一株海洋瓊膠酶產(chǎn)生菌的分離篩選和初步鑒定

1、一株海洋瓊膠酶產(chǎn)生菌的分離、篩選和初步鑒定劉美英，梅建鳳，應(yīng)國清基金項目：浙江省科技計劃項目（2007C33068）作者簡介：劉美英，女，碩士研究生 *通訊作者：應(yīng)國清，男，教授，碩士生導(dǎo)師 Tel: (0571) 88871029 E-mail: gqying，王鴻（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州310014）摘要：目的 從海水中分離活性較高的瓊膠酶產(chǎn)生菌，以制備瓊膠酶用于瓊膠寡糖的生產(chǎn)，瓊膠寡糖具有多種生物活性，在食品、化妝、醫(yī)藥等行業(yè)有廣闊的應(yīng)用前景。方法 以瓊膠為唯一碳源，用稀釋涂布平板法進(jìn)行分離，平板透明圈法進(jìn)行初篩，搖瓶培養(yǎng)法進(jìn)行復(fù)篩，改進(jìn)的DNS比色法進(jìn)行酶活力的測定。結(jié)果 從海

2、水中分離篩選到18株瓊膠降解菌株，經(jīng)復(fù)篩得到一株產(chǎn)酶活力較高的海洋細(xì)菌HS0326-601，并對該菌株進(jìn)行了初步鑒定，結(jié)果表明其為革蘭氏陰性細(xì)菌，菌體呈短桿狀。結(jié)論 鑒于該菌株生長速度快，通過對其進(jìn)一步的誘變和發(fā)酵條件優(yōu)化，有望成為高產(chǎn)瓊膠酶產(chǎn)生菌，從而為瓊膠酶、瓊膠寡糖的深入研究和開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：瓊膠降解菌；瓊膠酶；分離；篩選中國分類號： 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0000-0000(2008)00-0000-00Isolation, Screening and Identification of AgaraseProducing Bacteria from the Seawate

3、rLIU Mei-ying, MEI Jian-feng, YING Guo-qing*, WANG Hong (College of pharmaceutical science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)ABSTRACT: OBJECTIVE To degrade agar into agaro-oligosaccharide by the agarase with a higher activity, the strains were separated from seawater. The ag

4、aro-oligosaccharide have shown wide application values in food industry, cosmetic industry, pharmaceutical industry and other sectors. METHODS The agarase-producing baceria were isolated by the spread plate method, first-screening by clear halos on agar plate containing agar as the sole-carbon sourc

5、e, second-screening of shaking culture. The enzymatic activities were determined by improved DNS colorimetry method. RESULTS 18 agar-degrading strains were isolated from the seawater, and a more powerful agarase-producing marine bacterium was obtained. The strain was designated as strain HS0326-601

6、and identified preliminarily as Gram negative, rod-shaped. CONCLUSION With regard to its high growth speed, if further treated with mutagens, the strain might be one with a high enzymic activity after fermentation optimization, and it could be used to the further study and applied to the preparation

7、 of agarase for agaro-oligosaccharide production in industry. KEY WORDS: agarase-producing bacteria; agarase; isolation; screening瓊膠（agar）是一種從海洋紅藻中提取得到的多糖，其在食品、醫(yī)藥衛(wèi)生等行業(yè)已有悠久的應(yīng)用歷史，但由于瓊膠黏度高，水溶性低，不易被吸收，因此在應(yīng)用方面受到很大的限制。而瓊膠寡糖（agaro-oligosaccharide），即瓊膠多糖經(jīng)水解后聚合度為210的低聚糖，又稱瓊膠低聚糖，主要由瓊二糖的重復(fù)單位連接而成，水溶性好，有利于人體吸收，大

8、大提高了其應(yīng)用價值，瓊膠寡糖具有較強(qiáng)的抗癌1, 2、抗氧化3, 4、抗炎2, 5及抗病毒1, 6等活性，是一種極具開發(fā)潛力的低聚糖。瓊膠酶能降解瓊膠生成瓊膠寡糖, 與瓊膠的化學(xué)降解相比，瓊膠酶降解瓊膠則具有特異性強(qiáng)的優(yōu)點，可選擇性地酶解切斷特定化學(xué)鍵，從而制得特定聚合度的寡聚糖，并且具有反應(yīng)條件溫和，降解過程易于控制，無副反應(yīng)，環(huán)境污染少等優(yōu)點，在制備瓊膠寡糖中具有明顯的優(yōu)勢。除了制備瓊膠寡糖之外，瓊膠酶還可用作工具酶、用于回收DNA或RNA、海藻多糖結(jié)構(gòu)的研究等7, 8。我國對于海藻多糖降解酶的研究尚處于起步狀態(tài)，進(jìn)行的研究大多局限于產(chǎn)酶菌株的篩選、酶的制備、純化與性質(zhì)分析、及酶的應(yīng)用等方面

9、，還未見關(guān)于其投入規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)的報道，關(guān)鍵就在于缺乏酶活力高的菌株9。因此篩選高產(chǎn)瓊膠酶產(chǎn)生菌具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。目前，瓊膠酶產(chǎn)生菌可以從海水、海洋動物腸道、底泥等海洋環(huán)境以及湖泊、河流、排污口等陸地環(huán)境中獲得1, 1012，甚至從菠菜根系中也可篩選到瓊膠降解菌株13，但大多數(shù)瓊膠酶產(chǎn)生菌從海洋環(huán)境中分離得到1。本實驗先后從舟山、臺州等地采集海水樣，從中分離篩選到一株活力較高的菌株，并對其進(jìn)行了初步鑒定。旨在為瓊膠酶、瓊膠寡糖的深入研究和開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 海水樣品 取自浙江舟山冊子島、金塘和朱家尖等藻類繁殖地和臺州溫嶺箬橫、塢沙門及三門等紫菜養(yǎng)

10、殖地海水。1.1.2 培養(yǎng)基組成 分離培養(yǎng)基（%）：NaCl 2.5；NH4Cl 0.1；MgSO47H2O 0.5；KCl 0.1；FeSO47H2O 0.002；CaCl2 0.02；NaH2PO4 0.06；瓊脂 2；pH 7.0。 斜面培養(yǎng)基（%）：NaCl 2.5；酵母浸出粉 0.5；MgSO47H2O 0.5；KCl 0.1；FeSO47H2O 0.002；CaCl2 0.02；NaH2PO4 0.06；葡萄糖 0.1；瓊脂 2；pH 7.0。 復(fù)篩培養(yǎng)基（%）：瓊脂 0.2；酵母浸出粉 0.25；其他成分同海水分離培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)基均為121 、20 min滅菌；液體培養(yǎng)基裝量為

11、35 ml/250 ml搖瓶。1.2 方法1.2.1 海水樣品的采集 采集海水樣品裝于塑料瓶中，紫菜等樣品裝于樣品袋中。采集的樣品置于4冰箱保存。1.2.2 樣品的馴化富集 取瓊膠適量，海水樣品40 mL，在酒精燈旁加入250 mL錐形瓶中，28 、200 rmin-1連續(xù)振蕩培養(yǎng)，定期加入適量蒸餾水至原體積，目測培養(yǎng)液明顯混濁后，取培養(yǎng)液4 mL接種于含瓊膠5g、36 mL該海水樣品的三角瓶中，重復(fù)上述培養(yǎng)過程。1.2.3 菌株的分離 采用稀釋涂布平板法：用無菌移液管吸取海水或富集樣品5 mL，加入含一層玻璃珠和45 mL無菌人工海水的三角瓶中，200 rmin-1振蕩30 min，混勻制成

12、菌懸液，用無菌人工海水適當(dāng)稀釋，移取0.2 ml涂布于分離培養(yǎng)基平板上，28 培養(yǎng)，直至平板上長出菌落。1.2.4 菌株的初篩觀察平板上菌落形態(tài)，挑取周圍形成明顯凹陷的菌落，并在平皿底部作標(biāo)記，再滴加盧戈氏碘液染色。保留那些平板上能產(chǎn)生透明圈菌落的對應(yīng)斜面，棄去染色后無透明圈菌落的對應(yīng)斜面，將前者置于28 培養(yǎng)，供復(fù)篩用。1.2.5 菌株的復(fù)篩用接種環(huán)挑取初篩菌株的新鮮斜面菌苔2環(huán)，接入復(fù)篩搖瓶培養(yǎng)基中，28 、200 rmin-1發(fā)酵培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液于3000 rmin-1下離心10 min后取上清液測酶活力，篩選出產(chǎn)酶活力最高的菌株進(jìn)行純化。1.2.6 菌種純化用接種環(huán)挑取復(fù)篩得到的

13、新鮮斜面種菌苔，用無菌人工海水適當(dāng)稀釋，取0.2 mL涂布于分離培養(yǎng)基平板上。28 培養(yǎng)，直至平板上長出菌落，將單菌落挑至斜面上培養(yǎng)。然后進(jìn)行復(fù)篩，方法同1.2.4，篩選出產(chǎn)酶活力最高的菌株用于發(fā)酵產(chǎn)酶。1.2.7 瓊膠酶活力的測定 粗酶液的制備 將發(fā)酵液于3000 rmin-1下離心10 min后上清液即為粗酶液。 改進(jìn)的DNS比色法測定瓊膠酶活力 用pH 7.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液配制0.2 %的瓊膠底物溶液20 mL。加入4 mL待測酶液，35 、150 rmin-1搖床反應(yīng)1 h。立即取1 mL反應(yīng)液于帶有刻度的試管中，加入0.5 mL DNS溶液于沸水浴中共熱5 m

14、in后立即冷卻至室溫，定容至10 mL。測520 nm波長處的吸光度。 酶活力單位定義 在上述反應(yīng)條件下，1 mL酶液1 min產(chǎn)生l g還原糖為一個酶活（U）。1.2.8 菌體濃度的測定 采用紫外-可見分光光度法在620 nm 波長下測定培養(yǎng)液的吸光度。1.2.9 菌株的初步鑒定瓊膠降解菌株的初步鑒定按參照文獻(xiàn)14進(jìn)行。首先觀察菌落形態(tài)、鏡檢觀察個體形態(tài)，革蘭氏染色，再作進(jìn)一步鑒定。2 結(jié)果與分析2.1 瓊膠降解菌株的篩選2.1.1 菌株的初篩在對舟山、臺州各地的海水樣進(jìn)行早期篩選后發(fā)現(xiàn)，溫嶺箬橫紫菜養(yǎng)殖地的海水樣中的瓊膠酶產(chǎn)生菌較多，且產(chǎn)酶活力也較高。故在本研究中對該海水樣進(jìn)行馴化富集，以

15、瓊膠為唯一碳源進(jìn)行富集培養(yǎng)，以期獲得更多、酶活力更高的瓊膠降解菌株。平板培養(yǎng)后用盧戈氏碘液染色，瓊膠與碘結(jié)合而被染色。產(chǎn)瓊膠酶的菌株，由于其菌落周圍瓊膠被降解形成瓊膠寡糖，而瓊膠寡糖具有還原性，不能著色，因此其菌落周圍可形成透明圈，這樣便可以很好地從海水樣中分離篩選到瓊膠降解菌。觀察培養(yǎng)基平板可發(fā)現(xiàn)菌落所在的培養(yǎng)基呈釜底形凹陷，并且有較大的透明圈，篩選的平板透明圈見圖1。采用此法，分離到了18株瓊膠降解菌，分別測定其菌落直徑和透明圈直徑，結(jié)果見表1。圖1 瓊膠酶篩選平板經(jīng)盧戈氏碘液染色后的照片F(xiàn)ig. 1 Photograph of the agar plate stained by Lugo

16、ls for agarolytic strains screening表1 18株瓊膠降解菌菌落直徑和透明圈直徑Tab. 1 Diameter of colony and halo from 18 strainsStrainsDiameter of colonies (DC ) /cmDiameter of inner clear halos (DH ) /cmHC value (DH / DC)10.2140.4382.04720.2300.4662.02630.2020.4282.11940.1620.3602.22250.1860.3902.09760.5241.0181.94370.1

17、200.3042.53380.2400.4842.01790.2160.3981.843100.1980.4122.081110.1000.2862.860120.0540.2083.852130.1180.2462.085140.2140.5362.505150.1880.4882.596160.8302.0162.429170.2000.4522.260180.2100.5102.429由表1可以看出，6、14、16號菌株所產(chǎn)的透明圈較大，但由于即使同一個平皿上長出的菌落，其大小也不一，細(xì)胞生物量也有所不同，透明圈的大小并不能反映菌株產(chǎn)酶的比活性，因此分別測定它們的菌落直徑，但發(fā)現(xiàn)這18株

18、菌株的HC值（DH / DC）也相差不大。為了客觀地反映菌體的生長和產(chǎn)酶能力，將此18株菌株進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。2.1.2 菌株的復(fù)篩利用平板初篩只能定性地挑選出產(chǎn)酶菌株，而以搖瓶培養(yǎng)形式進(jìn)行的復(fù)篩則可以定量地比較各菌株產(chǎn)酶活力及其菌體生長情況。復(fù)篩培養(yǎng)基仍以瓊膠作為唯一碳源，培養(yǎng)48 h后分別測定發(fā)酵液的瓊膠酶活力和菌體濃度。結(jié)果見表2。表2 復(fù)篩各菌株產(chǎn)酶活力的比較Tab. 2 Comparision of agarase activity produced by different strainsStrainsEnzyme activity /UConcentration of strai

19、ns (OD620)19.381.96424.251.08639.201.61245.090.81354.430.719612.091.19075.091.44483.591.46994.900.618105.461.572116.020.807123.870.693135.091.134144.811.534156.580.7621611.250.285175.271.012186.581.639由表2可見，6和16號菌株的酶活較高，分別為12.09 U和11.25 U，選前者作為高產(chǎn)菌株，編號為HS0326-6。在此值得一提的是，16號菌株的透明圈直徑為2.016 cm，其HC值為2.42

20、9 cm，而6號菌株透明圈和HC值各為1.018 cm和1.943 cm。可見16號菌株的透明圈和HC值均比6號大，而前者的酶活卻不如后者，其他菌株的情況也與此類似，這就說明在評價菌株產(chǎn)酶活性高低時，應(yīng)以搖瓶復(fù)篩數(shù)據(jù)為準(zhǔn)，而初篩中透明圈和HC值的大小僅作參考。這與湯海青9指出的“透明圈的大小與菌株產(chǎn)酶活性的高低有一定正相關(guān)”并不一致。關(guān)于透明圈和酶活之間的關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。2.1.3 菌種純化從自然環(huán)境中的微生物樣品，經(jīng)過一次分離形成單菌落，轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)得到的菌株，因脫離了自然環(huán)境條件，在傳代培養(yǎng)中細(xì)胞發(fā)生性狀衰退的頻率增加，直接使用往往存在酶活急劇下降，甚至喪失酶活，需要經(jīng)過多次純化培養(yǎng)

21、才能達(dá)到穩(wěn)定的遺傳。實驗對復(fù)篩得到的高產(chǎn)瓊膠降解菌株HS0326-6進(jìn)行試管斜面活化和平板再次純化，以篩選出產(chǎn)酶活力較高且穩(wěn)定的菌株。經(jīng)過純化培養(yǎng)，得到高產(chǎn)菌株HS0326-601，其酶活為20.78 U，較純化前提高了72 %，且酶活穩(wěn)定。2.2 菌株HS0326-601的初步鑒定菌株HS0326-601在分離培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，3-4 d天可以形成菌落，菌落大小中等。菌落形態(tài)特征為：菌落呈圓形，淡黃色，邊緣整齊，表面濕潤，中央凹陷，不透明（圖2）。斜面培養(yǎng)21 h左右菌苔鋪滿斜面，菌苔呈淡黃色，厚度中等（圖3）。鏡檢觀察菌株的個體形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果表明，菌株HS0326-601為革蘭氏陰性

22、細(xì)菌，菌體呈短桿狀，見圖4。圖2 瓊膠降解菌的平板純化圖Fig. 2 Clones of agarolytic bacteria in plate cultivation圖3 瓊膠降解菌的斜面培養(yǎng)Fig. 3 Tube culture of agarolytic bacteria 圖4 顯微鏡觀察的菌體（放大1000倍）Fig. 4 The shape of strain observed by microscopy（×1000）3 討 論3.1 在對紫菜養(yǎng)殖地的海水樣、紫菜樣及土樣進(jìn)行早期篩選后發(fā)現(xiàn)，海水樣中篩選到的瓊膠降解菌株較多，且產(chǎn)酶活力明顯高于后兩者。故本實驗對海水樣進(jìn)行馴

23、化富集，以期獲得更多、產(chǎn)酶活力更高的瓊膠降解菌株。3.2 本實驗中發(fā)現(xiàn)，透明圈和HC值均較大的菌株，其酶活不一定較高，說明在評價菌株產(chǎn)酶活性高低時，我們應(yīng)以搖瓶復(fù)篩數(shù)據(jù)為準(zhǔn)，而初篩中透明圈和HC值的大小僅作參考。3.3 菌株HS0326-601在分離培養(yǎng)基平板上生長較慢，一般需要34 d左右才能長成大小適宜的單菌落。而斜面培養(yǎng)時生長則較快， 培養(yǎng)21 h左右即可長出較厚的菌苔。鑒于該菌株生長速度快，通過對其進(jìn)一步的誘變和發(fā)酵條件優(yōu)化，有望成為高產(chǎn)瓊膠酶產(chǎn)生菌，從而為瓊膠酶、瓊膠寡糖的深入研究和開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。此外，實驗中還發(fā)現(xiàn)此類菌株對環(huán)境變化較為敏感，遺傳性能不夠穩(wěn)定，多次傳代后產(chǎn)酶活力有

24、所下降。因此，在后續(xù)實驗中，除了對菌種進(jìn)行保藏之外，還需對菌株進(jìn)行定期活化。目前正在對此菌株進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，同時，為提高其產(chǎn)酶活力，對該菌株的誘變選育和發(fā)酵條件優(yōu)化也正在進(jìn)行之中。REFERENCES1 WANG J X , MOU H J , JIANG X L . Biological activities of a neutral water-soluble agar polysaccharide prepared by agarase degradationJ. High Tech Lett, 2005, 11(4): 415-420.2 ENOKI T , SAGAWA H , T

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