巨噬細(xì)胞在骨髓干細(xì)胞動(dòng)員促深靜脈血栓溶解中的作用

1、巨噬細(xì)胞在骨髓干細(xì)胞動(dòng)員促深靜脈血栓溶解中的作用         10-09-03 14:56:00     作者：孫浩 陳以寬    編輯：studa20【摘要】  目的：探討骨髓干細(xì)胞動(dòng)員對(duì)深靜脈血栓中巨噬細(xì)胞密度和功能的作用。方法：SD成年大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、血栓組和rhG-CSF組。分析術(shù)后第7、14天血栓中巨噬細(xì)胞密度變化并在電子顯微鏡下觀察血栓中巨噬細(xì)胞的功能。結(jié)果：rhG-CSF組血栓中巨噬細(xì)胞密度明顯增加，與

2、血栓組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。巨噬細(xì)胞吞噬功能活躍，溶酶體和吞噬體增多，常見新生幼稚血管和成熟再通血管。結(jié)論：骨髓干細(xì)胞動(dòng)員增加了血栓中巨噬細(xì)胞密度，增強(qiáng)了其功能，促進(jìn)了血栓溶解吸收過程。 【關(guān)鍵詞】  骨髓祖代細(xì)胞·靜脈血栓形成·巨噬細(xì)胞    【ABSTRAT】 Objective: To discuss the effect of bone marrow stem cell mobilization on density and function of macrophages in deep vein thrombo

3、sis. Methods: Adult SD rats were divided randomly into sham operation group, thrombus group and rhG-CSF group. Analyzed the density change of macrophages in thrombus on the 7th and 14th day after operation and observed the function of macrophages in thrombus by electron microscope. Results: Density

4、of macrophages in thrombus significantly increased in rhG-CSF group, compared with that in thrombus group（P0.05）. Macrophage phagocytic function was active, lysosomes and phagosomes increased, neonatal immature blood vessels and mature recanalized blood vessels were common. Conclusion: Bone marrow s

5、tem cell mobilization increases the density of macrophages in thrombus, enhances the    function of macrophages in thrombus, promotes the process of thrombolysis and the absorption of thrombus.    【KEY WORDS】 Myeloid progenitor cells·Venous thrombosis·Macropha

6、ges    深靜脈血栓形成（deep vein thrombosis, DVT）是血管外科常見疾病，目前國內(nèi)外仍然以非手術(shù)治療為主1-2，促進(jìn)血栓的早期溶解和吸收有助于血栓的治療。機(jī)體內(nèi)靜脈血栓的最終吸收和溶解主要是依賴于機(jī)體本身的慢性自然溶解機(jī)制，即是血栓的機(jī)化過程。在人體和動(dòng)物靜脈血栓的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：血栓的再血管化主要出現(xiàn)在巨噬細(xì)胞密度較高的區(qū)域3。Misao等4研究發(fā)現(xiàn)骨髓動(dòng)員可增加心肌梗死區(qū)骨髓來源的巨噬細(xì)胞的聚集。本研究通過骨髓干細(xì)胞動(dòng)員，探討其是否能對(duì)大鼠深靜脈血栓中巨噬細(xì)胞密度和功能有促進(jìn)作用，從而加快血栓的溶解、吸收過程。  &

7、#160; 1材料與方法    1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組選用清潔級(jí)成年雄性SD大鼠40只，8周齡，體質(zhì)量（250±10） g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、血栓組和重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colony-stimulating factor, rhG-CSF）組。假手術(shù)組8只，血栓組和rhG-CSF組各16只。    1.2   主要試劑與儀器小鼠抗大鼠CD68單克隆抗體（Lab Vision公司）；山羊抗小鼠IgG（武漢博

8、士德生物工程有限公司）；DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（北航CM-2008B型）；OLYMPUS CH型光學(xué)顯微鏡（日本）；透射電子顯微鏡H-600型（HITACH公司）    1.3下腔靜脈血栓模型的建立參照文獻(xiàn)5的方法并加以改進(jìn)。血栓組SD大鼠在新環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用10%水合氯醛腹腔內(nèi)麻醉（350 mg/kg），取仰臥位，四肢外展固定，腹部皮膚消毒，正中切口進(jìn)腹。顯露左腎靜脈以下下腔靜脈并結(jié)扎其屬支，用神經(jīng)血管鉗阻斷下腔靜脈1 min，松開30 s，再阻斷1 min，順下腔靜脈放置注射針頭1根，以4-0絲線于左腎

9、靜脈下方結(jié)扎下腔靜脈和針頭，取出針頭，縫合腹壁。術(shù)后動(dòng)物自由飲水，正常飼養(yǎng)，不用抗生素，均成活。    假手術(shù)組大鼠下腔靜脈未行縮窄及阻斷，余處理同血栓組。rhG-CSF組為模型鼠術(shù)后連續(xù)7 d在腹部皮下注射rhG-CSF（25 g/kg），假手術(shù)組和血栓組同時(shí)在腹部皮下注射等量生理鹽水。    1.4標(biāo)本獲取術(shù)后第7、14天，以水合氯醛麻醉，經(jīng)原腹部切口打開腹腔，解剖下腔靜脈，將血栓組和rhG-CSF組形成血栓的一段下腔靜脈連同其內(nèi)部的血栓一同切下，放于4%多聚甲醛中固定。近心段用于免疫組織化學(xué)觀察，遠(yuǎn)心段用于電子顯微鏡超微結(jié)構(gòu)觀察

10、。    1.5免疫組織化學(xué)染色與結(jié)果判定石蠟包埋標(biāo)本，間隔50 m連續(xù)切片3張。切片常規(guī)脫蠟和水化，抗原修復(fù)，滴加1% BSA封閉液，甩去多余液體。滴加的一抗為稀釋的小鼠抗大鼠CD68單克隆抗體（1100），37 、1 h左右。PBS（pH=7.6）沖洗2 min/次×3次。滴加HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，室溫20 min。PBS（pH=7.6）沖洗2 min/次×3次。滴加SABC，室溫20 min。PBS（pH=7.6）沖洗5 min/次×4次。DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染。脫水、封片，400倍光學(xué)顯微鏡下觀察。 &#

11、160;  結(jié)果判定：細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色染色為巨噬細(xì)胞CD68陽性染色。圖像分析系統(tǒng)測定血栓中陽性細(xì)胞的面積和血栓總面積，計(jì)算二者的比值，算出3張切片的平均百分?jǐn)?shù)，即為該標(biāo)本的巨噬細(xì)胞密度。    1.6超微結(jié)構(gòu)觀察遠(yuǎn)心段固定的組織由重慶醫(yī)科大學(xué)電鏡室處理，血栓組和rhG-CSF組各取8例標(biāo)本。主要經(jīng)脫水、浸透、環(huán)氧樹脂包埋、切片、定位、電子染色，切片于H-600型透射電子顯微鏡下觀察。    1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P0.05為差異

12、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。    2結(jié)果    2.1血栓中巨噬細(xì)胞密度假手術(shù)組術(shù)后無血栓形成，另2組靜脈血栓中巨噬細(xì)胞CD68免疫組織化學(xué)染色為陽性（圖1）。術(shù)后第7天，血栓組巨噬細(xì)胞CD68標(biāo)記稀疏，巨噬細(xì)胞數(shù)量極少，未見新生血管；rhG-CSF組巨噬細(xì)胞CD68標(biāo)記明顯增多，可見較多新生血管，主要位于血栓內(nèi)巨噬細(xì)胞集聚的區(qū)域。術(shù)后第14天，血栓組巨噬細(xì)胞數(shù)量仍較少，但新生毛細(xì)血管出現(xiàn)；而rhG-CSF組巨噬細(xì)胞和新生血管數(shù)量則更多，同時(shí)在血栓內(nèi)部也有較多標(biāo)記CD68的巨噬細(xì)胞和新生血管。圖像分析系統(tǒng)結(jié)果顯示：術(shù)后第7天，血栓組血栓中巨噬細(xì)胞密度為（1.57±0.82）%，rhG-CSF組為（8.58±1.24）%，2組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003 7）。術(shù)后第14天，血栓組和rhG-CSF組血栓中巨噬細(xì)胞密度分別為（5.62±1.07）%和（14.52±1.32）%，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意