nèi)存。3.1.5 分析的

3、序列必須包括兩個或兩個以上長度相同的序列，所有序列分析之前必須用MEGA軟件對齊。3.1.6 核苷酸和氨基酸序列應(yīng)該用英文字母連續(xù)書寫，不區(qū)分大小寫。一些特殊的特殊符號，例如表示對齊缺口，堿基缺失等的符號也可以包含在序列中。3.1.7 空格和制表符經(jīng)常用于數(shù)據(jù)文件中，因此會被MEGA忽略。 ASCII字符，如（.）（ - ）（？），一般都作為特殊符號來表示序列中的不同堿基，分別表示第一個序列，對齊缺口及堿基缺失。3.1.8 BioEdit 軟件進(jìn)行序列比對3.1.9 雙擊BioEdit 圖標(biāo) 打開BioEdit 序列對比編輯器窗口。3.1.10 從工具欄上，單擊new alignment圖標(biāo)打

4、開一個新窗口。3.1.11 點擊 File 菜單, 選擇 import and sequence alignment file3.1.12 出現(xiàn)一個新窗口, 選擇要導(dǎo)入的文件存儲地址及文件名, 點擊 open. 所有需要的序列都會在導(dǎo)入窗口中呈現(xiàn)。3.1.13 點擊Edit 并選擇 Select All Sequences，現(xiàn)在可以準(zhǔn)備對所有的序列進(jìn)行比對。3.1.14 點擊 Accessory Application 并選擇ClustalW Multiple alignment ，打開一個新窗口。3.1.15 點擊窗口下方的 Run ClustalW ，將打開一個新窗口，點擊下方的OK.3.

5、1.16 序列比對將進(jìn)行，進(jìn)行的時間取決于所要比對的序列的長度及數(shù)量。3.1.17 比對結(jié)束后，經(jīng)過比對的序列將呈現(xiàn)在一個新窗口中。3.1.18 將模式（Mode）欄中改為edit，即可對序列進(jìn)行剪切，使其長度一致。3.2 比對及編輯結(jié)束后，點擊File 并選擇 Save 保存比對后的文件. 3.3 用MEGA軟件分析進(jìn)行距離和系統(tǒng)進(jìn)化分析3.3.1 雙擊MEGA4 圖標(biāo)打開 MEGA4.3.3.2 序列比對格式轉(zhuǎn)換:3.3.2.1 從 File 菜單中, 選擇 Convert To Mega Format, 打開 Text File Editor and Format Converter 窗

6、口。3.3.2.2 選擇屏幕中間的File and Format 對話框。3.3.2.3 選擇要導(dǎo)入的文件存儲地址及文件名， 點擊OK，在Text File Editor and Format Converter窗口中出現(xiàn)mega 格式的文件。3.3.2.4 保存文件，關(guān)掉此頁面返回MEGA4.主界面。3.3.3 打開 mega 文件3.3.3.1 從File 菜單中打開 mega文件, 選擇 open data, 或從窗口中打開 Click me to active a data file.3.3.3.2 打開文件后, Input Data 對話框?qū)⒊霈F(xiàn). 在左側(cè)一欄選擇Nucleotide

7、 Sequences,默認(rèn)右側(cè)當(dāng)前選擇，點擊OK.3.3.3.3 出現(xiàn)一個 Confirm 對話框, 點擊Yes.3.3.3.4 Select Genetic Code box opens被打開,通常默認(rèn)所有選項，點擊OK .3.3.3.5 文件名及信息將會出現(xiàn)在窗口下方。3.3.4 打開Mega文件后3.3.4.1 File 菜單中, 進(jìn)行編輯, 導(dǎo)出或轉(zhuǎn)換文件。3.3.5 Data 菜單中, 可以用不同形式瀏覽文件，例如轉(zhuǎn)換成氨基酸形式。3.3.6 距離分析3.3.6.1 Distances 菜單中, 選擇Compute Pairwise. 出現(xiàn)Analysis Preferences 窗

8、口。3.3.6.2 在Distance options 列表中, 選擇 Nucleotide: Kimura 2-parameter for Models, 選擇 Distances only for Comput, 并選擇d: Transitions + transversions for Substitutions to include. 3.3.6.3 Include Sites list, 選擇 Complete Deletion for Handling Gap/Missing Data, 選擇 1st, 2nd, 3rd for Codon Positions/Sites Incl

9、uded, 點擊 OK. 3.3.6.4 Pairwise Distances 窗口打開，在文件中將顯示每兩個序列距離的矩陣。3.3.7 File 菜單中, 選擇Export/Print Distances, 在Text File Editor and Format Converter 窗口中將出現(xiàn)一個名為 Distances 的文件，它顯示了所有的信息及距離矩陣，保存后可以用記事本或?qū)懽职宕蜷_。3.3.8 進(jìn)化分析3.3.8.1 Phylogeny菜單中，選擇Neibour-Joining(NJ), Analysis Preferences 框?qū)⒋蜷_。3.3.8.2 在Distance op

10、tions 列表中, 選擇Nucleotide: Kimura 2-parameter for Models, 選擇 Distances only for Comput, 選擇d: Transitions + transversions for Substitutions to include. 3.3.8.3 Include Sites list, 選擇 Complete Deletion for Handling Gap/Missing Data, 選擇1st, 2nd, 3rd for Codon Positions/Sites Included. 3.3.8.4 在Test of Ph

11、ylogeny 列表中, 選擇Bootstrap for Test of Inferred Phylogeny. 3.3.8.5 屏幕的右側(cè)將出現(xiàn)一個小對話框，選擇1000 for Replications, 然后點擊OK, 進(jìn)程框?qū)⒋蜷_。3.3.8.6 進(jìn)程結(jié)束后, Tree Explorer 窗口將顯示兩種進(jìn)化樹 。同源樹Original tree 是我們所需要的。3.3.8.7 File菜單中, you can save the tree data as可以將所做的樹通過Save鍵保存成Tree Session File(*.mts), 或者選擇Export Current Tree得到 Tree Data File(*.tre)文件, 兩種格式的文件都能被MEGA或其他軟件所識別。3.3.8.8 Image 菜單中, 選擇Copy to Clipboard, 進(jìn)化樹即可被復(fù)制并粘貼到word文檔或ppt文檔中進(jìn)一部編輯。3.3.9 交叉污染的判斷:3.3.9.1 如果有兩個或者更多的序列在進(jìn)化樹中距離非常接近或者兩個分支有相同的結(jié)點且有相同的水平距離，而序列之間又沒什么流行病學(xué)聯(lián)系, 那么這些標(biāo)本則需要從核酸提取階段進(jìn)行重復(fù)檢測，以此驗證它們之間的相近關(guān)系并排除交叉污染。 3.4 亞型的初步分析:3.4.1 用NCBI 基因分型工具進(jìn)行亞型的初步分析