（精選）胰蛋白酶活性測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)一 胰蛋白酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆諟y(cè)定胰蛋白酶濃度、活性、比活的原理與方法。實(shí)驗(yàn)原理：胰蛋白酶相對(duì)分子量23.7 KD，主要水解肽鏈中堿性氨基酸與其它氨基酸相連接的肽鍵，此外還能水解堿性氨基酸形成的酯鍵， 如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解為H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。胰蛋白酶所催化的上述反應(yīng)中，產(chǎn)物BA對(duì)253 nm 的光吸收遠(yuǎn)大于BAEE，因此可以在實(shí)驗(yàn)起始點(diǎn)把253 nm 的消光值調(diào)為零，然后記錄反應(yīng)體系對(duì)253 nm 的消光值的增量，并把這個(gè)增量作為測(cè)定胰蛋白酶的活性指標(biāo)。酶活單位定義：在底物

2、BAEE濃度1m mol/L，光程1 cm，波長(zhǎng)253nm，溫度25 0C，測(cè)量體積3mL,.條件下吸光值每分鐘遞增0.001（DA/min=0.001）為1個(gè)BAEE酶活單位。胰蛋白酶制劑中蛋白質(zhì)濃度含義 ：胰蛋白酶含量一般E1%表達(dá)。這個(gè)值的含義是：濃度為1% 酶蛋白，在1cm光徑下，對(duì)紫外280nm的消光值。不同廠家、不同產(chǎn)品的E1%值有很大差別。E1% 值越高，表明酶制劑中酶蛋白含量越高。 由于酶制劑中蛋白質(zhì)含量各不相同，所以用酶制劑配制E1%的蛋白質(zhì)溶液時(shí)，按照廠家對(duì)產(chǎn)品的E1% 的測(cè)定值配制溶液。 在本實(shí)驗(yàn)中，胰蛋白酶酶蛋白樣品采用SIGMA 公司生產(chǎn)的產(chǎn)品,生產(chǎn)公司對(duì)展品的描述是

3、對(duì)280nm紫外吸收值15.3， 配制胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)溶液可根據(jù)廠家的這個(gè)說(shuō)明。器材以試劑：器材，電子天平，紫外分光光度計(jì)，微量加樣器。試劑： 標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。1胰蛋白酶活性測(cè)定：1）配制E1% 的胰蛋白酶溶液每組取E1%=15.3的 胰蛋白酶樣品10mg 放到1ml去離子水中，充分溶解后，放入冰中保存。2)按照表1 的要求配制試驗(yàn)體系所需其它各種溶液.3)按照表1的順序進(jìn)行測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶的活性。表1 胰蛋白酶活性測(cè)定加樣順序試劑 步驟1：空白調(diào)零 步驟2：樣品測(cè)定0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖液,pH 8.0 , 1.5 mL 1.5

4、mL2.0 m mol/L BAEE 1.5 mL 1.5 mL250C預(yù)熱5min 250C預(yù)熱5min 胰蛋白酶: 10mg/mL 0 mL 10 mL蒸餾水 10 mL 0 mL 充分搖勻 充分搖勻 步驟1：DA253 nm/min 調(diào)0 - 步驟2：DA253-nm/min - 記錄 在步驟2樣品測(cè)定中，加入酶液后立即蓋上蓋迅速混勻計(jì)時(shí)，每半分鐘讀數(shù)一次，共讀34min。測(cè)得的結(jié)果要使A253nm/min控制在0.050.100之間為宜，若偏離此范圍則要適當(dāng)增減酶量（5 mL -20 mL之間，空白試驗(yàn)相應(yīng)增減等體積水）后重新測(cè)定，一直到A253nm/min值落在0.050.100之間

5、為止。3分別求算：1)標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶溶液（濃度10mg/mL）的酶活和比活：計(jì)算方法：i)胰蛋白酶活性單位數(shù)計(jì)算：ii)胰蛋白酶比活計(jì)算: (用BAEE單位數(shù)/mg胰蛋白酶表示比活)實(shí)驗(yàn)二 胰蛋白酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)康模撼醪秸莆找韵聨讉€(gè)酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定與求算方法：米氏常數(shù)Km,最大反應(yīng)速度Vmax,轉(zhuǎn)換數(shù)kcat,特異性常數(shù)kcat,/Km。實(shí)驗(yàn)原理：已知胰蛋白酶遵守米氏方程，可以通過(guò)測(cè)定底物濃度與反應(yīng)速度間的關(guān)系測(cè)定與求算這個(gè)酶的諸動(dòng)力學(xué)參數(shù)。胰蛋白酶可以水解堿性氨基酸的羧基所生成的肽鍵、酰胺建和酯鍵。在本實(shí)驗(yàn)中，利用胰蛋白酶水解酰胺鍵活性的性質(zhì)，以苯甲酰-L-精氨酰-對(duì)硝基苯胺（BAPA）作底

6、物測(cè)定這個(gè)酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，反應(yīng)式如下：反應(yīng)最適pH8.1,最適溫度25 0C。反應(yīng)產(chǎn)物之一：對(duì)硝基苯胺 (p-Nitroaniline，4 -NA)呈黃色，對(duì)405nm波長(zhǎng)光的摩爾吸光系數(shù)為9870，但底物BAPA 和另一個(gè)產(chǎn)物BA對(duì)405nm波長(zhǎng)的光基本不吸收， 因此本實(shí)驗(yàn)測(cè)定光波的波長(zhǎng)設(shè)在405nm上，把起始反應(yīng)的吸光值調(diào)為0，記錄消光值的變化。L-BAPA最大濃度低于5´104mol/L時(shí)這個(gè)酶促反應(yīng)符合米氏方程，可用Hanes作圖法求動(dòng)力學(xué)參數(shù)。Hanes作圖法是單倒數(shù)作圖法，把米氏方程變形為：在實(shí)驗(yàn)中設(shè)定一系列底物濃度Si，測(cè)定每一個(gè)底物濃度條件下的反應(yīng)速度ni,然后用Si

7、/ni 對(duì)Si作圖，可以得到一條線段，線段在y軸的截距是Km/Vmax, 線段的延長(zhǎng)線在x軸的截距是-Km，據(jù)此可以得到Km和 Vmax值；kcat=Vmax / Et。Et是酶的初始濃度，已在實(shí)驗(yàn)設(shè)定為已知,因此kcat可以得出；特異性常數(shù)Km/ kcat可根據(jù)上述已知數(shù)計(jì)算出來(lái)。器材與試劑：器材：756紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，恒溫水浴鍋，分析天平，秒表，容量瓶，移液器。試劑：10.1mol/L pH8.1的Tris-HCI緩沖液（含0.4%CaCl2）：取 0.2mol/L Tris（Mr=121.14）100mL與0.2mol/L HCI 52.4mL混勻，加入0.8gCaCl2,蒸餾水定

8、容到200mL（pH值需用計(jì)pH校正）。21mmol/L DL-BAPA（Mr=434.9）水溶液：稱取43.49mg BAPA，蒸餾水溶解并加熱到80 0C以上，完全溶解后置冰水中冷卻，定容到100mL。 這個(gè)濃度為1mmol/L的DL-BAPA溶液命名為第六組母液，按照逐步稀釋原則配制下列溶液濃度系列：0.8m mol/L （第五組母液，25mL）； 0.6m mol/L （25mL，第四組母液）；0.4m mol/L （25mL，第三組母液）；0.2 m mol/L （10 mL，第二組母液）；0.1 m mol/L （10mL，第一組母液）。360%（V/V）乙酸溶液4胰蛋白酶溶液，該

9、酶的比活ñ1.0´104 BAEE 單位/mg蛋白 實(shí)驗(yàn)步驟：1 計(jì)算胰蛋白酶加樣體積：在本實(shí)驗(yàn)中加入胰蛋白酶的量是60mg，實(shí)驗(yàn)1 已經(jīng)測(cè)到胰蛋白酶的比活和濃度（mg/mL），根據(jù)這些值計(jì)算加入體系的酶液體積的mL數(shù)。2 實(shí)驗(yàn)溶液系統(tǒng)：本實(shí)驗(yàn)有6組實(shí)驗(yàn)組成。實(shí)驗(yàn)順序按照表2的加樣程序執(zhí)行。 離曲線ianIMEI 表2. 測(cè)定Km 和Vmax值加樣表組BAPA母液濃度（m mol/L）加入BAPA母液（mL）加入Tris-HCI（mL）加入胰蛋白酶（mL）加入60%乙酸（mL）反應(yīng)體系底物BAPA濃度（m mol/L）nA4051.0.1樣品1, 2.0對(duì)照 1, 2.01

10、.51.6n00.40.4S10.0520.2樣品2, 2.0對(duì)照2, 2.01.51.6n00.40.4S20.130.4樣品3, 2.0對(duì)照3, 2.01.51.6n00.40.4S3 0.240. 6樣品4, 2.0對(duì)照4, 2.01.51.6n00.40.4S40.350.8樣品5, 2.0對(duì)照5, 2.01.51.6n00.40.4S50.461 .0樣品6, 2.0對(duì)照6, 2.01.51.6n00.40.4S60.525 0C 保溫5 min后，搖勻，秒表計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確反應(yīng)2min后加入0.4mL 60%的乙酸溶液，搖勻終止反應(yīng)。反應(yīng)溶液總量應(yīng)達(dá)到4mL,不足部分可加蒸餾水補(bǔ)足。對(duì)照

11、試管不加入胰蛋白酶，只加入0.4mL 60%的乙酸溶液。最后分別記錄樣品和對(duì)照的A405 值，每組種兩者的差值D A405 代入下式即可得到對(duì)應(yīng)于Si的ni表2列出的是6個(gè)實(shí)驗(yàn)，鑒于目前實(shí)驗(yàn)室尚沒(méi)有12個(gè)槍頭的加樣，所以每一個(gè)實(shí)驗(yàn)都可獨(dú)立進(jìn)行。需要特別注意：1）比活大于1.0´104 BAEE u/mg protein的胰蛋白酶制劑，純度范圍是90%-100%，一般可達(dá)到95%-97%。在計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)時(shí)，如無(wú)特殊精確要求，可按照胰蛋白酶100%的近似值計(jì)算。在本試驗(yàn)中，可根據(jù)濃度胰蛋白酶濃度10mg/ml， 純度100%, 每個(gè)試管要求加入質(zhì)量數(shù)60mg，計(jì)算出每個(gè)試管加入的胰蛋白

12、酶溶液微升數(shù)。2）在進(jìn)行動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算時(shí)，要進(jìn)行胰蛋白酶質(zhì)量-摩爾數(shù)轉(zhuǎn)換，如無(wú)特殊要求，也可以把胰蛋白酶純度近似為100%.3）如果有求精確, 但產(chǎn)品說(shuō)明沒(méi)有給出胰蛋白酶在固形物中的百分含量，就需配制一定濃度的固形物溶液，首先測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，通過(guò)求算蛋白質(zhì)總量，得到蛋白質(zhì)在酶制劑中的重量比。然后通過(guò)雙向電泳，圖像掃描，把掃描結(jié)果輸入計(jì)算軟件，按照軟件步驟，求算胰蛋白酶在全部蛋白樣品中的百分比。把實(shí)驗(yàn)設(shè)定的每一個(gè)Si和測(cè)定到的對(duì)應(yīng)的Vi換算成Si/Vi后,填入表3，作圖求Km，Vmax表3. Hanes 作圖的數(shù)據(jù) Si/ nI : S1/n1 S2/n2 S3/n3 S4/n4 S5/n5 S6/n6 Si : S1 S2 S3 S4 S5 S6用S/n 對(duì)S作圖可得到一條線段，線段與軸的截距是Km/Vmax，線段延