酶工程第四章 酶的提取與分離純化

1、 第四章第四章 酶的提取與分離純化酶的提取與分離純化 （1）細(xì)胞的破碎、酶的抽提）細(xì)胞的破碎、酶的抽提重點(diǎn)重點(diǎn)（2）酶的分離純化：沉淀分離、離心分離、）酶的分離純化：沉淀分離、離心分離、 膜過濾、層析分離、電泳分離膜過濾、層析分離、電泳分離 （3）酶液的濃縮、結(jié)晶、干燥、成型）酶液的濃縮、結(jié)晶、干燥、成型本章知識點(diǎn)：本章知識點(diǎn)：一、生物下游加工技術(shù)一、生物下游加工技術(shù)u下游加工過程下游加工過程包括目標(biāo)產(chǎn)物的提取、濃縮、純化及成品化包括目標(biāo)產(chǎn)物的提取、濃縮、純化及成品化等過程。等過程。u生物產(chǎn)物從原料（培養(yǎng)液或細(xì)胞）生產(chǎn)到產(chǎn)品的后處理技生物產(chǎn)物從原料（培養(yǎng)液或細(xì)胞）生產(chǎn)到產(chǎn)品的后處理技術(shù)（分離純

2、化技術(shù)）的發(fā)展，使低成本、高收率地純化目標(biāo)術(shù)（分離純化技術(shù)）的發(fā)展，使低成本、高收率地純化目標(biāo)產(chǎn)物成為現(xiàn)實(shí)。產(chǎn)物成為現(xiàn)實(shí)。 大多數(shù)酶的回收純化過程成本約占大多數(shù)酶的回收純化過程成本約占70%70%； 醫(yī)用酶的生產(chǎn)回收過程的成本高達(dá)醫(yī)用酶的生產(chǎn)回收過程的成本高達(dá)85%85%； 基因工程表達(dá)產(chǎn)物的回收純化過程成本一般占基因工程表達(dá)產(chǎn)物的回收純化過程成本一般占85-85-90%90%以上。以上。二、分離純化的一般流程二、分離純化的一般流程原料液原料液細(xì)胞分離（離心、過濾）細(xì)胞分離（離心、過濾） 細(xì)胞細(xì)胞（胞內(nèi)產(chǎn)物）（胞內(nèi)產(chǎn)物）清液清液（胞外產(chǎn)物）（胞外產(chǎn)物）細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎碎片分離碎片分離粗分離粗分

3、離純化純化成品化成品化線路2線路1首先首先，應(yīng)對被純化的酶的應(yīng)對被純化的酶的理化性質(zhì)理化性質(zhì)有一個比較全面的了解有一個比較全面的了解;其次其次，判斷采用的方法和條件是否得當(dāng)，始終以，判斷采用的方法和條件是否得當(dāng)，始終以活力回收率活力回收率 和和純化倍數(shù)純化倍數(shù)為指標(biāo)；為指標(biāo)；再者再者，在純化工作中，往往在純化工作中，往往不宜重復(fù)不宜重復(fù)采用相同的步驟和條件；采用相同的步驟和條件；最后最后，要，要嚴(yán)格控制操作條件嚴(yán)格控制操作條件。隨著酶的逐步純凈，雜蛋白含量。隨著酶的逐步純凈，雜蛋白含量亦逐步降低，蛋白質(zhì)之間的相互作用力隨之下降亦逐步降低，蛋白質(zhì)之間的相互作用力隨之下降，酶更不穩(wěn)定，酶更不穩(wěn)定，

4、因此，更要防止酶變性。因此，更要防止酶變性。在實(shí)踐工作中選擇方法時在實(shí)踐工作中選擇方法時:三、酶分離純化的基本原則三、酶分離純化的基本原則 （一）酶分離純化包括三個基本環(huán)節(jié)（一）酶分離純化包括三個基本環(huán)節(jié)抽提抽提純化純化制劑制劑（二）酶分離純化應(yīng)注意以下問題（二）酶分離純化應(yīng)注意以下問題1 1、防止酶變性失活：、防止酶變性失活：熱、熱、pHpH、泡沫、重金屬等。、泡沫、重金屬等。2 2、選擇有效的純化方法。、選擇有效的純化方法。3 3、酶活性測定應(yīng)貫穿純化過程的始終。、酶活性測定應(yīng)貫穿純化過程的始終。 第一節(jié)第一節(jié) 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎只對胞內(nèi)酶只對胞內(nèi)酶利用機(jī)械力的攪拌，剪切或研碎細(xì)胞。利用機(jī)械

5、力的攪拌，剪切或研碎細(xì)胞。組織搗碎機(jī)，細(xì)胞研磨器，勻漿器等。組織搗碎機(jī)，細(xì)胞研磨器，勻漿器等。（一）機(jī)械破碎法（一）機(jī)械破碎法通過溫度，壓力，聲波等各種物理因素的作通過溫度，壓力，聲波等各種物理因素的作用，將組織細(xì)胞破碎的方法，用，將組織細(xì)胞破碎的方法，凍融法、壓差法、超聲波法凍融法、壓差法、超聲波法（二）（二） 物理破碎法物理破碎法通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎的方通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎的方法。法。有機(jī)溶劑處理：有機(jī)溶劑處理：破壞膜磷脂結(jié)構(gòu)，破壞膜磷脂結(jié)構(gòu)，常用丙酮、丁醇、氯常用丙酮、丁醇、氯仿等。仿等。 非離子型表面活性劑處理：非離子型表面活性劑處理：改

6、變膜通透性，使之溶解，改變膜通透性，使之溶解，再提膜蛋白。常用再提膜蛋白。常用Triton X-100 、Tween等。等。（三（三 ）化學(xué)破碎法）化學(xué)破碎法自身的酶或外加酶制劑。自身的酶或外加酶制劑。（1）自溶法）自溶法 （2）酶處理）酶處理 選用各種溶壁酶（如溶菌酶）等處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁選用各種溶壁酶（如溶菌酶）等處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁破壞，酶釋放出來。破壞，酶釋放出來。革蘭氏陽性菌革蘭氏陽性菌：加溶菌酶。：加溶菌酶。酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞：加：加-葡聚糖酶，使其葡聚糖酶，使其-1,3葡聚糖水解。葡聚糖水解。霉菌霉菌：用幾丁質(zhì)酶。：用幾丁質(zhì)酶。植物細(xì)胞植物細(xì)胞：用纖維素酶，半纖維素酶和果膠酶

7、的混合物。：用纖維素酶，半纖維素酶和果膠酶的混合物。（四）酶促破碎法（四）酶促破碎法第二節(jié)第二節(jié) 提取提?。ㄒ唬┏樘岱椒ǎㄒ唬┏樘岱椒?指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)闹冈谝欢ǖ臈l件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┤軇┨幚砗冈希固幚砗冈希姑该赋浞殖浞秩芙馊芙獾饺軇┲械倪^程，也稱為酶的抽提。到溶劑中的過程，也稱為酶的抽提。 四?。核南。合∷嵯∷?、稀堿稀堿、稀鹽稀鹽、稀有機(jī)溶劑稀有機(jī)溶劑，水水。（二）抽提過程中的注意事項（二）抽提過程中的注意事項1 1、pHpH值：值：選擇的pH值不超出酶的酸堿穩(wěn)定范圍； 最好遠(yuǎn)離待抽提酶的等電點(diǎn)。2、溫度：、溫度：通?？刂圃?10左右，尤其是采用有機(jī)溶劑提取時。3、抽提液

8、體積（用量）、抽提液體積（用量） 抽提液的用量一般為含酶原料體積的25倍?？梢淮纬樘?，也可分幾次反復(fù)抽提。4、為提高酶的穩(wěn)定性，可以加入適量的保護(hù)劑。、為提高酶的穩(wěn)定性，可以加入適量的保護(hù)劑。第三節(jié)第三節(jié) 酶的沉淀分離酶的沉淀分離一、鹽析沉淀法一、鹽析沉淀法 (salting out)1 1、原理：、原理：2 2、硫酸銨鹽析的優(yōu)點(diǎn)、硫酸銨鹽析的優(yōu)點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：在水中溶解度大，溶解的溫度系數(shù)??； 價廉易得； 可保護(hù)酶。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)：溶解過程隨濃度增加的體積變化是非線性的變化。遇堿會放出NH4+，干擾蛋白質(zhì)測定；對離心機(jī)等有腐蝕作用；酶制劑若用于食品，會影響口感。3 3、鹽析操作、鹽析操作硫酸銨的

9、飽和度100%（NH4）2SO4 的飽和度（%）=飽和硫酸銨的體積飽和硫酸銨的體積混合溶液總體積混合溶液總體積(25)(25) 當(dāng)溶液體積不大，要達(dá)到的鹽濃度不高，可以加當(dāng)溶液體積不大，要達(dá)到的鹽濃度不高，可以加入飽和硫酸銨溶液；當(dāng)溶液體積較大，要達(dá)到的鹽入飽和硫酸銨溶液；當(dāng)溶液體積較大，要達(dá)到的鹽濃度又較高，此時加入固體硫酸銨較好。濃度又較高，此時加入固體硫酸銨較好。4 4、為了得到較好的鹽析效果，應(yīng)控制下列因素、為了得到較好的鹽析效果，應(yīng)控制下列因素（1）不同酶，鹽析時所需的鹽濃度各不相同。實(shí)際料液中目標(biāo)酶的鹽析沉淀操作前，所需的硫酸銨濃度或飽和度可通過實(shí)驗確定。（2）加鹽操作時，防止局部

10、鹽濃度過高，防止產(chǎn)生泡沫。（3）pH值和溫度：等電點(diǎn)附近，室溫或低溫操作。（5）脫鹽：超濾、透析或?qū)游?。?）蛋白質(zhì)濃度：樣品液的蛋白質(zhì)濃度一般控制在2.53.0% 為宜，太濃時應(yīng)適當(dāng)稀釋，以減少雜蛋白共沉淀。（二）等電點(diǎn)沉淀（二）等電點(diǎn)沉淀 (isoelectric precipitation)1、原理、原理2、實(shí)際操作、實(shí)際操作 與其他方法一起使用（鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、復(fù)合沉淀）。與其他方法一起使用（鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、復(fù)合沉淀）。 單獨(dú)使用時，主要是用于從粗酶中除去某些等電點(diǎn)相距較單獨(dú)使用時，主要是用于從粗酶中除去某些等電點(diǎn)相距較大的雜蛋白大的雜蛋白 。3、注意、注意 加酸堿調(diào)節(jié)加酸堿調(diào)

11、節(jié)pHpH值時，防止局部酸堿過高。值時，防止局部酸堿過高。(三三) 有機(jī)溶劑沉淀有機(jī)溶劑沉淀 在待分離的酶液中加入與水互溶的有機(jī)溶劑在待分離的酶液中加入與水互溶的有機(jī)溶劑使溶液介電常數(shù)降低，酶蛋白分子間引力增大而使溶液介電常數(shù)降低，酶蛋白分子間引力增大而相互產(chǎn)生聚集，從而降低溶解度而析出沉淀。相互產(chǎn)生聚集，從而降低溶解度而析出沉淀。實(shí)際操作中常用的有機(jī)溶劑有實(shí)際操作中常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇乙醇、丙酮、異丙醇和甲醇和甲醇等。等。 溫度溫度 00下操作。有機(jī)溶劑先在下操作。有機(jī)溶劑先在-15 -15 - - 2020下預(yù)冷，沉淀后立即在低溫下離心分離。下預(yù)冷，沉淀后立即在低溫下離心分離

12、。 pHpH值：值：盡可能靠近其等電點(diǎn)。盡可能靠近其等電點(diǎn)。 沉淀后馬上用緩沖液溶解，減少有機(jī)溶劑濃度。沉淀后馬上用緩沖液溶解，減少有機(jī)溶劑濃度。（四）復(fù)合物沉淀法（四）復(fù)合物沉淀法1、原理、原理2、常用的復(fù)合沉淀劑：、常用的復(fù)合沉淀劑： 單寧、聚乙二醇、聚丙烯酸（單寧、聚乙二醇、聚丙烯酸（PAA）等高分子聚合物。）等高分子聚合物。 PAA + 酶酶 PAA-酶酶 PAA-酶酶 PAA + 酶酶 PAA + 酶酶 + Ca 2+ PAA- Ca 2+ + 酶酶 PAA- Ca 2+ + SO4 2- CaSO4 + PAApH6以上（五）選擇性變性沉淀法（五）選擇性變性沉淀法1、熱變性法：熱變

13、性法：根據(jù)目的酶與雜蛋白熱穩(wěn)定性差異，可以在較根據(jù)目的酶與雜蛋白熱穩(wěn)定性差異，可以在較高溫度下，使雜蛋白變性沉淀，而酶則保持可溶狀態(tài)。高溫度下，使雜蛋白變性沉淀，而酶則保持可溶狀態(tài)。2、酸堿變性法：酸堿變性法：與熱變性原理類似，目的酶與雜蛋白的酸堿與熱變性原理類似，目的酶與雜蛋白的酸堿穩(wěn)定性不同，可以調(diào)整不同的穩(wěn)定性不同，可以調(diào)整不同的pHpH使雜蛋白變性沉淀。使雜蛋白變性沉淀。 選擇一定的條件使酶液中存在的某些蛋白質(zhì)等雜質(zhì)變性沉選擇一定的條件使酶液中存在的某些蛋白質(zhì)等雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶。淀，而不影響所需的酶。第四節(jié)第四節(jié) 膜過濾技術(shù)在膜過濾技術(shù)在酶分離純化中的應(yīng)用酶分離純化中的應(yīng)

14、用Membrane Filtration膜過濾技術(shù)（膜過濾技術(shù)（membrane filtration）：借助于一定借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)。特性的物質(zhì)顆粒或分子進(jìn)行分離的技術(shù)。 膜分離技術(shù)已被國際上公認(rèn)為20世紀(jì)末至21世紀(jì)中期最有發(fā)展前途，甚至?xí)?dǎo)致一次工業(yè)革命的重大生產(chǎn)技術(shù)，所以可以稱為前沿技術(shù)，是世界各國研究的熱點(diǎn)。 廣泛應(yīng)用于生物工程、化學(xué)、制藥、飲料、電力、冶金、海水淡化、資源再生等領(lǐng)域。滲出液滲出液膜膜分離技術(shù)的地位和影響分離技術(shù)的地位和影響l 美國官方文件曾說美國官方文件

15、曾說“18世紀(jì)電器改變了整個工業(yè)進(jìn)程世紀(jì)電器改變了整個工業(yè)進(jìn)程，而，而20世紀(jì)膜技術(shù)將改變整個面貌世紀(jì)膜技術(shù)將改變整個面貌”，“目前沒有一種目前沒有一種技術(shù)，能像膜技術(shù)這么廣泛地被應(yīng)用技術(shù)，能像膜技術(shù)這么廣泛地被應(yīng)用”l 日本和歐洲日本和歐洲則把膜技術(shù)作為則把膜技術(shù)作為21世紀(jì)的基盤技術(shù)進(jìn)行研世紀(jì)的基盤技術(shù)進(jìn)行研究和開發(fā)。究和開發(fā)。l “誰掌握了膜技術(shù)，誰就掌握了化學(xué)工業(yè)的未來誰掌握了膜技術(shù)，誰就掌握了化學(xué)工業(yè)的未來”- Norman N. Li，美國科學(xué)院院士，著名華裔科學(xué)家。美國科學(xué)院院士，著名華裔科學(xué)家。l 膜分離已得到廣泛應(yīng)用膜分離已得到廣泛應(yīng)用。21世紀(jì)是工業(yè)生物技術(shù)的世世紀(jì)是工業(yè)生

16、物技術(shù)的世紀(jì)，膜技術(shù)將扮演重要角色。紀(jì)，膜技術(shù)將扮演重要角色。一、膜分離的類型一、膜分離的類型1、按推動力不同可分為：、按推動力不同可分為：（1）加壓膜分離：）加壓膜分離：微濾（微濾（Microfiltration）、超濾）、超濾（Ultrafiltration）、納濾（）、納濾（Nanofiltration ）、反滲透）、反滲透（Reverse Osmosis）（2）電場膜分離：）電場膜分離：電滲析（電滲析（Electrodialysis）（3）擴(kuò)散膜分離：滲透（）擴(kuò)散膜分離：滲透（ Osmosis）、透析（）、透析（Dialysis ）2 2、按膜孔徑或截留物質(zhì)的大?。骸茨た讖交蚪亓粑镔|(zhì)

17、的大?。何V微濾 超濾超濾 納濾納濾 、電滲析、電滲析 、透析、透析 反滲透反滲透膜孔徑大小（一）（一） 微微 濾濾(MF)又稱微孔過濾，是以微濾膜作為過濾介質(zhì)的膜分離技術(shù)。又稱微孔過濾，是以微濾膜作為過濾介質(zhì)的膜分離技術(shù)。（1）截留顆粒直徑）截留顆粒直徑：0.22 um。（2）操作壓力：）操作壓力：低于低于0.1 MPa。（3）應(yīng)用：）應(yīng)用： 實(shí)驗室和生產(chǎn)中通常利用微濾實(shí)驗室和生產(chǎn)中通常利用微濾技術(shù)除去或收集酶發(fā)酵液中的細(xì)胞。技術(shù)除去或收集酶發(fā)酵液中的細(xì)胞。 無菌水、礦泉水、純生啤酒的生無菌水、礦泉水、純生啤酒的生產(chǎn)。熱敏性藥物和營養(yǎng)物質(zhì)的過濾除產(chǎn)。熱敏性藥物和營養(yǎng)物質(zhì)的過濾除菌等菌等.二、

18、酶分離純化中幾種常見的膜分離技術(shù)二、酶分離純化中幾種常見的膜分離技術(shù)細(xì)胞細(xì)胞水水鹽鹽大大分分子子小小分分子子（二）（二） 超超 濾濾(UF) 可截留溶液中溶解的可截留溶液中溶解的大分子大分子物質(zhì)，而透過物質(zhì)，而透過小分子小分子物質(zhì)。物質(zhì)。（1）截留顆粒直徑：）截留顆粒直徑：10200 nm。（2）操作壓力：）操作壓力：0.10.7MPa。（3）應(yīng)用：）應(yīng)用： 一是分離純化，從高分一是分離純化，從高分子物質(zhì)與低分子物質(zhì)的溶液子物質(zhì)與低分子物質(zhì)的溶液中，使低分子物質(zhì)透過膜；中，使低分子物質(zhì)透過膜； 二是溶液的濃縮。二是溶液的濃縮。大分子大分子水水鹽鹽小小分分子子 納濾膜主要用于截留粒徑在納濾膜主要

19、用于截留粒徑在210nm，分子量分子量為為1000左右左右的物質(zhì)，可以使的物質(zhì)，可以使鹽鹽和和小分子小分子物質(zhì)透過，物質(zhì)透過，操作壓（操作壓（0.51MPa）。 其被分離物質(zhì)的尺寸介于反滲透膜和超濾膜之間，其被分離物質(zhì)的尺寸介于反滲透膜和超濾膜之間，但與上述兩種膜有所交叉。但與上述兩種膜有所交叉。（三）納（三）納 濾濾(NF)水水鹽鹽小分子小分子大分子大分子（四）（四） 反滲透反滲透(RO) 在壓力作用下，溶劑（通常是水）透過膜，而溶質(zhì)被阻擋在壓力作用下，溶劑（通常是水）透過膜，而溶質(zhì)被阻擋于膜壁外。于膜壁外。（1）截留顆粒直徑：小于）截留顆粒直徑：小于2 nm。（2）操作壓力：）操作壓力：0

20、.713 MPa。（3）應(yīng)用：主要用于分離各種離子和小分子物質(zhì)。）應(yīng)用：主要用于分離各種離子和小分子物質(zhì)。 在酶液的濃縮、無離子水的制備、海水淡化等方面廣泛應(yīng)在酶液的濃縮、無離子水的制備、海水淡化等方面廣泛應(yīng)用。用。溶質(zhì)溶質(zhì) 水水水水膜溶質(zhì)溶質(zhì) 水水水水膜滲透反滲透水水鹽鹽小分子小分子大分子大分子反滲透（反滲透（RO）（五）（五） 電滲析電滲析 在電場作用下，帶電離子透過膜向兩極移動，而達(dá)到分離在電場作用下，帶電離子透過膜向兩極移動，而達(dá)到分離的目的。的目的。酶液膜膜+-+-應(yīng)用：應(yīng)用：電滲析主要用于酶液或其他溶液的脫鹽、海水淡化、電滲析主要用于酶液或其他溶液的脫鹽、海水淡化、 純水制備等純水

21、制備等透析袋透析袋酶溶液酶溶液蒸餾水蒸餾水l應(yīng)用：應(yīng)用：在生物分離方面，主在生物分離方面，主要用于生物大分子溶液的要用于生物大分子溶液的脫鹽脫鹽。由于透析過程以濃差為傳質(zhì)推由于透析過程以濃差為傳質(zhì)推動力，膜的透過通量很小，動力，膜的透過通量很小，不不適于大規(guī)模適于大規(guī)模生物分離過程，而生物分離過程，而在實(shí)驗室中應(yīng)用較多。在實(shí)驗室中應(yīng)用較多。（六）（六） 透析透析鹽類鹽類 水水膜透析水水膜滲透1、若除去酶溶液中的鹽分，可采用下面哪種分離方式？（、若除去酶溶液中的鹽分，可采用下面哪種分離方式？（ ） A、板框過濾、板框過濾 B、微濾、微濾 C、超濾、超濾 D、反滲透、反滲透2、若除去酶溶液中的生物

22、小分子，可采用下面哪種分離方式？、若除去酶溶液中的生物小分子，可采用下面哪種分離方式？（ ） A、板框過濾、板框過濾 B、微濾、微濾 C、超濾、超濾 D、反滲透、反滲透3、在采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶時，若采用膜過濾的方法除、在采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶時，若采用膜過濾的方法除去發(fā)酵液中的菌體細(xì)胞，可采用哪種膜分離方式？去發(fā)酵液中的菌體細(xì)胞，可采用哪種膜分離方式？ 用生產(chǎn)所得的殼聚糖酶來降解殼聚糖生產(chǎn)殼寡糖時，反應(yīng)用生產(chǎn)所得的殼聚糖酶來降解殼聚糖生產(chǎn)殼寡糖時，反應(yīng)完成后，可采用哪種膜分離方法除去反應(yīng)液中的殼聚糖酶？完成后，可采用哪種膜分離方法除去反應(yīng)液中的殼聚糖酶？練習(xí)：練習(xí)：三、膜分離技術(shù)的

23、基本流程三、膜分離技術(shù)的基本流程滲出液滲出液膜組件膜組件料液罐料液罐濃縮液（回流液）濃縮液（回流液）泵泵中空纖維超濾器中空纖維超濾器 中空纖維膜分中空纖維膜分離裝置是將成束的中空纖維裝入離裝置是將成束的中空纖維裝入一筒內(nèi)，兩端封閉。當(dāng)軸流通過一筒內(nèi)，兩端封閉。當(dāng)軸流通過管腔時，造成高剪切力，在截留管腔時，造成高剪切力，在截留溶質(zhì)分子的同時，將濃度降至最溶質(zhì)分子的同時，將濃度降至最低限度。每根中空纖維內(nèi)腔直徑低限度。每根中空纖維內(nèi)腔直徑為為0.2mm,0.2mm,中空纖維由惰性的非離中空纖維由惰性的非離子聚合物制成具有各向異性、子聚合物制成具有各向異性、抗堵塞性，運(yùn)用成束纖維抗堵塞性，運(yùn)用成束纖

24、維表面積表面積大大，流量大、阻留溶質(zhì)的濃度范，流量大、阻留溶質(zhì)的濃度范圍圍(4 (4一一2020左右左右) ) 如右圖。如右圖。四、生產(chǎn)中常用的膜分離裝置四、生產(chǎn)中常用的膜分離裝置中空纖維超濾膜組件中空纖維超濾膜組件清洗液清洗液清洗液出口清洗液出口滲出液滲出液滲出液滲出液（c）五、膜及膜的使用性能五、膜及膜的使用性能（一）膜的結(jié)構(gòu)（一）膜的結(jié)構(gòu)膜膜表層：孔徑各異，厚度為表層：孔徑各異，厚度為0.15um基層：起支持作用，厚度為基層：起支持作用，厚度為50250um主要有：主要有：陶瓷陶瓷、微孔玻璃、不銹鋼和碳素等。、微孔玻璃、不銹鋼和碳素等。適用：適用：微濾膜微濾膜。特點(diǎn)：是機(jī)械強(qiáng)度高，耐高溫

25、、耐化學(xué)試劑和耐有機(jī)溶劑，特點(diǎn)：是機(jī)械強(qiáng)度高，耐高溫、耐化學(xué)試劑和耐有機(jī)溶劑，但但缺點(diǎn)缺點(diǎn)是不易加工，造價較高。是不易加工，造價較高。1、 無機(jī)材料無機(jī)材料（二）制膜材料（二）制膜材料 目前，實(shí)用的有機(jī)高分子膜材料有：目前，實(shí)用的有機(jī)高分子膜材料有：纖維素酯類、聚砜纖維素酯類、聚砜類、聚酰胺類及其他材料類、聚酰胺類及其他材料。 可用作可用作反滲透膜反滲透膜、微濾膜微濾膜和和超濾膜超濾膜。2、有機(jī)高分子材料、有機(jī)高分子材料（1 1）透水率（透水通量、流率）：）透水率（透水通量、流率）： 是指在一定溫度和壓力條件下單位膜面積在單位時間內(nèi)透是指在一定溫度和壓力條件下單位膜面積在單位時間內(nèi)透 過的水量

26、。過的水量。 處理蛋白質(zhì)（酶）溶液時，透水率常為純水的處理蛋白質(zhì)（酶）溶液時，透水率常為純水的10%。（2 2）截留率：）截留率： 是指溶液中某一溶質(zhì)被膜截留量的百分?jǐn)?shù)。是指溶液中某一溶質(zhì)被膜截留量的百分?jǐn)?shù)。 酶超濾濃縮通常選用酶超濾濃縮通常選用90%以上截留率的膜。以上截留率的膜。（3 3）截留物相對分子質(zhì)量：）截留物相對分子質(zhì)量：是指某種大分子如酶，在截留率達(dá)到某一指標(biāo)情況下的被是指某種大分子如酶，在截留率達(dá)到某一指標(biāo)情況下的被截留物的分子量。截留物的分子量。（三）膜的使用性能（三）膜的使用性能第五節(jié)第五節(jié) 離心技術(shù)（離心技術(shù)（ centrifugation centrifugation

27、）在酶分離純化中的應(yīng)用在酶分離純化中的應(yīng)用 離心是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不離心是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小和不同密度的物質(zhì)分開的技術(shù)。同大小和不同密度的物質(zhì)分開的技術(shù)。（一）離心機(jī)分類（一）離心機(jī)分類n低速離心機(jī)：低速離心機(jī)：8 000 r/min 用途：分離細(xì)胞、細(xì)胞碎片、培養(yǎng)基殘渣及粗結(jié)晶等較大顆粒。n高速離心機(jī)：高速離心機(jī)：8 00025 000 r/min 用途：分離各種沉淀物、細(xì)胞碎片及較大的細(xì)胞器等。n超速離心機(jī)：超速離心機(jī)：25 000 r/min 用途：制備用超速離心機(jī)：分離純化生物大分子、細(xì)胞器和病毒等。分析用超速離心機(jī)：測定樣品純度、沉降系數(shù)、相

28、對分子量。實(shí)驗室離心機(jī)實(shí)驗室離心機(jī)離心的形式離心的形式角式離心機(jī)和離心頭（轉(zhuǎn)子）角式離心機(jī)和離心頭（轉(zhuǎn)子）。離心機(jī)的大?。号_式離心機(jī)的大小：臺式離心機(jī)的大?。郝涞厥诫x心機(jī)的大小：落地式l材質(zhì)：玻璃，材質(zhì)：玻璃，塑料塑料l強(qiáng)度：和離強(qiáng)度：和離心速度相配心速度相配l大小：和轉(zhuǎn)大?。汉娃D(zhuǎn)子配套子配套l高速超速管高速超速管要加蓋要加蓋離心機(jī)操作離心機(jī)操作離心機(jī)其它類型離心機(jī)其它類型 超速冷凍離心機(jī)超速冷凍離心機(jī) 立式螺旋過濾離心機(jī)立式螺旋過濾離心機(jī)活塞推料離心機(jī)活塞推料離心機(jī) 管式離心機(jī)管式離心機(jī)三足離心機(jī)三足離心機(jī)中中小小大大1 1、差速離心、差速離心 采用采用不同不同的的離心速度離心速度和和離心時

29、間離心時間，使不同沉降速度的顆粒，使不同沉降速度的顆粒先后先后分離的方法。分離的方法。 應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍:大小和密度有大小和密度有較大較大差別的顆粒。差別的顆粒。2 2、密度梯度離心、密度梯度離心 在離心管中用560%的蔗糖溶液，形成由管底到液面逐漸降低的梯度，將樣品放在密度梯度溶液的表面，經(jīng)過離心，不同大小、具有一定沉降系數(shù)差異的顆粒在密度梯度溶液中形成若干條不連續(xù)的區(qū)帶。梯度介質(zhì)：梯度介質(zhì)：蔗糖密度梯度系統(tǒng)蔗糖密度梯度系統(tǒng)密度梯度的制備：密度梯度的制備：密度梯度混合器密度梯度混合器3 3、等密度梯度離心、等密度梯度離心 當(dāng)欲分離的不同顆粒的密度范圍處于離心介質(zhì)的密度范圍時，在離心力的作用下

30、，不同浮力密度的顆粒一直移動到與他們各自的浮力密度恰好相等的位置，形成區(qū)帶。常用的離心介質(zhì)常用的離心介質(zhì)：銫鹽，如銫鹽，如CsCl，Cs2SO4，CsBrn先把一定濃度的銫鹽溶液與樣品液混合均勻，也可將一定量的銫鹽加到樣品液中使之溶解。n在選定的離心力作用下，經(jīng)過足夠時間的離心分離。n銫鹽在離心力的作用下，在離心力場中沉降，自動形成密度梯度。n樣品中不同浮力密度的顆粒在其各自的等密度點(diǎn)位置上形成區(qū)帶。（二）離心法測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量（二）離心法測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量Mr相對分子質(zhì)量；R氣體常數(shù)，常取8.314Jmol-1K-1；T溫度（K）；D粒子在介質(zhì)中的擴(kuò)散系數(shù)（m2s-1）；V偏微比容

31、（m3kg-1）；o介質(zhì)密度。第六節(jié)第六節(jié) 層析技術(shù)（層析技術(shù)（chromatographychromatography）在酶分離純化中的應(yīng)用在酶分離純化中的應(yīng)用一、色譜分離法一、色譜分離法 色譜法是色譜法是19051905年俄國植物年俄國植物學(xué)家茨維特發(fā)明的。他將學(xué)家茨維特發(fā)明的。他將植物色素的石油醚提取液植物色素的石油醚提取液倒入一根裝有碳酸鈣的玻倒入一根裝有碳酸鈣的玻璃管頂端，用石油醚淋洗璃管頂端，用石油醚淋洗玻璃管，使色素出現(xiàn)分離，玻璃管，使色素出現(xiàn)分離，在管內(nèi)顯示出不同的色帶，在管內(nèi)顯示出不同的色帶，色譜一詞由此得名。色譜一詞由此得名。碳酸鈣（固定相）石油醚（流動相）色譜柱二、基本操

32、作過程二、基本操作過程層析柱層析柱的準(zhǔn)備的準(zhǔn)備固定相材固定相材料的準(zhǔn)備料的準(zhǔn)備裝柱裝柱平衡平衡上樣上樣（洗滌和）（洗滌和） 洗脫洗脫收集洗收集洗脫液脫液洗脫液檢測，洗脫液檢測，繪制洗脫曲線繪制洗脫曲線三、幾種層析分離方法三、幾種層析分離方法（一）吸附層析（一）吸附層析（adsorption chromatography） 利用物理利用物理吸附劑吸附劑對不同物質(zhì)對不同物質(zhì)吸附能力吸附能力的不同而使混合液的不同而使混合液中各組分分離的方法。中各組分分離的方法。1、原理、原理2、吸附劑的種類和特點(diǎn)、吸附劑的種類和特點(diǎn)（1）種類：）種類：活性氧化鋁、硅膠、硅藻土、碳酸鹽、活性碳、陶土、纖維素等。（2）

33、特點(diǎn)：）特點(diǎn)：來源豐富、價廉、可再生、吸附設(shè)備簡單。有些吸附劑使用前要預(yù)處理，以除去雜質(zhì)，提高吸附力，增強(qiáng)分離效果。上樣時低pH值和低離子強(qiáng)度，半小時后提高pH值和離子強(qiáng)度洗脫。3、吸附的三個基本環(huán)節(jié)：、吸附的三個基本環(huán)節(jié)：加樣、吸附、洗滌和洗脫。（二）離子交換層析（二）離子交換層析（ion exchange chromatography）1、原理、原理 利用利用離子交換劑離子交換劑上的上的可解離基團(tuán)可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對各種離子（活性基團(tuán)）對各種離子親親和力不同和力不同而達(dá)到分離目的的一種分離方法。而達(dá)到分離目的的一種分離方法。（1）根據(jù)母體不同可分為）根據(jù)母體不同可分為離子交換樹脂離子交

34、換樹脂：交換容量不大，易使酶失活交換容量不大，易使酶失活離子交換纖維素離子交換纖維素：最廣泛的一類：最廣泛的一類離子交換凝膠離子交換凝膠：不耐高流速洗脫：不耐高流速洗脫2、什么是離子交換劑、什么是離子交換劑?+-母體可解離基團(tuán)可解離基團(tuán)母體（2）根據(jù)活性基團(tuán)性質(zhì)不同可分為）根據(jù)活性基團(tuán)性質(zhì)不同可分為陽離子交換劑陽離子交換劑：能吸附帶能吸附帶“+”+”的離子或酶的離子或酶 -CM-CM- -（羧甲基）、（羧甲基）、-PO-PO3 32- 2-（磷酸基）、（磷酸基）、-SO-SO3 3- -（磺酸基）（磺酸基）陰離子交換劑陰離子交換劑：能吸附帶能吸附帶“-”-”的離子或酶的離子或酶 -DEAE-D

35、EAE（二乙基氨基乙基）、（二乙基氨基乙基）、-TEAE-TEAE（三乙基氨基乙基）（三乙基氨基乙基）3、離子交換反應(yīng)、離子交換反應(yīng) 蛋白質(zhì)/酶在不同的pH條件下，將發(fā)生不同的離解作用，而帶不同的電荷，選擇相應(yīng)的離子交換劑，同時要考慮被分離酶的穩(wěn)定性。離子交換層析中常用的功能基團(tuán)離子交換層析中常用的功能基團(tuán)4、操作要點(diǎn)、操作要點(diǎn)（1）離子交換劑的預(yù)處理離子交換劑的預(yù)處理：浸泡吸脹， 再用HCl或 NaOH交換處理，離子交換樹脂和凝膠用23倍于樹脂體積的2mol/L，離子交換纖維素用0.5mol/L酸、堿處理。（2）裝柱：）裝柱：濕法裝柱，離子交換劑上樣前抽氣泡。（3）平衡、加樣：）平衡、加樣：

36、1%5%上樣量。（4）洗脫、收集：）洗脫、收集： 梯級洗脫（分時段改變洗脫液的pH或鹽離子強(qiáng)度） 梯度洗脫（連續(xù)改變pH或鹽離子強(qiáng)度）（5）再生：）再生：離子交換劑要再生，和預(yù)處理程序相同。練習(xí)練習(xí)1、下面哪一種不能作為離子交換劑用于分離純化酶？（ ）A、DEAE-Sephadex B、CM-Cellulose C、TEAE-Sepharose D、Sephadex G502、某酶的等電點(diǎn)為6.8，若采用DEAE-纖維素進(jìn)行離子交換分離，可選擇下面哪種pH的緩沖液上柱？（ ）A、pH為5.0的緩沖液 B、pH為6.8的緩沖液 C、pH為8.0的緩沖液 D、都不行（三（三) ) 凝膠過濾層析凝膠

37、過濾層析（gel filtration chromatography）1、原理、原理 利用各組分利用各組分分子量分子量大小不同，從而在大小不同，從而在凝膠網(wǎng)孔凝膠網(wǎng)孔中流中流速不同達(dá)到分離的目的。速不同達(dá)到分離的目的。（1 1）混合物上柱）混合物上柱; ; （2 2）洗脫開始，小分子進(jìn)入凝膠內(nèi)，大分子則被排阻于外）洗脫開始，小分子進(jìn)入凝膠內(nèi)，大分子則被排阻于外; ; （3 3）小分子滯留，大分子向下移動，大小分子開始分開）小分子滯留，大分子向下移動，大小分子開始分開; ; （4 4）大小分子完全分開）大小分子完全分開; ;（5 5）大分子行程較短，已洗脫出，小分子尚在行進(jìn)中。）大分子行程較短，

38、已洗脫出，小分子尚在行進(jìn)中。2、常用的凝膠種類、常用的凝膠種類（1）葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠 Sephadex G-X X表示每克干膠的吸水值的10倍 吸水值越大，分離范圍(分子量)越大 近年來，有一些新產(chǎn)品推出，如Sephacryl-S和Sephadex-LH等交聯(lián)型凝膠，具有很好的耐壓性能。（2）瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 Sepharose 2B、4B、6B 2B、4B、6B表示瓊脂糖含量為2%、4%、6%，濃度越高，凝膠網(wǎng)眼孔徑越小，分部的大分子相對分子質(zhì)量越小，范圍越窄。 瓊脂糖分部的相對分子質(zhì)量范圍較葡聚糖寬廣，上限達(dá)108，故適用于分離相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)（酶）。（3）聚丙烯酰胺凝膠聚丙

39、烯酰胺凝膠 Bio-Gel P-2、4、6、.、200、300，共10種型號。 P后的數(shù)字表示分離的最大相對分子質(zhì)量（103）。3、操作要點(diǎn)、操作要點(diǎn)（1）裝柱：裝柱前要）裝柱：裝柱前要吸脹吸脹和和抽氣抽氣。常溫吸脹需較。常溫吸脹需較長時間，可加熱溶脹。長時間，可加熱溶脹。（2）上樣：加樣量不超過）上樣：加樣量不超過3%。（3）洗脫：洗脫液應(yīng)與平衡時的溶液）洗脫：洗脫液應(yīng)與平衡時的溶液一致一致。（4）再生：）再生：無須無須經(jīng)過再生處理。經(jīng)過再生處理。（5）長期不用長期不用時，可加時，可加0.02%的的NaN3保存。保存。（四（四) ) 親和層析（親和層析（affinity chromatogr

40、aphy）1、原理、原理 生物分子對間的專一而又可逆的結(jié)合力，稱為生物分子對間的專一而又可逆的結(jié)合力，稱為親和親和力力，利用這種親和專一性的特點(diǎn)，而制備專門的，利用這種親和專一性的特點(diǎn)，而制備專門的親和吸親和吸附劑附劑，用其進(jìn)行蛋白質(zhì)等生物分子的層析純化，就是，用其進(jìn)行蛋白質(zhì)等生物分子的層析純化，就是親親和層析和層析，效率特別，效率特別高高。 酶酶底物（包括酶的競爭性抑制劑和輔因子）底物（包括酶的競爭性抑制劑和輔因子） 特異性抗原特異性抗原抗體抗體 激素激素受體受體 DNA互補(bǔ)的互補(bǔ)的DNA或或RNA 凝集素和糖蛋白凝集素和糖蛋白載體載體配體配體臂臂待分離組分待分離組分親和吸附親和吸附洗滌洗脫

41、洗滌洗脫再再 生生雜蛋白雜蛋白目的酶目的酶 親和分離原理示意圖親和分離原理示意圖2 2、親和吸附劑、親和吸附劑由由母體母體與與配基配基偶聯(lián)而成。偶聯(lián)而成。配基配基：作為固定相的分子對的一方。：作為固定相的分子對的一方。母體母體：又稱載體，如各種凝膠、纖維素均是惰性：又稱載體，如各種凝膠、纖維素均是惰性 物，須先物，須先活活化化后再與配基反應(yīng)。后再與配基反應(yīng)。臂臂：如果載體與配基間的距離太近，往往需要加臂。：如果載體與配基間的距離太近，往往需要加臂。載體載體配體配體臂臂親和吸附劑親和吸附劑3、操作要點(diǎn)、操作要點(diǎn) 要先要先洗滌洗滌后洗脫后洗脫,用含有與親和吸附劑相同的高濃度配基或另一種配基洗脫。親

42、和層析法純化親和層析法純化胰蛋白酶胰蛋白酶 雞蛋清雞蛋清 Sepharose 4B 豬胰臟豬胰臟 提取提取 活化活化 提取提取 分離純化分離純化 卵粘蛋白卵粘蛋白(CHOM) 活化活化Spharose 4B 胰蛋白酶原粗提液胰蛋白酶原粗提液 偶聯(lián)偶聯(lián) 激活激活 CHOM-Spharose 4B 胰蛋白酶提取液胰蛋白酶提取液 親和層析親和層析 純胰蛋白酶純胰蛋白酶 第七節(jié)第七節(jié) 電泳技術(shù)（電泳技術(shù)（electrophoresiselectrophoresis）在酶分離純化中的應(yīng)用在酶分離純化中的應(yīng)用電泳的定義：電泳的定義： 帶電顆粒在電場的作用下，向著與其電性相反的電極方向移動，這種現(xiàn)象稱之為電

43、泳(electrophoresis，簡稱EP)。 電泳技術(shù)就是根據(jù)各種帶電粒子在電場中遷移速度的不同而對物質(zhì)進(jìn)行分離的一類實(shí)驗技術(shù)。1、聚丙烯酰胺凝膠（、聚丙烯酰胺凝膠（PAG） PAG由丙烯酰胺（ arc，單體）和甲叉雙丙烯酰胺（ bis，雙體，交聯(lián)劑）在催化劑作用下聚合而成。arc濃度：凝膠的孔徑大小凝膠的孔徑大小arc和bis的比例：凝膠的強(qiáng)度凝膠的強(qiáng)度催化劑用量：聚合時間聚合時間一、聚丙烯酰胺凝膠電泳（一、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGEPAGE）2 2、PAGEPAGE的應(yīng)用類型的應(yīng)用類型常規(guī)常規(guī)PAGEPAGE濃度梯度濃度梯度PAGEPAGESDS-PAGESDS-PAGE不連續(xù)PAG

44、E（用于一般分析分離純化）連續(xù)PAGE（同上）（用于測定Pr相對分子質(zhì)量和分離純化）（用于測定Pr單體相對分子質(zhì)量和雙向電泳）3 3、不連續(xù)、不連續(xù)PAGEPAGE的特性和分離的特性和分離PrPr的效應(yīng)的效應(yīng)（1）三個不連續(xù)三個不連續(xù)凝膠濃度不連續(xù)；pH值不連續(xù)；緩沖液不連續(xù)。 （2）三種效應(yīng)三種效應(yīng)濃縮效應(yīng)；電荷效應(yīng)；分子篩效應(yīng)。4 4、濃度梯度、濃度梯度PAGEPAGE 配制4%和30%的分離膠，用梯度混合儀制成從上至下4%30%的均勻濃度梯度凝膠，其網(wǎng)眼孔徑從上至下越來越小，電泳時，不同Pr主要依 r 大小而分離，即分子篩效應(yīng)電荷效應(yīng)，可用于測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。5 5、SDS-PA

45、GESDS-PAGESDS：十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉 CH3（CH2）11SO4Na2 在配制凝膠時加入SDS，同時加巰基乙醇，Pr在電泳時，其中的寡聚體Pr解聚為單體（亞基），SDS分子就將每個單體分子表面覆蓋起來，使其形成短軸為1.8nm，而長軸各異的SDS亞基復(fù)合物，電泳時，他們的表面電荷基本相同，故可因分子長軸大小（即亞基分子大?。┎顒e而分離，換言之，亞基的大小是彼此分離的依據(jù)，所以此法可用于測定單體的相對分子質(zhì)量。6 6、PAGEPAGE的一般操作程序的一般操作程序配制各種制配制各種制膠的貯存液膠的貯存液準(zhǔn)備制準(zhǔn)備制膠模具膠模具配制鑄膠配制鑄膠混合液混合液灌注膠液并灌注膠液并聚合

46、成凝膠聚合成凝膠上槽上槽點(diǎn)樣點(diǎn)樣通電電泳通電電泳取出凝膠取出凝膠Pr染色染色漂洗顯帶漂洗顯帶記錄計算記錄計算繪制電泳圖譜繪制電泳圖譜 SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)（亞基）的相對分子質(zhì)量（Mr）與它們的電泳遷移率（U）之間，存在如下關(guān)系： lg lgMrMr = lg = lgK K - - bUbU 用 lgMr 對 U 作圖，只要實(shí)驗測得，就可用標(biāo)準(zhǔn)曲線法求得未知蛋白質(zhì)（亞基）的相對分子質(zhì)量。 實(shí)際工作中，常用相對遷移率（用 mR 表示）代替 U 作圖。m mR R= =蛋白質(zhì)移動的距離溴酚藍(lán)移動的距離 二、等電點(diǎn)聚焦電泳二、等電點(diǎn)聚焦電泳（ Isoelectric Focusing ，IEF

47、） 等電點(diǎn)聚焦電泳等電點(diǎn)聚焦電泳是在電泳介質(zhì)中加入兩性離子載體，電泳時形成由陽極到陰極的連續(xù)遞增的pH梯度，蛋白質(zhì)按其電荷性質(zhì)不同各自向著與其等電點(diǎn)相等的pH處移動聚焦，從而彼此分離的電泳技術(shù)，無論P(yáng)r從正極出發(fā)或是從負(fù)極出發(fā)，都會聚焦在等電點(diǎn)處。高高pH等電聚焦電泳進(jìn)行過程中等電聚焦電泳進(jìn)行過程中低低pH（）（）（）（）高高pH等電聚焦電泳結(jié)束后等電聚焦電泳結(jié)束后低低pH（）（）（）（）1 1、等電點(diǎn)聚焦電泳分離、等電點(diǎn)聚焦電泳分離PrPr原理原理2、兩性電解質(zhì)載體、兩性電解質(zhì)載體 各組分的pI值十分接近，在電泳中可以形成連續(xù)的pH梯度，常用的商品名為Ampholine，規(guī)格有pH3.59.

48、0和精細(xì)分級的pH3.55、59、911的多種商品可供不同的要求使用。 由于其分辨率可達(dá)0.01pH單位，因此特別適合于分離分子量相近而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)組分。 液體介質(zhì)液體介質(zhì)3 3、支持、支持pHpH梯度的介質(zhì)梯度的介質(zhì)兩性電解質(zhì)載體在蔗糖密度梯度柱中形成pH梯度。凝膠介質(zhì)凝膠介質(zhì)兩性電解質(zhì)載體在凝膠內(nèi)形成pH梯度。凝膠中加有凝膠中加有兩性電解質(zhì)兩性電解質(zhì)溶液（溶液（pH9-3） 加電場后加電場后在凝膠內(nèi)形在凝膠內(nèi)形成一個穩(wěn)定成一個穩(wěn)定pH梯度梯度 加樣品，加樣品，然后繼續(xù)然后繼續(xù)電泳電泳凝膠染色表明凝膠染色表明樣品按照各自樣品按照各自pI值沿著值沿著pH梯度分布梯度分布第八節(jié)第八節(jié) 萃取

49、分離（萃取分離（extraction） 雙水相萃取雙水相萃取 超臨界萃取超臨界萃取 反膠束萃取反膠束萃取內(nèi)容：內(nèi)容：一、液一、液-液雙水相萃取液雙水相萃取(Aqueous Two Phase Extraction) 液-液雙水相法萃取酶，是近年來興起的一項新型分離技術(shù)，特別適用于從含有菌體等雜質(zhì)的酶液中直接萃取目的酶。此法可以除去大部分多糖、核酸等可溶性雜質(zhì)，具有一定的純化效果。 液-液雙水相法的兩相分別為互不相溶的兩個水相。利用溶質(zhì)在兩個互不相溶的水相中的溶解度不同而達(dá)到分離。（一）雙水相系統(tǒng)的形成（一）雙水相系統(tǒng)的形成(aqueous two-phase system, ATPS) 由于兩

50、種高分子聚合物之間存在相互排斥作用（由于兩種高分子聚合物之間存在相互排斥作用（不相容不相容性性），一種聚合物分子的周圍將聚集同種分子而排斥異種分子，），一種聚合物分子的周圍將聚集同種分子而排斥異種分子，當(dāng)達(dá)到平衡時，即形成分別富含不同聚合物的兩相。當(dāng)達(dá)到平衡時，即形成分別富含不同聚合物的兩相。 除雙聚合物系統(tǒng)外，聚合物與無機(jī)鹽的混合溶液也可形除雙聚合物系統(tǒng)外，聚合物與無機(jī)鹽的混合溶液也可形成雙水相。成雙水相。PEG = 聚已二醇(polyethylene glycol) Kpi = 磷酸鉀DX = 葡聚糖(dextran)（二）雙水相系統(tǒng)的選擇（二）雙水相系統(tǒng)的選擇兩種高聚物兩種高聚物一種高聚

51、物和一種無機(jī)鹽一種高聚物和一種無機(jī)鹽兩種非離子型高聚物：兩種非離子型高聚物：一種離子型和一種非離子型高聚物一種離子型和一種非離子型高聚物兩種聚電解質(zhì)兩種聚電解質(zhì)聚乙二醇/葡聚糖羧甲基葡聚糖鈉鹽/羧甲基纖維素鈉PEG/磷酸鉀、 PEG/硫酸銨（三）雙水相系統(tǒng)萃取酶的優(yōu)點(diǎn)（三）雙水相系統(tǒng)萃取酶的優(yōu)點(diǎn)1 1、用于直接從胞內(nèi)酶的細(xì)胞勻漿液中分離純化酶，較方便，、用于直接從胞內(nèi)酶的細(xì)胞勻漿液中分離純化酶，較方便，無需除去細(xì)胞碎片。無需除去細(xì)胞碎片。2 2、大規(guī)模雙水相萃取操作一般在室溫下進(jìn)行，無需低溫操作。、大規(guī)模雙水相萃取操作一般在室溫下進(jìn)行，無需低溫操作。3 3、可從實(shí)驗室直接放大到產(chǎn)業(yè)化規(guī)模。、可

52、從實(shí)驗室直接放大到產(chǎn)業(yè)化規(guī)模。雙水相分離細(xì)胞碎片和酶的流程：雙水相分離細(xì)胞碎片和酶的流程：雙水相法分離酶的過程示意圖1細(xì)胞懸浮液； 2細(xì)胞破碎機(jī)； 3萃取器；4PEG ； 5無機(jī)鹽； 6離心機(jī)；7含目標(biāo)產(chǎn)物的上清液； 8含細(xì)胞碎片的下相二、超臨界萃取二、超臨界萃取(Supercritical Fluid Extraction ) 超臨界萃取超臨界萃取，是利用欲分離物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體超臨界流體中的溶解度不同溶解度不同而達(dá)到分離的一種萃取技術(shù)。超臨界流體超臨界流體是指超過臨界溫度臨界溫度與臨界壓力臨界壓力狀態(tài)的流體。 1、什么是超臨界流體（Supercritical Fluid ，SCF）?C

53、O2的臨界溫度（的臨界溫度（Tc）：）：31.1，臨界壓力（，臨界壓力（Tc）：）：7.38MPa。2 2、超臨界流體的性質(zhì)、超臨界流體的性質(zhì)（1）密度接近于液體，這使它具有與液體溶劑相當(dāng)?shù)妮腿∧埽┟芏冉咏谝后w，這使它具有與液體溶劑相當(dāng)?shù)妮腿∧芰?。力。?）黏度和擴(kuò)散系數(shù)與氣體相近似，而溶劑的低黏度和高擴(kuò)）黏度和擴(kuò)散系數(shù)與氣體相近似，而溶劑的低黏度和高擴(kuò)散系數(shù)的性質(zhì)是有利于傳質(zhì)的，具有很高的傳質(zhì)速度。散系數(shù)的性質(zhì)是有利于傳質(zhì)的，具有很高的傳質(zhì)速度。（3）該流體隨著溫度與壓力的連續(xù)變化，對物質(zhì)的萃取具有）該流體隨著溫度與壓力的連續(xù)變化，對物質(zhì)的萃取具有選擇性。選擇性。氣體、超臨界流體和液體性質(zhì)

54、的比較氣體、超臨界流體和液體性質(zhì)的比較超臨界流體是指在超臨界流體是指在31.1和和13.78MPa時的時的CO2。3、超臨界流體萃?。?、超臨界流體萃取（Supercritical fluid extraction，SFE）（1）超臨界流體萃取技術(shù)（）超臨界流體萃取技術(shù)（SFE） 是利用超臨界流體（SCF）作為萃取劑，從液體或固體中萃取出特定成分，以達(dá)到某種分離目的的技術(shù)。 CO2由于具有合適的臨界條件，對健康無害，由于具有合適的臨界條件，對健康無害，不燃燒，不腐蝕，價格便宜和易于處理等優(yōu)點(diǎn)，是不燃燒，不腐蝕，價格便宜和易于處理等優(yōu)點(diǎn)，是最常用的超臨界萃取劑。最常用的超臨界萃取劑?？梢栽诮咏覝?/p>

55、下進(jìn)行提取，有效地防止了熱敏性可以在接近室溫下進(jìn)行提取，有效地防止了熱敏性物質(zhì)的氧化和逸散。物質(zhì)的氧化和逸散。CO2是一種不活潑的氣體，萃取過程中不發(fā)生化學(xué)是一種不活潑的氣體，萃取過程中不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，且屬不燃性氣體，無味，無毒，安全性非常好。反應(yīng)，且屬不燃性氣體，無味，無毒，安全性非常好。CO2氣體價格便宜，純度高，容易制取，且在生產(chǎn)氣體價格便宜，純度高，容易制取，且在生產(chǎn)中可以重復(fù)循環(huán)使用，從而有效地降低了成本。中可以重復(fù)循環(huán)使用，從而有效地降低了成本。分離工藝流程簡單。分離工藝流程簡單。萃取效率高，過程易于調(diào)節(jié)。萃取效率高，過程易于調(diào)節(jié)。（2）超臨界）超臨界CO2萃取的優(yōu)點(diǎn)萃取的優(yōu)點(diǎn)（3 3）超臨界流體萃取的應(yīng)用）超臨界流體萃取的應(yīng)用醫(yī)藥工業(yè)醫(yī)藥工業(yè)化學(xué)工業(yè)化學(xué)工業(yè)食品工業(yè)食品工業(yè)化妝品香料化妝品香料中草藥提取中草藥提取酶，纖維素精制酶，纖維素精制金屬離子萃取金屬離子萃取烴類分離烴類分離共沸物分離共沸物分離高分子化合物分離高分子化合物分離植物油脂萃取植物油脂