基于HEV中和表位的基因免疫誘導(dǎo)特異性抗體及中和作用研究

1、基于HEV中和表位的基因免疫誘導(dǎo)特異性抗體及中和作用研究         11-03-25 11:29:00     編輯：studa20                   作者：王春玲,楊書(shū)才,孟繼鴻,王立新【摘要】  目的：觀察基于戊型肝炎病毒中和表位(p179)的基因免疫是否能在小

2、鼠體內(nèi)誘導(dǎo)具有中和作用的抗體應(yīng)答。方法：構(gòu)建含HEV中和表位p179編碼基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX179,以肌肉注射法對(duì)BALB/c小鼠實(shí)施基因免疫，實(shí)驗(yàn)組每只小鼠給pVAX179 100 g,并設(shè)立空質(zhì)粒pVAX和HEVp179蛋白兩個(gè)對(duì)照組。定期采集小鼠血清,ELISA法檢測(cè)其特異性抗HEVIgG抗體及其親合力；以基于PCR的體外中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體的中和活性。結(jié)果：pVAX179質(zhì)?；蛎庖哒T導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了特異性抗HEVIgG抗體,抗體水平于第10周達(dá)高峰,OD值為0.55±0.13,與空質(zhì)粒pVAX組(0.15±0.07)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。第6周實(shí)

3、驗(yàn)組抗體親合力(ED50為2.5 mol·L-1)高于蛋白對(duì)照組（ED50為2.0 mol·L-1),基因免疫促進(jìn)了抗體親合力的成熟；體外中和實(shí)驗(yàn)證實(shí)產(chǎn)生的特異性抗體能夠阻止HEV感染人肝癌細(xì)胞7721,具有中和HEV的活性。結(jié)論：基于戊型肝炎病毒中和表位(p179)的基因疫苗pVAX179能夠在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生具有中和作用的抗體應(yīng)答。 【關(guān)鍵詞】  戊型肝炎病毒； 中和表位； 基因疫苗； 抗體應(yīng)答； 中和作用Abstract Objective：To investigate whether the DNA vaccine based on HEV neutral

4、ization epitope(s) HEVp179 could induce neutralizing antibody response in mice.Methods：The neutralization epitope(s) HEVp179coding gene was subcloned into a eukaryotic expression vector pVAX to construct recombinant plasmid pVAX179. BALB/c mice were immunized i.m. with 100 g DNA of pVAXp179 plasmid,

5、 mock DNA,and 1 g protein of HEVp179,respectively.Sera collected at the indicated times from two groups were determined the levels and avidity of specific antiHEV IgG antibody by ELISA.The neutralizing activity of induced antiHEV antibody was detected in a PCRbased cell culture neutralization assay.

6、Results:Immunizations with pVAX179 successfully induced antiHEV specific antibody response and accelerated the avidity maturation of antibodies.The antiHEV level reached the hightest values about 10 weeks after first vaccination.The avidity of antibodies from pVAX179 immunized mice was higher than t

7、hat from HEVp179 protein immunized group.In addition,the postimmune sera obtained from pVAXp179 vaccinated mice were found the protective neutralizing activity against HEV infection.Conclusion：These results indicate that the DNA vaccine based on HEV neutralization epitope(s)HEVp179 could induce neut

8、ralizing antibody response against HEV in miceKey word hepatitis E virus；  neutralization epitope； DNA vaccine； antibody response； neutralizing activity     戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)是無(wú)包膜的單正鏈RNA病毒,主要通過(guò)胃腸道傳播,是引發(fā)急性戊型肝炎(hepatitis E,HE)的病原體。目前HE尚無(wú)特效的抗病毒治療藥物,因此,HEV疫苗的研制受到人們的重視。HEV疫

9、苗的關(guān)鍵是能否誘導(dǎo)具有保護(hù)作用的中和抗體1-2,而中和抗體的誘導(dǎo)必須基于中和抗原表位。    在以往的研究中我們發(fā)現(xiàn),來(lái)源于HEVORF2編碼衣殼蛋白C端(第439617位氨基酸)的p179多肽是能在真核細(xì)胞有效表達(dá)的、含有中和抗原表位的最短多肽4,這為研制基于中和表位的HEV基因疫苗奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。    在本研究中,我們以pVAX為真核表達(dá)載體、HEVORF2439617(p179)為靶基因構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX179,以肌肉注射法對(duì)Balb/c小鼠實(shí)施基因免疫,觀察該基因疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的HEV特異性抗體及其中和作用。 

10、;   1  材料與方法    1.1  質(zhì)粒和主要試劑    真核表達(dá)載體pVAX由復(fù)旦大學(xué)熊思東教授惠贈(zèng),PCR產(chǎn)物純化試劑盒Plasmid Mega Kit購(gòu)自QIAGEN公司,純化HEVp1663、HEVp179蛋白由本室自制,HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自Sigma公司,0.75%布比卡因和戊巴比妥鈉購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司,硫氰酸鈉購(gòu)自Sigma公司,大腸桿菌DH5為本室保存。    1.2  重組質(zhì)粒pVAX179的構(gòu)建、鑒定及大量純化&#

11、160;   以PCR法獲得HEVp179編碼基因,經(jīng)Nhe和BamH雙酶切后與酶切空載體pVAX進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5,挑取轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行PCR篩選,陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序。大量純化質(zhì)粒DNA,微量紫外分光光度儀檢測(cè)DNA濃度,并用生理鹽水將濃度調(diào)整至1 g·l-1。    1.3  重組質(zhì)粒pVAX179的體外表達(dá)    在Nerk細(xì)胞小室內(nèi)接種HepG2人肝癌細(xì)胞,24 h后待其長(zhǎng)到80%底面積時(shí),采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000方法4轉(zhuǎn)染真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX、pV

12、AX179,濃度為1 g·l-1。培養(yǎng)48 h后采用間接免疫熒光法檢測(cè)目的抗原在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),方法如下：0.01 mol·L-1PBS(pH 7.4)洗細(xì)胞3次,4%多聚甲醛室溫固定10 min后室溫吹干；0.01 mol·L-1 PBS(pH 7.4)洗細(xì)胞3次,以含5BSA的TBST 37 封閉40 min；用5BSA的TBST稀釋抗HEV單克隆抗體(1 1 000),37 作用60 min；0.01 mol·L-1 PBS(pH 7.4)洗細(xì)胞3次,5BSA TBST稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體37 作用60 min；0.01 mol

13、83;L-1 PBS(pH 7.4)洗細(xì)胞3次,50%甘油的PBS封片,熒光顯微鏡下觀察。    1.4  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和基因免疫    68周齡、1618 g體重的雌性BALB/c小鼠(H2d),購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。以免疫pVAX179重組質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)組、空質(zhì)粒pVAX和HEVp179蛋白為對(duì)照組,每組均為6只,肌肉注射法實(shí)施基因免疫,免疫劑量均為每只小鼠100 g DNA(蛋白對(duì)照組每只小鼠1 g HEVp179蛋白),于第2、4周各加強(qiáng)免疫1次,共免疫3次。定期采集小鼠血清,-20 保存待檢。  

14、  1.5  免疫小鼠血清特異性抗HEVIgG抗體及其親合力的檢測(cè)   采用常規(guī)ELISA法,以純化HEVp166蛋白(1 g·ml-1)包被96孔酶標(biāo)反應(yīng)板(100 l·孔-1),以HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG作為第二抗體,酶標(biāo)儀測(cè)得各孔A490 nm值表示抗體水平。采用硫氰酸鈉（NaSCN）競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定特異性抗體的親合力,結(jié)果以ED50值表示。以HEVp166蛋白1 g·ml-1(100 l·孔-1)包被96孔酶標(biāo)反應(yīng)板,置濕盒中,37 放置1 h后4 過(guò)夜,用0.05%PBST洗滌3次,每次

15、30 s,以含5%山羊血清和5%小牛血清白蛋白的PBST 37 封閉1 h,洗滌3次；小鼠血清作110稀釋后加入各孔,37 溫育1 h；用0.05%PBST洗滌3次,然后于同一血清標(biāo)本的各孔中加入100 l不同濃度的NaSCN(0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 mol·L-1,用PBS稀釋),室溫靜置25 min,然后用PBST洗滌3次；加含30小牛血清PBST稀釋的HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體,37 1 h,PBST洗滌6次；OPD顯色,2 mol·L-1 H2SO4終止反應(yīng),酶標(biāo)儀檢測(cè)A490 nm值。    1.6

16、60; 免疫小鼠血清特異性抗HEVIgG抗體體外中和作用的檢測(cè)   以RTPCR法確定HEV體外感染人肝癌細(xì)胞的最低感染滴度后,取100倍的HEV最低感染滴度的病毒稀釋液作為中和實(shí)驗(yàn)中的病毒使用量,然后將免疫后第8周采集的pVAX179實(shí)驗(yàn)組、pVAX空質(zhì)粒對(duì)照組(每組6只小鼠)的血清分別進(jìn)行等量混合,取上述兩組混合血清100 l分別與含100倍的HEV最低感染滴度的病毒糞便濾液100 l混合(按1 1的稀釋度),于37 孵育1 h。接種單層7721細(xì)胞,于37 繼續(xù)孵育2 h,洗滌3次,按常規(guī)方法抽提核酸,采用RTnPCR檢測(cè)HEV RNA。同時(shí),以10-1病毒

17、感染的7721細(xì)胞和10倍稀釋的免疫前的小鼠血清作為陰性對(duì)照,以未感染HEV病毒的7721細(xì)胞和具有中和作用的抗HEVIgG單克隆抗體5G5作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果判定：以PCR檢測(cè)呈陰性者為中和抗體陽(yáng)性。    1.7  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件處理,結(jié)果采用t檢驗(yàn),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2  結(jié)果    2.1  重組質(zhì)粒pVAX179的鑒定    菌落PCR篩選結(jié)果顯示：PCR呈陽(yáng)性克隆菌1號(hào)菌落,其擴(kuò)增產(chǎn)物的大小與理論

18、值(549 bp)吻合(圖1A)。小量抽提1號(hào)克隆的質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測(cè)定,結(jié)果表明：HEV179編碼基因的序列正確,讀碼框架準(zhǔn)確(圖1B)。    2.2  重組質(zhì)粒pVAX179體外表達(dá)的檢測(cè)    轉(zhuǎn)染pVAX179質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞在熒光激發(fā)下呈現(xiàn)強(qiáng)烈的黃綠熒光,而轉(zhuǎn)染pVAX空質(zhì)粒的HepG2A.菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化克隆1.1號(hào)克??；2.2號(hào)克隆;3.DNA Marker(100 bp)；B.1號(hào)克隆的DNA序列測(cè)定細(xì)胞未見(jiàn)熒光（圖2，見(jiàn)封三）。提示pVAX179重組質(zhì)粒能夠在真核細(xì)胞有效表達(dá)目的蛋白p179。&#

19、160;   2.3  pVAX179基因免疫誘導(dǎo)HEV特異性抗體應(yīng)答及其親合力的檢測(cè)   由圖3A可見(jiàn)：pVAX179重組質(zhì)粒3次免疫后誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了特異性抗HEVIgG抗體,并于第10周抗體水平達(dá)高峰,與空質(zhì)粒pVAX免疫組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A490nm值：pVAX179組=0.55±0.13，pVAX組=0.15±0.07,P0.001)。提示基于中和表位p179的基因免疫能成功誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的抗體應(yīng)答。    隨后,采取100倍的HEV最低感染滴度的病毒稀釋度，即10-

20、1稀釋度病毒作為中和試驗(yàn)中的病毒使用量,進(jìn)行基于PCR的體外中和試驗(yàn),檢測(cè)pVAX179基因免疫誘導(dǎo)抗體的中和活性。如圖4B顯示：pVAX179基因免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體能夠在體外中和HEV病毒,阻止病毒感染7721細(xì)胞。提示基于中和抗原表位p179的基因疫苗所誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性IgG抗體具有保護(hù)性中和作用。     11-03-25 11:29:00     編輯：studa203  討論    HEV基因疫苗大多以O(shè)RF2或ORF3全基因序列為基礎(chǔ),能誘導(dǎo)產(chǎn)生一定水平的具

21、有保護(hù)作用的IgG抗體6。近幾年來(lái),隨著對(duì)抗原蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)的深入研究,人們逐漸認(rèn)識(shí)到全蛋白基因中含有多種抗原表位(包括中和表位和非中和表位)及其他調(diào)控序列、免疫抑制序列,而其他無(wú)關(guān)成分的存在會(huì)影響目的抗原表位的免疫優(yōu)勢(shì)地位,因此,基因免疫由最初的基于抗原全基因表達(dá)載體階段,發(fā)展到了基于抗原表位的表達(dá)載體階段。HEVORF2和ORF3存在多個(gè)抗原表位以及中和性抗原表位6-8。本室先前證實(shí)的p179是能在真核細(xì)胞有效表達(dá)的、最短的、含中和抗原表位的多肽(位于ORF2編碼蛋白第439617位氨基酸),這為研制基于中和表位的HEV基因疫苗奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。   

22、 pVAX質(zhì)粒是美國(guó)FDA首次批準(zhǔn)能用于人體實(shí)驗(yàn)的真核表達(dá)載體,以該質(zhì)粒作為本項(xiàng)目的載體為日后的實(shí)際應(yīng)用提供便利,一旦實(shí)驗(yàn)成功可直接進(jìn)入人體實(shí)驗(yàn),不必更換表達(dá)系統(tǒng)。在本研究中,我們將HEVORF2439617(p179)編碼基因克隆入pVAX質(zhì)粒以構(gòu)建p179真核表達(dá)載體,經(jīng)過(guò)PCR、DNA序列分析等確證，我們成功構(gòu)建了pVAX179重組質(zhì)粒。隨后以間接免疫熒光法檢測(cè)證實(shí)，pVAX179能夠在體外真核細(xì)胞中有效表達(dá)目的蛋白p179。以肌肉注射法對(duì)Balb/c小鼠實(shí)施基因免疫,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基于HEV中和表位p179的基因免疫能成功地在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗HEV特異性的體液免疫應(yīng)答,產(chǎn)生了HEV特異性

23、IgG抗體。    抗體的親和力與其中和、清除病毒的活性密切相關(guān),也是評(píng)價(jià)基因免疫效果的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中,我們采用NaSCN競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)并比較了pVAX179基因免疫和重組蛋白p179免疫誘導(dǎo)抗體的親合力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因疫苗pVAX179誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體親合力較蛋白免疫組強(qiáng),顯示了基因疫苗pVAX179誘導(dǎo)的抗體親和力成熟。Boyle等9也在以模式抗原為靶抗原的基因免疫研究中發(fā)現(xiàn)，以DNA免疫的方式誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的特異性抗體親和力較蛋白免疫組強(qiáng)。其主要原因可能是基因免疫小鼠在免疫局部能持續(xù)地表達(dá)低水平靶抗原,形成的抗原抗體復(fù)合物被輸送到淋巴濾泡,并定

24、位于FDC表面,表達(dá)高親和力BCR的B細(xì)胞與抗原抗體復(fù)合物中的抗原結(jié)合,并在抗原特異性的Th細(xì)胞輔助下增殖,產(chǎn)生高親和力的抗體。    HEV基因疫苗的核心問(wèn)題是基因免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體是否對(duì)病毒感染具有中和作用。但是由于靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型價(jià)格昂貴、使用不便,HEV體外感染細(xì)胞尚未成功等原因,致使抗HEV中和抗體及其保護(hù)作用的檢測(cè)難以深入。本研究中,我們采用基于PCR的體外中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了pVAX179基因免疫誘導(dǎo)抗體的中和活性3,結(jié)果顯示，pVAX179基因免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體能夠在體外中和HEV病毒,阻止病毒感染人肝癌細(xì)胞7721,PCR檢測(cè)呈陰性。推測(cè)基于中和抗

25、原表位的基因疫苗pVAX179誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了具有保護(hù)性中和作用的抗體應(yīng)答。同時(shí),我們也注意到：與蛋白免疫相比較,pVAX179誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答水平仍然很低,在今后的研究中有必要進(jìn)一步分析pVAX179基因免疫誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的類型,使用各種有效的免疫增強(qiáng)策略,進(jìn)一步提高基因免疫誘導(dǎo)的特異性體液免疫應(yīng)答水平。    總之,在本研究中我們首次以含HEV中和抗原表位的最小多肽片段p179編碼基因的重組質(zhì)粒實(shí)施基因免疫,成功誘導(dǎo)了具有中和作用的HEV特異性抗體應(yīng)答，為下一步研究HEV基因免疫提供了新的思路和方向。 【參考文獻(xiàn)】  1L I R C,GE S X,LI

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