第十四章基因工程與蛋白質(zhì)工程

1、生物化學（第三版）生物化學（第三版）主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清參編參編 劉文彬劉文彬 李永紅李永紅 姚舜姚舜生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清重組DNA技術(shù)，又稱為基因克隆或分子克隆技術(shù)， 克隆(clone)-無性繁殖 分子克隆 DNA的無性繁殖技術(shù) 重組DNA技術(shù)包括了一系列的分子生物學操作步驟。 重組DNA技術(shù)的重大突破帶動了現(xiàn)代生物技術(shù)的興起，并很快產(chǎn)生了許多生命科學的高技術(shù)產(chǎn)業(yè)。一、重組DNA技術(shù)是基因工

2、程的核心技術(shù)生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清基因工程(genetic engineering)所謂基因工程(genetic engineering)就是把外源基因通過體外重組后導入受體細胞內(nèi)，使這個基因能在受體細胞內(nèi)復制，轉(zhuǎn)錄，翻譯表達的操作叫基因工程?；蚬こ炭墒沽硪环N生物獲得新的遺傳性狀或表達所需要的產(chǎn)物。生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清 重組DNA操作一般步驟：（1）獲得目的基因；（2）與克隆載體連接，形成新的重組DNA分子；（3）用重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細胞，并能在受體細胞中復制和遺傳；（4）對轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定；（5）對獲得外源基因的細胞或生物體

3、通過培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達出所需要的產(chǎn)物。生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清獲得需要的目的基因常用的方法：（1）直接從生物體中提取總DNA，構(gòu)建基因組DNA文庫(genomic DNA library)，從中調(diào)用目的基因；（2）以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成互補的DNA片段，建立cDNA文庫；（3）利用聚合酶鏈式反應（PCR）特異性地擴增所需要的目的基因片段，等等。 （4）化學合成二、獲得需要的目的基因（外源基因）生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清n 細胞內(nèi)總DNA的提取分離與基因組文庫的構(gòu)建l 細胞內(nèi)總DNA的提取分離程序苯酚沉淀蛋白質(zhì)生物化學生物化

4、學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清l 紫外分光光度計測定DNA溶液的純度和濃度。生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清l 基因組DNA文庫的構(gòu)建將總DNA經(jīng)過酶解，經(jīng)蔗糖梯度離心或瓊脂糖凝膠電泳分離不同長短的DNA片段。包含的基因組片段分別克隆在質(zhì)?；蚴删w載體上，轉(zhuǎn)染細菌或體外包裝到噬菌體顆粒上便構(gòu)成了該生物的基因組文庫。生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清cDNAcDNA文庫的構(gòu)建文庫的構(gòu)建mRNA 反轉(zhuǎn)錄cDNA(互補DNA）第二條DNA鏈生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清n 反轉(zhuǎn)錄人工合成互補DNA, cDNA 構(gòu)建基因文庫獲取目的基

5、因存在的問題費時費事內(nèi)含子序列 反轉(zhuǎn)錄人工合成互補DNA方法的優(yōu)勢獲取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清n 聚合酶鏈式反應（PCR）l PCR技術(shù)就是在體外中通過酶促反應有選擇地大量擴增（包括分離）一段目的基因的技術(shù)。l 加入4種物質(zhì)： （1）作為模板的DNA序列；（2）與被分離的目的基因兩條鏈 各自5端序列相互補的DNA引物（20個左右堿基的短DNA單鏈）；（3）TaqDNA聚合酶；（4）dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP）。生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清n 聚合酶鏈式反應（PCR）l變性、退火

6、、延伸三步曲變性：雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結(jié)合延伸：以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清n 聚合酶鏈式反應（PCR）l每一輪聚合酶鏈式反應可使目的基因片段增加一倍30輪循環(huán)可獲得 230（1.07109)個基因片段生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清l PCR技術(shù)的發(fā)明 PCR的發(fā)明是DNA操作技術(shù)的革命 美國Mullis教授 開汽車時的聯(lián)想 逶迤崎嶇的山路DNA雙螺旋 行駛的汽車一小段DNA引物 1988年發(fā)明了P

7、CR技術(shù) 1993年獲得諾貝爾獎生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清 基因重組和克隆操作最重要的工具是： 1.限制性內(nèi)切酶 2.載體 和 3.宿主菌 微量的目的基因必須經(jīng)過基因克隆獲得大量的拷貝后，才能實現(xiàn)進一步的重組、轉(zhuǎn)化和表達等操作。三、構(gòu)建重組質(zhì)粒DNA和基因克隆n 限制性內(nèi)切酶 限制性內(nèi)切酶是從細菌中分離提純的核酸內(nèi)切酶，可以識別并切開核酸序列特定位點分子手術(shù)刀 Arber、Smith和Nathans因為在發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶方面開創(chuàng)性工作而共同獲得了1978年的諾貝爾獎。生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海

8、清識別特定的核苷酸序列46個堿基對形成粘性末端或平端生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清n 限制性內(nèi)切酶 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和鑒定了200多種EcoRI特異識別GAATTC及其互補堿基組成的雙鏈片段 粘性末端 T4連接酶生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清 The formation of a recombinant DNA molecule生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清載體載體載體是運送目的基因片段進入宿主細胞的工具，（1）能夠自我復制，并帶動插入的外源基因一起復制（2）具有合適的限制性酶切位點（

9、3）具有合適的篩選標記（4）細胞內(nèi)拷貝數(shù)要多（5）載體的分子量要小 （6）細胞內(nèi)穩(wěn)定性高目前最常用的載體包括細菌質(zhì)粒、l噬菌體、cosmid質(zhì)粒等。生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清 質(zhì)粒是細菌細胞中自然存在于染色體外可以自主復制的一段環(huán)狀DNA分子。進入到宿主細胞中的一個質(zhì)?？梢源罅吭黾悠淇截悢?shù)。質(zhì)粒生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清 基因克隆獲得大量目的基因后，就要使其在合適的宿主細胞中表達，產(chǎn)生需要的基因表達產(chǎn)物或使宿主生物具備所需的性狀，同時目的基

10、因還能在宿主細胞中穩(wěn)定遺傳。這一過程就是遺傳轉(zhuǎn)化。 若需要讓克隆的基因表達和產(chǎn)生大量編碼蛋白，可對轉(zhuǎn)化的大腸桿菌進行培養(yǎng)使目的基因大量表達和積累。對表達產(chǎn)物分離純化便可獲得想要的產(chǎn)品。 通過DNA體外重組技術(shù)構(gòu)建的重組質(zhì)粒還可以直接用以轉(zhuǎn)化藍藻等原核生物或其他一些原生生物。四、轉(zhuǎn)化受體細胞和轉(zhuǎn)化子的篩選生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清宿主菌或受體細胞 感受態(tài)細胞（competent cell）生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清 受體細胞和重組基因的導入（轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染） 將目的基因克隆到大腸桿菌細胞中的操作步驟：1獲得目的基因和質(zhì)粒載體；2形成重組質(zhì)粒；3制備

11、感受態(tài)細胞，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞；4培養(yǎng)大腸桿菌，讓重組質(zhì)粒及外源目的基因形成大量拷貝；5篩選含重組質(zhì)粒的大腸桿菌細胞，進行檢查或鑒定。生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清 pUC118質(zhì)粒的多克隆位點整合在lacZ基因中，該位點如果沒有插入外源目的基因，lacZ基因便可表達出半乳糖苷酶，如果平板培養(yǎng)基中含有IPTGIPTG（乳糖操縱子的誘導物）和X-galX-gal，X-galX-gal（ 半乳糖苷酶的底物）便會被半乳糖苷酶水解成蘭色，大腸桿菌形成藍色克隆。 在多克隆位點插入外源目的基因，破壞了lacZ基因的結(jié)構(gòu)，大腸桿菌形成白色的克隆 利用lacZ基因的插入失活篩選重

12、組質(zhì)粒生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清 pUC18載體還攜帶了抗生素（antibiotic）基因，可篩選重組質(zhì)粒。生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清n 一般克隆基因的檢查和鑒定方法 瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定大小不等的酶解片段：磷酸基團帶負電荷酶解片段向陽極移動電場驅(qū)動力和凝膠阻力 不同遷移率分子量標準參照物l 酶切和電泳方法生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清Restriction mapping酶切克隆基因的檢查和鑒定方法生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清32P標記的DN

13、A分子探針 雜交 放射自顯影法l DNA雜交直接鑒定生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清l 植物遺傳轉(zhuǎn)化常用的方法 載體法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌介導法（Ti質(zhì)粒） 基因的直接轉(zhuǎn)移（1）高壓電脈沖電激穿孔（2）基因槍法（3）微注射法生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清 構(gòu)建缺失chlL基因的藍細菌突變株（直接轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒）生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清 紀念發(fā)明者Edward Southern（1）提取總DNA（2）酶解（3）電泳（4）轉(zhuǎn)移到濾膜（5）變性解鏈（6）DNA探針及雜交（7）洗脫（8）放射自顯影（9）比較分析五、轉(zhuǎn)化子的分析Southern雜

14、交生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清 Southern雜交分析示例 A. DNA體外重組實驗 B. 抗生素篩選轉(zhuǎn)化子細胞 C. 培養(yǎng)突變株細胞 D. Southern雜交實驗結(jié)果顯示，外源目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入突變株細胞中 1973年，由美國斯坦福大學教授Cohn和美國加州大學教授Boyer帶領(lǐng)各自的研究組幾乎同時分別完成了DNA體外重組，一舉打開了基因工程學大門。生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物

15、化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清氨基酸的聚合形成肽鏈氨基酸的聚合形成肽鏈生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元: : 二硫鍵的折疊二硫鍵的折疊生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元 : :氫鍵的折疊氫鍵的折疊生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元 : :離子鍵的折疊離子鍵的折疊生物化學

16、生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清肽鏈的空間結(jié)構(gòu)肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元單元l每四個氨基每四個氨基酸殘基間的酸殘基間的l氫鍵構(gòu)成多氫鍵構(gòu)成多肽鏈肽鏈 a a 螺旋螺旋生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清肽鏈的空間結(jié)構(gòu)肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元單元l由不同多肽鏈由不同多肽鏈上氨基酸殘基上氨基酸殘基間的氫鍵構(gòu)成間的氫鍵構(gòu)成多肽鏈多肽鏈 b b 折折疊疊生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清肽鏈的完整空間構(gòu)象肽鏈的完整空間構(gòu)象生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清

17、萬海清蛋白質(zhì)的加工修飾蛋白質(zhì)的加工修飾 : :磷酸化修飾磷酸化修飾生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清蛋白質(zhì)的加工修飾蛋白質(zhì)的加工修飾: :羧基化修飾羧基化修飾幾種參與凝血的蛋幾種參與凝血的蛋白因子（如白因子（如 VIII VIII 和和IVIV因子）需要在因子）需要在其其谷酰胺側(cè)鏈上的谷酰胺側(cè)鏈上的g-g-羧基化修飾羧基化修飾后，后，才能擁有蛋白酶的才能擁有蛋白酶的活性，這一修飾過活性，這一修飾過程依賴與程依賴與維生素維生素K K 的存在的存在。生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清蛋白質(zhì)的加工修飾蛋白質(zhì)的加工修飾: :甲基化修飾甲基化修飾肌肉中的一些蛋白質(zhì)以肌

18、肉中的一些蛋白質(zhì)以及細胞色素及細胞色素C C中的中的LysLys會會受到單甲基和二甲基化受到單甲基和二甲基化修飾；鈣調(diào)蛋白會受到修飾；鈣調(diào)蛋白會受到三甲基化修飾；所有三甲基化修飾；所有C C末末端以端以GluGlu結(jié)尾的蛋白質(zhì)，結(jié)尾的蛋白質(zhì)，其其GluGlu會受到甲基化修飾。會受到甲基化修飾。生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清蛋白質(zhì)的加工蛋白質(zhì)的加工修飾修飾: :N-N-糖基化糖基化O-O-糖基化糖基化糖基化修飾糖基化修飾生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清蛋白質(zhì)的加工修飾蛋白質(zhì)的加工修飾: :其它類型的修飾其它類型的修飾生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵

19、 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清遺傳信息傳遞的中心遺傳信息傳遞的中心法則法則DNADNA（基因）（基因）DNADNA（基因）（基因）mRNAmRNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)生物代謝物質(zhì)生物代謝物質(zhì)復制復制轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄翻譯翻譯代謝代謝基因組學基因組學轉(zhuǎn)錄組學轉(zhuǎn)錄組學蛋白組學蛋白組學代謝組學代謝組學逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄中心法則中心法則生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海

20、清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清 2. PCR2. PCR介導的定點突介導的定點突變變 生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清1. 1. 胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成S SS SS SS SC CN NS SS SB B 肽（肽（3030）C C 肽（肽（3131）A