瓊脂糖凝膠電泳常見問題分析

1、瓊脂糖凝膠電泳常見問題分析問題可能原因解決方法DNA Marker 降解核酸酶污染每次吸取時更換火菌槍頭，勿將電泳緩沖液 帶入管中；用后密閉 4°C保存保存不當4°C或-20 °C保存，避免多次反復凍融；不 可加熱DNA Marker 無法正確分離瓊脂糖質量差使用質量可靠的瓊脂糖制膠電泳緩沖液多次使用后失效更換緩沖液條帶黯淡核酸濃度過低增加上樣量核酸降解使用不含核酸酶的試劑和耗材制備樣品DNA條帶被示蹤染料掩蓋提高上樣量；避免使用與目的片段遷移率相 同的示蹤染料條帶模糊或彌散電泳緩沖液多次使用后失效更換緩沖液核酸部分降解使用不含核酸酶的試劑和耗材制備樣品核酸樣品純

2、度差，含有DNA結合蛋白或高濃度的鹽份酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、鹽份等雜質電壓過低，電泳時間過長根據(jù)凝膠大小和電泳緩沖液類型，使用適當 的電壓進行電泳染色時間過長或拍照前放置過久，DNA條帶彌散電泳結束后及時觀察、拍照條帶缺失DNA條帶分子量過大使用脈沖凝膠電泳分子量接近的 DNA條帶沒有分開選擇適當?shù)哪z濃度進行電泳電泳緩沖液使用不當SD和TBE緩沖液適于分析較小分子量的DNA片段，大片段分子不能完全分離；TAE緩沖液不適于分離很小的DNA片段電泳時間過長或電壓過高，DNA走出凝膠縮短電泳時間，調整電壓電極插反，DNA走岀凝膠正確連接電極方向條帶大小不正確核酸降解或形成聚合物加熱處理或重

3、新制備樣品入DNA酶切Marker的cos位點復性電泳前65°C加熱5分鐘，冰上冷卻5分鐘以 后再上樣相同分子量的 DNA片段由于結構或判斷DNA分子是否有特殊結構，如缺口、超序列的差異而有不同的遷移率螺旋、二聚體等；富含 AT堿基的DNA遷移 率比同分子量富含 GC堿基的DNA片段慢梳子變形，點樣孔不在同一水平線上使用完好的梳子制膠帶型異常不同樣本的上樣條件不同選用相同的上樣緩沖液，上樣量盡可能接近上樣量過大或過小選擇合適大小的上樣孔，樣品應完全覆蓋點 樣孔底部核酸樣品純度差，含有DNA結合蛋白或高濃度的鹽份酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、鹽份等雜質電泳緩沖液未完全浸沒凝膠上樣和電泳

4、時，確保緩沖液始終能完全覆蓋 凝膠電壓過高或電泳時間過長致使凝膠過熱和DNA變性根據(jù)凝膠大小和電泳緩沖液類型，使用適當 的電壓進行電泳凝膠中加入 EB造成染色不均加入EB時充分混勻或電泳結束后再染色凝膠中有氣泡或污染物使用純水和潔凈容器制膠；緩慢灌膠，并趕 除氣泡點樣孔質量差待凝膠完全凝聚后再取出梳子小片段擴散，條帶模糊， 粗錯誤選擇了低濃度凝膠，觀察大片段 用低濃度凝膠,觀察小片段要用高濃 度比如觀察100bp的小片段用2%凝膠跑電泳瓊脂糖質量不好，質量不好的瓊脂糖 分離小片段容易擴散，即使是使用高 濃度凝膠換用質量好的瓊脂糖選擇了不合適的電泳緩沖液SD和TBE緩沖液適于分析較小分子量的DN

5、A片段，大片段分子不能完全分離；TAE緩沖液不適于分離很小的DNA片段DNA凝膠電泳簡介一、實驗原理DNA電泳是基因工程中最基本的技術， DNA制備及濃度測定、目的 DNA片段的分離，重 組子的酶切鑒定等均需要電泳完成。 根據(jù)分離的DNA大小及類型的不同，DNA電泳主要分兩 類：1 、聚丙烯酰胺凝膠電泳 適合分離1kb以下的片段，最高分辨率可達 1bp,也用于分離寡核苷酸，在引物的純化中也常用此中凝膠進行純化，也稱PAGE純化。2 、瓊脂糖凝膠電泳 可分離的DNA片段大小因膠濃度的不同而異，膠濃度為 0.5八 0.6%的凝膠可以分離的 DNA片段范圍為20bp50kb。電泳結果用溴化乙錠（EB

6、）染色后可直接在紫外下觀察，并且可觀察的DNA條帶濃度為納克級，而且整個過程一般1小時即可完成。由于該方法操作的簡便和快速，在基因工程中較常用。二、瓊脂糖凝膠瓊脂糖是從瓊脂中分離得到，由1, 3連接的吡喃型b-D-半乳糖和1, 4連接的3，6脫水吡喃型阿a-L-半乳糖組成，形成相對分子量為 104105的長鏈。瓊脂糖加熱溶解后分子 呈隨機線團狀分布，當溫度降低時鏈間糖分子上的羥基通過氫鍵作用相連接，形成孔徑結 構，而隨著瓊脂糖濃度不同形成不同大小的孔徑。表1給出了不同濃度凝膠對DNA片段的線性分離范圍。表1不同類型瓊脂糖分離 DNA片段大小的范圍瓊脂糖/ %標準高強度低熔點低粘度低熔點0.30

7、.5700bp25kb0.8500bp15kb800bp10kb800bp10kb1.0250bp12kb400bp8kb400bp8kb1.2150bp6kb300bp7kb300bp7kb1.580bp4kb200bp4kb200bp4kb2.0100bp3kb100bp3kb3.0500bp1kb500bp1kb4.0100bp500bp6.010bp100bp由于瓊脂糖凝膠是通過氫鍵的作用，因此過酸或過堿等破壞氫鍵形成的方法常用于凝 膠的再溶化，象 NaCIO能用于凝膠的裂解，一般的凝膠回收試劑盒利用的也是這一原理。隨著實驗技術的發(fā)展，也針對不同用途開發(fā)了各種類型的瓊脂糖凝膠：（1）低

8、熔點瓊脂糖凝膠，用于 DNA片段的回收，且由于該種凝膠中無抑制酶，可在膠中進行酶切、 連接等；（2）高熔點凝膠，可分離小于1kb的DNA片段，專用于PCR產(chǎn)物的分析；（3）快速凝膠，電泳速度比普通凝膠中快一倍，可節(jié)省實驗時間；（4）適用于DNA大片段的分離。（5）其它類型。各生產(chǎn)商還開發(fā)很多類型的凝膠，可根據(jù)實驗要求選擇不同類型的， 選擇原則是考慮合適的機械強度和熔點。三、DNA電泳影響因素DNA為堿性物質，在電泳（緩沖液pH=8）時帶負電荷，在一定的電場力作用下向正極泳動。而DNA鏈上的負電荷伴隨著 DNA分子量的增加而增加，荷質比是一常數(shù)，故電泳中 DNA的分離類似分子篩效應。電泳中影響D

9、NA分子泳動的因素很多，主要分兩方面：DNA分子特性和電泳條件。1 、DNA分子大小：DNA分子越大在膠中的摩擦阻力就越大，泳動也越慢，遷移速率與線狀DNA分子質量的對數(shù)值成反比。2 、DNA分子構型：對于質粒 DNA分子即使具有相同分子質量，因構型不同也會造成電泳時受到的阻力不同，最終造成泳動速率的不同。常規(guī)電泳中質粒DNA分子的3種構型泳動速率：超螺旋最快、線狀分子次之，開環(huán)分子最慢。3 、不同的膠濃度：對于同種DNA分子膠濃度越高，電泳速率越慢。不同膠濃度對于DNA片段呈線性關系有所區(qū)別，濃度較稀的膠線性范圍較寬，而濃的膠對小分子DNA片段呈現(xiàn)較好的線性關系。所以常規(guī)實驗中對于小片段DN

10、A分子的分離采用高濃度的膠分離（有時甚至用 2的凝膠），而對于分離大片段則用低濃度的凝膠。4、電場強度：電泳時為了盡快得到實驗結果，所用的電場強度約為5V/cm，這樣的場強下雖能得到結果，但分辨率不高。在精確測定DNA分子大小時，應降低電壓至1V/cm。電場強度偏高時電泳分離的線性范圍會變窄，電壓過高時也會由于電泳中產(chǎn)生的大量熱量導 致DNA片段的降解。實驗中要根據(jù)需要選擇合適電壓，如對于DNA大片段的分離可適當選擇較低電壓進行（在 Southern雜交中的DNA電泳），避免托尾現(xiàn)象的產(chǎn)生；而對于小分子 DNA由于其在凝膠中的快速擴散會導致條帶模糊，可選用相對較高的電泳以縮短電泳時 間。5 、

11、溴化乙錠：簡稱EB,電泳中的染色劑，具有扁平結構，能嵌入到DNA堿基對間，對線狀分子與開環(huán)分子影響較小而對超螺旋態(tài)的分子影響較大。當DNA分子中嵌入的EB分子逐漸增多時，原來為負超螺旋狀態(tài)的分子開始向共價閉合環(huán)狀轉變，電泳遷移速度由快變慢；當嵌入的EB分子進一步增加時，DNA分子由共價閉合環(huán)狀向正超螺旋狀態(tài)轉變，這 時電泳遷移速率又由慢變快。這個臨界點的游離EB質量濃度為0.1g/ml0.5g/ml ，即電泳時所加的濃度。因此一般電泳可以忽略此因素，而對于特殊電泳，消除此因素影響可采用 電泳后染色。6 、電泳緩沖液：目前有3種緩沖液適用于天然雙鏈 DNA的電泳：TAE、TBE和TPE, 其組成

12、及特點見表 2。一般常用的DNA電泳選用TAE較多，其電泳時間較快， 而且成本比較 低，但是其緩沖容量較低，需經(jīng)常更換電泳液。表2常用DNA電泳緩沖液四、DNA上樣緩沖液電泳中DNA點樣前必須加入一定量的上樣緩沖液，主要作用如下：1、 螯合Mg+，防止電泳過程中 DNA被降解，一般上樣緩沖液中含10mmol/L的EDTA2、增加樣品密度以保證 DNA沉入加樣孔內，一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油 或蔗糖， 這樣可以增加樣品的比重。 而在大片段電泳中采用 Ficoll （聚蔗糖） ，可減少 DNA 條帶的彎曲和托尾現(xiàn)象。3 、指示劑監(jiān)測電泳的行進過程， 一般加入泳動速率較快的溴酚藍指示電泳的前沿， 它的速率約與 300bp的線狀雙鏈 DNA相同。目前廠商提供的限制性內切酶中都有贈送的上樣緩沖液，一般為10 X上樣緩沖液，DNA羊品中僅需加入1/10的量即可，加入過多的上樣緩沖液會造成電泳輕微的托尾現(xiàn)象。五、DNA上樣量的控制在分析性電泳中，一般樣品投入量達50100ng/帶即可觀察