細胞生物學(xué)實驗匯總

1、實驗一、二：細胞凝集反應(yīng)和細胞膜通透性的觀察【基本原理】細胞膜表面的有分支狀糖外被，細胞間的聯(lián)系、細胞的生長和分化、免疫反應(yīng)、腫瘤的發(fā)生等都和細胞表面的分支狀糖分子有關(guān)。凝集素（lectin）是一類含糖并能與糖分子專一結(jié)合的蛋白質(zhì)，它具有凝集細胞和刺激細胞分裂的作用。凝集素使細胞凝集是由于它與細胞表面的糖分子連接，在細胞表面間形成“橋”的結(jié)果，加入與凝集素互補的糖可以抑制細胞的凝集。細胞膜是細胞與外界環(huán)境進行物質(zhì)交換的結(jié)構(gòu)?？蛇x擇性地讓某些物質(zhì)進出細胞，各種物質(zhì)出入細胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶劑，水分子可以按照物質(zhì)濃度梯度從滲透壓低的一側(cè)通過細胞膜向滲透壓高的一側(cè)擴散，以至于在高滲

2、環(huán)境中，動物細胞會失水而收縮；在低滲環(huán)境中，動物細胞會吸水膨脹直至破裂。本實驗將紅細胞分別放于各種等滲溶液中，由于紅細胞膜對不同溶質(zhì)的通透性不同，使得不同溶質(zhì)透入細胞的速度相差很大，有些溶質(zhì)甚至不能透入細胞。當(dāng)溶質(zhì)分子進入細胞后可引起滲透壓升高，水分子隨即進入細胞，使細胞膨脹，當(dāng)膨脹到一定程度時，紅細胞膜會發(fā)生破裂，血紅素溢出，此時，原來不透明的紅細胞懸液突然變成紅色透明的血紅蛋白溶液，這種現(xiàn)象稱為紅細胞溶血。由于各種溶質(zhì)進入細胞的速度不同，所以不同的溶質(zhì)誘導(dǎo)紅細胞溶血的時間不同，相反可通過測量溶血時間來估計細胞膜對各種物質(zhì)通透性的大小?！痉椒ú襟E】1制備土豆凝集素液和紅細胞懸浮液，制備無血清

3、的雞紅細胞懸液，使凝集素液和紅細胞懸液混合，靜置后，在光鏡（低倍）下觀察凝集素使紅細胞凝集的現(xiàn)象。（以PBS 緩沖液加2血細胞作對照實驗）土豆凝集素的制備：稱取土豆去皮塊莖2g , 加10 mL PBS緩沖液，浸泡2h（浸出的粗提液中含有可溶性土豆凝集素） , 載玻片上滴一滴土豆凝集素,再滴一滴2紅細胞液,充分混勻靜置20 min , 低倍顯微鏡下觀察血球凝集現(xiàn)象。2觀察10%的雞紅細胞懸液，可見該懸液為一種不透明的紅色液體3觀察溶血現(xiàn)象 取一支試管，再加入4ml 蒸餾水，加入0.4ml 雞紅細胞懸液，混勻后注意觀察溶液顏色的變化，可見溶液由不透明的紅色變成透明的紅色液體（可將試管貼靠在書上，

4、隔著試管看書中的字，如發(fā)現(xiàn)溶血則文字可被看清）。4觀察雞紅細胞對不同物質(zhì)的通透性（1）取一支試管，和0.17M 的Nacl 溶液4ml，加入0.4ml 雞紅細胞懸液，輕輕搖勻，用上述方法觀察是否出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，如出現(xiàn)溶血，記下發(fā)生溶血所需要的時間（從加入4ml 溶液算起）（2）按上述方法分別加入下列9種溶液是否導(dǎo)致紅細胞溶血并記錄實驗結(jié)果。 0.17M 氯化銨 0.17M 硝酸鈉 0.17M 硫酸鈉 0.17M 醋酸胺 0.17M 草酸銨 0.17M 葡萄糖 0.17M 甘油 0.17M 乙醇 0.17M 丙酮【實驗結(jié)果】1、 土豆凝集素能使雞紅細胞凝集，PBS 對照液中紅細胞分散均勻。對照組未

5、凝血 ， 實驗組凝血。2、氯化鈉、硝酸鈉、硫酸鈉溶液不溶。醋酸銨>草酸銨>氯化銨>乙醇>甘油>丙酮>葡萄糖。膜通透性大小主要取決于分子大小和分子極性。小分子比大分子容易通過，非極性比極性易通過，帶電荷離子高度不透。實驗三：聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的細胞融合【基本原理】兩個以上的細胞合并成為一個雙核或多核細胞稱為融合細胞。在通常情況下，兩個細胞接觸并不發(fā)生融合現(xiàn)象，因為各自存在完整的細胞膜，在特殊融合誘導(dǎo)物的作用下，兩個細胞膜發(fā)生一定的變化，就可促進兩個或多個細胞聚集，相接觸的細胞膜之間融合，繼之細胞質(zhì)融合，形成一個大的融合細胞。人工細胞融合開始于五十年代，六十

6、年代到七十年代作為一門新興的技術(shù)發(fā)展很快，應(yīng)用范圍極廣。細胞與組織不同，不排斥異類、異種細胞。不僅能產(chǎn)生同種細胞融合、種間細胞融合，而且也能誘導(dǎo)動植物細胞間產(chǎn)生融合。因此，融合細胞的研究為生物學(xué)無論在基礎(chǔ)理論上或生產(chǎn)實踐上開辟了一條新的道路。這一技術(shù)已成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和生物新品種培育的重要手段。細胞融合(Cell fusion)，即在自然條件下或用人工方法(生物的、物理的、化學(xué)的)使兩個或兩個以上的細胞合并形成一個細胞的過程。人工誘導(dǎo)的細胞融合不僅能產(chǎn)生同種細胞融合，也能產(chǎn)生種間細胞的融合，因此細胞融合技術(shù)目前被廣泛應(yīng)用于細胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的各個領(lǐng)域，如研究核質(zhì)關(guān)系、繪制染色

7、體基因圖譜、制備單克隆抗體、育種等。細胞融合的誘導(dǎo)物種類很多 常用的主要有滅活的仙臺病毒(Sendai virus) ， 聚乙二醇（Polyethyleneglycol，PEG）和電脈沖。目前應(yīng)用最廣泛的是聚乙二醇，因為它易得、簡便，且融合效果穩(wěn)定。聚乙二醇(PEG)結(jié)構(gòu)為：HOH2C(CH2OCH2)nCH2OH，相對分子質(zhì)量在200-6000 均可用作細胞融合劑。普遍認為聚乙二醇分子能改變各類細胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細胞接觸點處質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而使細胞發(fā)生融合?！痉椒ú襟E】1采血及雞紅細胞懸液的制備（同教材57 頁）。

8、2（共2 組）取雞紅細胞懸液1mL，移人10mL 離心管， 加入4mL 0.85生理鹽水混勻。1000rmin 離心5 min。3棄上清液(用吸管吸去)，加0.85生理 鹽水5mL，用指彈法（或吸管輕吹）將細胞團塊彈散，混勻后1000rmin 離心5min；重復(fù)上述條件，再離心洗滌1 次。4收集最后1 次離心沉淀的血細胞，加入適量（58mL）的GKN 液，輕吹散，混勻。5（每4 人）取懸液1mL 到1 個試管中，加入0.5 mL 預(yù)熱的50PEG 混勻，置于30水浴中溫浴35min；取未融合和融合的血細胞懸液各1 滴分別滴于載玻片上的兩側(cè)，蓋上蓋玻片。6利用光學(xué)顯微鏡 (高倍) 以未融合細胞為

9、對照觀察2 個靠近細胞形成融合的過程?！窘Y(jié)果觀察】在高倍鏡下可以看到有兩個或兩個以上的雞紅細胞膜融合在一起，形成一個同核體細胞。要注意辨別融合細胞與重疊的雞紅細胞?！緦嶒灲Y(jié)果】在高倍鏡下可以看到有兩個或兩個以上的雞紅細胞膜融合在一起，形成一個同核體細胞。要注意辨別融合細胞與重疊的雞紅細胞。實驗四：線粒體和液泡系的超活染色與觀察【基本原理】線粒體是細胞內(nèi)一種重要細胞器，細胞的各項活動所需要的能量，主要是通過線粒體呼吸作用來提供的。活體染色是應(yīng)用無毒或毒性較小的染色劑真實地顯示活細胞內(nèi)某些結(jié)構(gòu)而又很少影響細胞生命活動的一種染色方法。詹納斯綠 B（Janus green B）是線垃體的專一性活細胞染

10、色劑，毒性很小，屬于堿性染料，解離后帶正電，由電性吸引堆積在線粒體膜上。線粒體中細胞色素氧化酶使染料保持氧化狀態(tài)呈藍綠色，從而使線粒體顯色，而在周圍的細胞質(zhì)中染料被還原，成為無色狀態(tài)。細胞中的線粒體呈藍綠色的顆粒。中性紅對液泡系的染色具有專一性，將活細胞中的液泡系染成紅色?！痉椒ú襟E】1線粒體的超活染色與觀察1）口腔上皮細胞線粒體的超活染色：1/5000 詹納斯綠B1-2 滴，口腔上皮細胞（牙簽刮?。d玻片于37恒溫染色10-15min，顯微鏡下觀察。2）洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞線粒體的超活染色與觀察：1/5000 詹納斯綠B 溶液1-2 滴，洋蔥鱗莖內(nèi)表皮，載玻片于37恒溫水浴染色10-15mi

11、n，顯微鏡下觀察。2小麥（或綠豆）幼根根尖液泡系的中性紅染色觀察小麥（或綠豆）幼苗根尖（1-2cm）縱切面切片，1/3000 中性紅溶液1 滴染色5-10min，載玻片于37恒溫水浴，蓋上蓋玻片壓扁根尖，顯微鏡下觀察?！緦嶒灲Y(jié)果】口腔上皮細胞的線粒體分布 洋蔥內(nèi)表皮細胞線粒體分布 植物根尖液泡的中性紅染色實驗五：植物細胞微絲束的光學(xué)顯微鏡觀察【基本原理】細胞骨架在通常情況下不穩(wěn)定：如低溫、高壓、餓酸處理等。當(dāng)用適當(dāng)濃度的TritonX-100 處理細胞時，能溶解質(zhì)膜結(jié)構(gòu)中及細胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)，而細胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)卻不被破壞顯得更清晰，M-緩沖液洗滌細胞，可以提高細胞骨架的穩(wěn)定性，戊二醛固定能較

12、好地保存細胞骨架成分，經(jīng)考馬斯亮藍R250 染色后，可使細胞骨架蛋白著色，而胞質(zhì)背景著色弱，有利細胞骨架纖維顯示。微絲、微管和中間纖維都是直徑很小的結(jié)構(gòu)，最大的單根微管才25nm 左右，只能在電鏡下才能觀察到。目前研究細胞骨架的主要方法是應(yīng)用高壓電鏡或免疫熒光顯微鏡技術(shù)。本實驗用普通光鏡觀察到細胞骨架，是因為骨架纖維成束分布、結(jié)構(gòu)經(jīng)染色后，有夸大作用。由于細胞經(jīng)TritonX-100 抽提后剩下的主要是細胞骨架成分，使得顯現(xiàn)更清晰。細胞骨架是指細胞質(zhì)中縱橫交錯的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，按組成成分和形態(tài)結(jié)構(gòu)的不同可分為微管、微絲和中間纖維。它們對細胞形態(tài)的維持、細胞的生長、運動、分裂、分化和物質(zhì)運輸?shù)绕鹬?/p>

13、要作用。光學(xué)顯微鏡下細胞骨架的形態(tài)學(xué)觀察多用1% Triton X-100 處理細胞，可使細胞膜溶解，而細胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)被保存， 再用考馬斯亮蘭R250 染色，使得胞質(zhì)中細胞骨架得以清晰顯現(xiàn)?！緦嶒炗闷贰?材料：新鮮洋蔥鱗莖2試劑 1） M 緩沖液（pH 7.2）各成分終濃度為：50mmol/L 咪唑(MW:68.08)； 50mmol/L KCl(MW:74.55)； 0.5mmol/L MgCl2·6H2O(MW:203.30)； 1mmol/L EGTA(MW:380.36)；0.1mmol/L EDTA-Na2(MW:372.24)； 1mmol/L DTT(MW:154

14、.3)2） 6mmol/L PBS 磷酸緩沖液 （pH 6.5）：KH2PO4 : Na2HPO4.2H2O = 7:33） 0.7% NaCl 生理鹽水4） 1% Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 溶于 M-緩沖液5） 3% 戊二醛100mL: 25% 戊二醛取12mL，PBS 88mL6） 0.2% 考馬斯亮藍R250 染液 200mL：考馬斯亮藍R250 0.2g；甲醇 46.5mL；冰乙酸 7mL；蒸餾水46.5mL3儀器：光學(xué)顯微鏡，鑷子，剪刀，試管，表面皿，滴管，載玻片，蓋玻片【方法步驟】【實驗結(jié)果】洋蔥鱗莖外層與內(nèi)層的表皮細胞比較（放大倍數(shù)10×20）附：

15、各種主要試劑的作用1Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)作用：非離子去垢劑；適當(dāng)濃度的Triton X-100，可使細胞膜溶解，而細胞質(zhì)中的細胞骨架系統(tǒng)可被保存。2M緩沖液和磷酸緩沖液作用：維持細胞的滲透壓。3EDTA（乙二胺四乙酸）和EGTA（乙二醇雙醚四乙酸）作用：前者可螯合大部分金屬離子；后者專一性螯合Ca2，主要是高濃度的Ca2可是微管解聚，因此加入EGTA 來降低Ca2的濃度。4戊二醛作用：良好的固定劑，使細胞結(jié)構(gòu)保持它原有狀態(tài)；5考馬斯亮蘭作用：非專一性結(jié)合蛋白質(zhì)，使蛋白著色（藍色）。實驗六 植物染色體標本的制備與觀察實驗原理：（1）植物根尖生長點與莖生長點，不存在G0

16、期，不斷分裂，所以一般取根尖實驗。（2）秋水仙素處理，能使大量細胞分裂停留在中期，有助于觀察染色體。（3）低滲溶液使細胞體積增大，染色體分散，容易觀察計數(shù)。實驗步驟：1、將小麥種子培養(yǎng)在培養(yǎng)在培養(yǎng)皿中，室溫下發(fā)芽，待胚根長達1-2厘米時，切取0.5cm長的根尖部分。2、預(yù)處理：將切下的根尖浸入1%的秋水仙素溶液中，室溫下處理3-4小時或0度低溫處理24小時。3、固定：取出根尖，投入Carnoy液固定半小時，冰箱中保存?zhèn)溆谩?、水解：將根尖用自來水漂洗5次，每次3分鐘，再加入1%纖維素酶和果膠酶混合酶液1ml，在37攝氏度恒溫水浴鍋中酶解6h.4、取出，吸干酶液，加蒸餾水，低滲30分鐘。5、取出

17、，用吸管吸取3-4根根尖置于載玻片上，吸干水后搗碎，滴Carnoy液3滴涂開，酒精燈烤干。6、Giemsa液染色5-10分鐘。7、自來水沖洗，晾干后鏡檢。實驗七：DNA 的顯示Feulgen 反應(yīng)【基本原理】Feulgen 反應(yīng)（Feulgen reaction）是顯示DNA 的最典型的組織化學(xué)反應(yīng)，為學(xué)者Feulgen 和Rossenbeck于1924 年發(fā)明，簡稱為Feulgen 法。因?qū)NA 的顯示反應(yīng)具有高度專一性，故常被用來顯示細胞內(nèi)DNA的分布情況。其具體反應(yīng)原理是，標本經(jīng)稀鹽酸水解后，DNA 分子中的嘌呤堿基被解離，從而在核糖的一端出現(xiàn)了醛基。Schiff 試劑中的無色品紅可與

18、醛基反應(yīng)，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基為發(fā)色團，故可呈現(xiàn)出紫紅色。也就是說, DNA 經(jīng)稀酸水解后產(chǎn)生的醛基，具有還原作用，可與無色品紅結(jié)合形成紫紅色化合物，從而顯示出DNA 的分布。其反應(yīng)機制如下圖所示。2HCl+Na2S2O52NaCl+SO2+H2SO3 DNA經(jīng)溫稀酸水解，其上的嘌呤堿和脫氧核酸之間的鍵打開，使脫氧核糖的一端形成游離的醛基，這些醛基在原位與Schiff試劑中的無色品紅反應(yīng)，形成紫紅色的化合物， 因此Feulgen反應(yīng)中，顯示紫紅色的細胞部位，即標志有DNA的存在。Feulgen反應(yīng)現(xiàn)仍廣泛用于DNA的定性定位和定量的顯微測定技術(shù)上?！緦嶒炗闷贰?試劑 1

19、）schiff 氏試劑 將0.5g 堿性品紅置入三角燒瓶內(nèi)沸騰的蒸餾水中，時時搖動玻璃瓶，煮沸5min 使之充分溶解，冷卻至50時過濾，加入10ml 1mol/L HCl，冷至25時，加入0.5g 偏重亞硫酸鈉（Na2S2O3）無水亞硫酸鈉（NaHSO3），在室溫冷暗處至少放置24h（有時需23 天），使其顏色退至淡黃色，密封瓶口，藏于暗處，最好保存于4冰箱中（可保存數(shù)月或更長時間）。在使用前加入0.5g 活性碳, 搖1min,用粗濾紙過濾，濾液應(yīng)為無色；若液體顏色變?yōu)榉奂t色，便不能再用。2）亞硫酸水（洗滌劑）：用200ml 普通自來水（不要用蒸餾水, 以免引起誤差）、10ml 10%的偏重亞

20、硫酸鈉水溶液和10ml 1mol/L HCl，三者在使用前混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。3）1mol/L HCl（水解用）：取82.5ml 比重為1.19 的鹽酸加蒸餾水1000ml 即成（應(yīng)將鹽酸緩緩加入水中）?！痉椒ú襟E】 切取根尖或撕取表皮 Carnor固定劑 15min 70%酒精復(fù)水 5min 30%酒精復(fù)水 5min H20 實驗組 對照組 5%三氯乙酸(TCA) 90保溫，15min H2o 5min 1mol/L Hcl 室溫 15min H2O漂洗 Schiff 試劑 40-60min 亞硫酸水溶液沖洗三次（每次5分鐘） 自來水 將染色后的根尖或表皮漂洗干凈。 選效果好的材料壓片 水壓片

21、鏡檢觀察【實驗結(jié)果】細胞核中的DNA 呈鮮亮的紫紅色反應(yīng)，它不但反應(yīng)出DNA 存在的部位及其分布情況，而且還可從顏色反應(yīng)的深淺，來判斷DNA 的相對含量。細胞質(zhì)DNA 也會出現(xiàn)陽性反應(yīng)。 附：Feulgen 方法應(yīng)注意的幾個問題：1對照切片的制做：進行Feulgen 反應(yīng)時, 一般要做一對照切片以便驗證反應(yīng)結(jié)果。對照切片應(yīng)不經(jīng)水解直接放在schiff 劑內(nèi)，且應(yīng)為負反應(yīng)。但需要注意的是，對照切片在schiff 試劑中最多不要超過1 h （0.5h 即可)，時間過長，試劑本身的酸性也會使DNA 水解，從而出現(xiàn)假的正反應(yīng)。2固定劑的選擇：以前很多人認為，選用的固定劑不應(yīng)含有醛基或含有氧化劑。后來發(fā)

22、現(xiàn)含醛基或氧化劑的固定劑對反應(yīng)的專一性并沒有影響。實踐證明，一切好的組織學(xué)固定劑均適用于Feulgen 反應(yīng)。如Bhampy 固定劑、Helly 固定劑、Flemming 固定劑、OsO4 固定劑、Carnoy 固定劑、zenker 固定劑和Bouin-Aller 固定劑。但在上述固定劑中，以O(shè)sO4 和Carnoy 效果較好，OsO4（1%或0.5%)是Feulgen反應(yīng)的理想固定劑，只是因OsO4 價錢較貴，故一般多采用Carnoy 固定液。在Feulgen 反應(yīng)中，不能單獨使用Bouin 定液，因為它是Feulgen 反應(yīng)的最壞固定劑，但經(jīng)Aller 改進后的Bouin-Aller 固定

23、液效果卻較好。3水解時間：Feulgen 反應(yīng)通常用稀酸進行水解，但水解的時間一定要適當(dāng)。如水解時間不夠, 反應(yīng)就會變?nèi)?；如水解時間過長?；蛩獾剡^于劇烈，則脫氧核糖也易掉下來，反應(yīng)也會減弱。適當(dāng)?shù)乃鈺r間一般為812min。但是水解時間長短也要視標本的類型（如厚薄等)、固定劑的性質(zhì)以及酸的濃度而定。4Schiff 試劑的作用：Feulgen 反應(yīng)成功與否的一個非常關(guān)鍵的因素，就是schiff 試劑的質(zhì)量。有一大類試劑均稱為堿性品紅，它們實際上是由幾種產(chǎn)品分別組成的。因此只能選用注明“DNA 染色反應(yīng)用”的堿性品紅才行。此外，Schiff 試劑的配制方法也可影響DNA 的染色反應(yīng)。實驗八：小鼠

24、腹腔巨噬細胞吞噬現(xiàn)象的觀察【基本原理】細胞的吞噬作用在單細胞動物是攝取營養(yǎng)物質(zhì)的方式，在高等動物內(nèi)的巨噬細胞、單核細胞和中性粒細胞等具有吞噬功能，是機體非特異性免疫功能的重要組成部分。巨噬細胞是由骨髓干細胞分化生成，當(dāng)病原微生物或其他異物侵入機體時，巨噬細胞由于具有趨化性，便向異物處聚集，巨噬細胞可將之內(nèi)吞入胞質(zhì)，形成吞噬泡，然后在胞內(nèi)與溶酶體融合，將異物消化分解。吞噬泡的形成需要有微絲及其結(jié)合蛋白的幫助，如果用降解微絲的藥物細胞松弛素B 處理細胞，則可阻斷吞噬泡的形成；免疫抑制劑環(huán)磷酰胺（CYP）對巨噬細胞的吞噬作用也有影響。巨噬細胞起源于骨髓，經(jīng)血液進入組織中而成，分布于全身各處。當(dāng)機體受

25、到某些損傷因素時（如微生物或其它病原體或異物侵入），能招引巨噬細胞，同時巨噬細胞有趨化性，主動向病原體或異物游走，在接觸到病原體或異物時，細胞膜凹陷伸出偽足包圍異物，并發(fā)生胞吞作用形成吞噬泡，繼而細胞質(zhì)中的溶酶體與吞噬泡融合，消化分解異物。含臺盼藍的淀粉肉湯，可使腹腔中有較多的吞噬細胞，以供觀察吞噬活動。【方法步驟】1實驗前二天，每天向小鼠腹腔注射6%淀粉肉湯（含臺盼蘭，起標記作用）1ml 以刺激腹腔產(chǎn)生較多的巨噬細胞（此步由教師在實驗前進行完畢）。2實驗時，每組取一只上述處理的小鼠，腹腔注射1% 雞血懸液0.51ml，注射后輕揉小鼠腹部以使紅細胞懸液分散均勻。320 分鐘后，用頸椎脫臼法處死

26、小鼠，迅速剖開小鼠腹部，向腹腔部注射0.51ml 生理鹽水，用吸管輕輕使生理鹽水與腹腔液混勻。4用吸管抽取腹腔液，滴片，然后蓋上蓋玻片。5鏡檢【實驗結(jié)果】在高倍鏡下可見有許多較大的圓形和形狀不規(guī)則的巨噬細胞，因未染色細胞核不易見到，其胞質(zhì)中含有數(shù)量不等的蘭色圓形小顆粒（即吞入的含臺盼蘭的淀粉肉湯所形成）；還可見少量黃色橢圓形有明顯細胞核的雞紅細胞，慢慢移動玻片標本，仔細觀察視野中的巨噬細胞表面，有的紅細胞已部分被吞入；有的巨噬細胞內(nèi)已吞入了一個或多個紅細胞形成吞噬泡。實驗九：小鼠骨髓染色體標本的制備與觀察【基本原理】在真核生物中, 染色體的數(shù)量和形態(tài)具有物種的特異性, 迄今一直可以此作為物種分

27、類的基本依據(jù)之一。染色體作為遺傳物質(zhì)-DNA 的載體, 對生物的遺傳、變異、進化和個體發(fā)生, 以及細胞的增殖和生理過程的平衡控制等都具有十分重要的意義。每一個物種的細胞一般都有一定數(shù)目、形狀和大小的染色體。將體細胞核中全部染色體按照其大小、著絲粒位置，以至帶型有序地排列起來，此模式圖象排列即為核型（karyotype）或染色體組型。核型分析均是以中期染色體為標準，對制作出的染色體標本進行照相以獲得染色體的顯微圖象，并將其剪裁排列即成。華裔學(xué)者莊有興（Joe Hin Tjio）和瑞典學(xué)者A.Levan 合作, 利用低滲法研究胎兒肺組織的染色體標本制做方法，終于在1956 年首次確定了人類的染色體

28、數(shù)目是46 條，而不是前人所主張的48 條，這為后來的人類核型研究奠定了基礎(chǔ)。自身正處于活躍分裂狀態(tài)或用植物血球凝集素（phytohemagglutinin，PHA）處理后處于分裂狀態(tài)的組織或細胞，均可用于染色體標本的制作與分析。在正常動物體中，精巢和骨髓均為是活躍分裂的組織，可不經(jīng)PHA 處理直接用來制作染色體標本。但在取材方面，精巢又比骨髓要簡易一些。骨髓細胞具有高度的分裂活性，經(jīng)秋水仙素或秋水酰胺處理后，使分裂細胞阻斷在有絲分裂中期，再經(jīng)低滲處理、固定、滴片、染色等步驟，可制作較好的骨髓細胞的染色體標本。對于骨髓染色體標本的制作，一般包括以下幾個要點：1）用一定劑量的秋水仙素破壞紡錘絲的

29、形成，使細胞分裂停滯在中期，使中期染色體停留在赤道面處；2）用低滲法使將細胞膨脹，再經(jīng)固定液固定，盡可能使染色體的結(jié)構(gòu)保持不變，在滴片時細胞被脹破，使細胞的染色體鋪展到載片上；3）空氣干燥法可使使細胞的染色體在載片上展平，經(jīng)Giemsa 染色后便可觀察到染色體的顯微圖象?！痉椒ú襟E】1取青蛙，于實驗前78 小時，腹腔注射秋水仙素（按每克體重6 微克）。2處死青蛙，取其股骨及肱骨，去掉骨上的肌肉。3用骨剪將股骨頭的兩端剪去,用注射器吸取1mL0075 mol/L 氯化鉀溶液；注入骨髓腔將骨髓洗出于刻度離心管中。4吹打分散細胞,靜置 20分鐘。5離心機離心(2000 轉(zhuǎn)分鐘)5分鐘去上清.6|.

30、加入新配制的卡諾固定液1ML固定20分鐘（甲醇3：冰醋酸1）。用吸管輕輕混勻進行預(yù)固定，然后以2000 轉(zhuǎn)分鐘離心5 分鐘，棄去上清液。7加入新配固定液0.5毫升（視細胞多少而定）制成細胞懸液，用吸管吸取細胞懸液，滴2 3 滴于預(yù)冷的載玻片上，并吹散細胞。將載玻片在酒精燈上微烤。再用電吹風(fēng)將標本吹干（或空氣干燥）。8滴Giemsa 染液68 滴于載玻片上，室溫下染色3 分鐘左右，自來水沖洗，用電吹風(fēng)吹干（或空氣干燥）。（注：雞染色體的制作方法基本相同）。9將制好的玻片標本在低倍鏡下觀察，然后換高倍鏡找到分散良好的分裂相，再轉(zhuǎn)油鏡仔細觀察?！緦嶒灲Y(jié)果】在顯微鏡下，染色體被染成紫紅色，胞漿完全不著

31、色。對于分散好的染色體, 其間相互散開, 短臂收縮適中, 二條姐妹染色單體大致平行分離, 著絲粒清晰可見。小鼠的染色體數(shù)為40 條，多為端部和亞端部染色體，只有2 對亞中部著絲粒染色體。附 染色體標本制做質(zhì)量不佳的可能原因：1 秋水仙素用量太多或處理時間過長，都會導(dǎo)致染色體的過分縮短或著絲點迅速裂解，最終使染色體被破壞或溶解。2.低滲處理極為重要，低滲液的量、處理時間均與細胞的數(shù)量有關(guān)。低滲過度時, 細胞會破裂，成膜上??；不足時則染色體積在一起，因此，低滲處理直接影響染色體分散之好壞。 3.離心速度太高或離心時間過長。細胞團塊不易打散；速度過低或離心時間過短, 使 細胞不易沉降，會失去大量分裂

32、相。4固定液要隨用隨配, 固定徹底后再打散細胞團塊, 否則細胞容易破碎, 染色體分散亦受到影響。5載玻片如有油脂或冷卻不夠亦影響的鋪展。固定（fication）目的是保持細胞自然形態(tài)，防止細胞自溶和細菌所致的腐??；固定液能沉淀和凝固細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和破下細胞內(nèi)溶酶體酶，使細胞不但保持自然形態(tài)，而且結(jié)構(gòu)清晰，易于著色。因此標本愈新鮮，固定愈及時，細胞結(jié)構(gòu)愈清晰，染色效果愈好。染 色染色的目的和原理：染色的日的是借助于一種或多種染料，使組織和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)分別著不同的染色，這樣在顯微鏡下能清楚地觀察細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，作出正確判斷。染色的物理作用是利用毛細管現(xiàn)象，滲透、吸收和吸附作用，使染料的色素顆粒牢固地進入

33、組織細胞，并使其顯色。染色的化學(xué)作用是滲入組織細胞的染料與其相應(yīng)的物質(zhì)起化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生有色的化合物。 實驗十 細胞內(nèi)酸性磷酸酶的顯示【 實驗原理 】細胞中存在著能分解磷酸酯的酶，它們可分為一磷酸酯酶、二磷酸酯酶和三磷酸酯酶等三類，其中最主要的是一磷酸酯酶。這類酶按最適pH值又可分為兩類，一類在pH9.5左右的條件下發(fā)揮作用，稱為堿性磷酸酶；另一類在pH5.0左右的條件下發(fā)揮作用，稱為酸性磷酸酶。當(dāng)酸性磷酸酶與含有磷酸酶的作用底物（如甘油磷酸鈉）一起保溫時，能水解磷酸酯使其釋放出磷酸基，磷酸基進而與底物中存在的鉛鹽結(jié)合形成無色的磷酸鉛（PbHPO4）沉淀物，當(dāng)用黃色的硫化銨作用該沉淀時可形成黃棕色或棕黑色的硫化鉛沉淀；從而使細胞中酸性磷酸酶顯示出來。本實驗項目以小鼠腹腔巨噬細胞為材料顯示該酶的存在。試劑的配制（1） 6%淀粉肉湯：稱取牛肉膏0.3g、蛋白胨1g、氯化鈉0.5g加入到100ml蒸餾水中溶解，再加入可溶性淀粉6g，溫浴溶解，煮沸15分鐘滅菌，置4°C冰箱中保存，使用時水浴融化。（2） 0.85%生理鹽水：稱取8.5gNaCl溶于1000ml蒸餾水中。（3） 酸性磷酸酶工作液： 0.05mol/L醋酸緩沖液：先用2ml注射器抽取1.2ml冰乙