細(xì)胞培養(yǎng)步驟

1、花鱸肌肉和肝臟組織細(xì)胞原代培養(yǎng)1.細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備工作準(zhǔn)備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、 干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝 及滅菌，無(wú)菌室或超凈臺(tái)的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試。具體工作 如下：一、清洗(1) 常用器具：細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、廣口瓶、燒杯、量筒、玻 璃棒、電子天平、紗布、脫脂棉、止血鉗、鑷子、解剖剪、解剖刀、解剖 針、注射器、注射器過(guò)濾器、移液槍、槍頭、離心管、細(xì)胞凍存管、酒精 燈、試管架、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、生化培養(yǎng)箱、烘箱、液氮罐、封 口膜、噴壺、以及洗刷用品等。(2) 玻璃器皿清洗：燒杯、量筒、玻璃棒、廣口瓶(瓶蓋不泡鹽酸，清洗趕緊 后直接咼壓火

2、菌)等玻璃器皿自來(lái)水刷洗，除去灰塵，烤箱中烘干，然后 再浸入5%稀鹽酸中12小時(shí)以除去臟物、鉛、砷等物。泡鹽酸 12小時(shí)后 立即用自來(lái)水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來(lái)水沖干凈，然后用蒸餾水沖洗 干凈后用烤箱烘干，高壓滅菌，烘干備用。(3) 塑料器皿的清洗：細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶可以直接使用，進(jìn)口槍頭、 進(jìn)口離心管高壓滅菌。(4) 金屬制品的清洗：止血鉗、鑷子、解剖剪、解剖刀等先用洗滌劑刷洗，后 用自來(lái)水沖干凈，然后用 75%酒精擦拭，再用自來(lái)水，然后用蒸餾水沖 洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內(nèi)包裝好，高壓滅菌，再烘干備用。(5) 棉織品：紗布和脫脂棉，高壓滅菌，再烘干備用。二、溶液配制(1

3、) PBS:配方一|-用電子天平準(zhǔn)確稱取 NaCI / g，KCl / g，KH2P04/ g，Na2HP04-12HD/ g溶于800 mL的超純水中，用玻璃棒攪拌至溶解后調(diào)節(jié) pH值為，然后定容至1L。置于高壓滅菌鍋中滅菌30min,冷卻到室溫后分裝，于4C冰箱冷藏備用 配方二卜-等滲(1X PBS細(xì)胞培養(yǎng)用，用電子天平準(zhǔn)確稱取 NaCI/濃度為8/=，本配方主要靠 NaCI, KCJ/濃度為=，NqHPQ 12H0/濃度為358=, NaHPO 2H0/濃度為 358=，KH£OL濃度為 136=，溶于 800 mL的 dddH20 用玻璃棒攪拌至溶解，dddH20定容至100

4、0ml。置于高壓滅菌鍋中滅菌 30mi n，冷卻到室溫后分裝，于 4°C冰箱冷藏備用。配方三 -用電子天平準(zhǔn)確稱取 NaCI / g，KCI / g，KHP04/，NaHPO7H0/ g，MgCL 6fO/，CaCL/溶于800 mL的超純水中，用玻璃棒攪拌至 溶解后調(diào)節(jié)pH值為，然后定容至1L。置于高壓滅菌鍋中滅菌 30min, 冷卻到室溫后分裝，于4C冰箱冷藏備用。(2) %胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶粉末(1:250)，用PBS在容量瓶中定容至100ml， 微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝，于20 C保存。(3) %胰蛋白酶 EDTA消化液：準(zhǔn)確稱取的Trypsin和的EDTA用PBS在容 量

5、瓶中定容至100ml，調(diào)節(jié)pH值為，用孔徑為ym的濾膜過(guò)濾除菌，用 2mL的離心管分裝，凍存于-20 C冰箱備用。(4) 培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基MEM這是使用最為廣泛的培養(yǎng)基；完全培養(yǎng)基配置 方法為：1L MENS礎(chǔ)培養(yǎng)基添加HEPES充分溶解后，用NaOP將PH調(diào)到， 加 2ng/ml bFGF，20%、牛血清，1mmoI/L 的 L-谷氨酸，50mmoI/L 的 2-巰 基乙醇，100IU/mI青霉素和100ug/ml鏈霉素。(5) HEPES溶液：配置100X貯存液(1moI/L )，在99ml培養(yǎng)液中加入1ml貯存液，使最終濃度任為10mmol/L。100X貯存液(1moI/L )配置方法

6、：取 溶于90ml雙蒸水中，用1moI/L NaOH調(diào)卩日至，然后用水定容至100ml， 過(guò)濾除菌，分裝2ml小瓶，4C或-20 C保存。三、培養(yǎng)室的滅菌(1) 室內(nèi)滅菌：每周打掃一次，先用自來(lái)水拖地、擦桌子、超凈工作臺(tái)等，然后用新潔爾滅擦拭。(2) 生化培養(yǎng)箱滅菌：先用3%。新潔爾滅擦拭，然后用70%酒精擦拭，再用 紫外燈照射。保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈，定期消毒。定期更換蒸餾水。(3) 實(shí)驗(yàn)前滅菌：打開(kāi)紫外燈20-30分鐘。(4) 實(shí)驗(yàn)后滅菌：用70%酒精(3%o新潔爾滅)擦拭超凈臺(tái)、邊臺(tái)、倒置顯微 鏡的載物臺(tái)，打開(kāi)紫外線照射 20-30min。四、實(shí)驗(yàn)人員的無(wú)菌準(zhǔn)備：(1) 肥皂洗手。(2)

7、穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、穿好鞋套。(3) 戴乳膠手套，75%酒精擦手。五、無(wú)菌操作(1) 凡是帶入超凈工作臺(tái)內(nèi)的酒精、PBS培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用70% 酒精擦拭瓶子的外表面。(2) 靠近酒精燈火焰操作。(3) 打開(kāi)和蓋上蓋子前后灼燒瓶頸和蓋口附近。(4) 無(wú)菌級(jí)；別高的物品不能觸碰無(wú)菌級(jí)別低的物品。手不能從敞開(kāi)的瓶口 上方經(jīng)過(guò)。(5) 各種操作要靠近酒精燈，動(dòng)作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到 廢液缸。(6) 吸取兩種以上的使用液時(shí)要注意更換吸管，防止交叉污染。(7) 手握試管、滴管、移液管時(shí)盡量遠(yuǎn)離工作端。(8) 盡可能移走不需要的物品，在操作中經(jīng)常用酒精擦拭臺(tái)面。(9)

8、盡可能減少開(kāi)蓋時(shí)間。(10) 隨時(shí)擦去任何溢出物。六、原代細(xì)胞培養(yǎng)方法一：組織塊培養(yǎng)法(主要用于肌肉組織的培養(yǎng))(1) 選取身體健康，無(wú)病的幼魚(yú)，用解剖針進(jìn)行頭顱穿刺法殺魚(yú)，70%酒精消 毒體表，然后放在無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，待用。(2) 解剖魚(yú)體，拿入無(wú)菌操作臺(tái)中，用無(wú)塵紙墊在魚(yú)體下，用直頭解剖剪剔 除皮膚，取體表肌肉組織，然后剝?nèi)?nèi)臟膜取肝臟組織并刮去多余的外膜，放入培養(yǎng)皿，用PBS青洗三遍，放入70%酉精中消毒34mim再用 PBS青洗3遍，除去血塊，用加入雙抗的無(wú)血清培養(yǎng)基清洗一遍。(3) 切割組織塊，用解剖刀在培養(yǎng)皿上切割組織，切割過(guò)程中，加入適量的 培養(yǎng)液保持組織濕潤(rùn)。(4) 懸浮移瓶，

9、切割完成后用新鮮的培養(yǎng)基懸浮小組織塊，用移液槍移入培 養(yǎng)瓶中，吸棄上清液，保留少量培養(yǎng)液，蓋上瓶蓋，輕輕晃動(dòng)瓶子，使 組織塊在瓶底均勻鋪展開(kāi)，用玻璃棒調(diào)整組織塊使其均勻分布，組織塊 間隔為宜，25亦培養(yǎng)瓶中加入2030個(gè)組織塊。(5) 細(xì)胞貼壁，將培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)箱中平放 2小時(shí)，使組織貼壁，然后側(cè)放半 個(gè)小時(shí)，使液體浸出，然后吸出液體。(6) 細(xì)胞培養(yǎng)，從培養(yǎng)瓶邊角加入3ml培養(yǎng)基，蓋上瓶蓋，滿滿放入培養(yǎng)箱 中平放培養(yǎng)。如有懸浮，需重新貼壁。(7) 初始培養(yǎng)5天后換一次培養(yǎng)基，后期每隔 2-4天換一次培養(yǎng)基。換培養(yǎng) 基的時(shí)候，吸走一半舊的培 養(yǎng)基, 再加入一半新的培 養(yǎng)基。(8) 觀察、記錄細(xì)胞

10、遷出情況，適時(shí)拍照。13天內(nèi)遷出較少，盡量不要觀察。 方法二：酶消化解離法(除肌肉和結(jié)締組織之外)(1) 選取身體健康，無(wú)病的幼魚(yú)，用解剖針進(jìn)行頭顱穿刺法殺魚(yú)，70%酒精消 毒體表，然后放在無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，待用。(2) 解剖魚(yú)體，拿入無(wú)菌操作臺(tái)中，用無(wú)塵紙墊在魚(yú)體下，用解剖剪打開(kāi)腹腔(注意不能碰破腸道)，剝?nèi)?nèi)臟膜取肝臟組織并刮去多余的外 膜，放入培養(yǎng)皿，用PBS清洗三遍，放入70%酒精中消毒34mim再用 PBS清洗3遍，除去血塊，使肝臟呈灰白色，用加入雙抗的無(wú)血清培養(yǎng)基 清洗一遍。(3) 胰酶消化，將組織切割成 1mm大小，用胰蛋白酶 EDTA消化液消化 20min后添加3ml完全培養(yǎng)基終止消化，收集含有組織塊的細(xì)胞懸液，以2200rpm離心2min；將所得沉淀用1ml完全培養(yǎng)基懸浮后接種