多倍體誘發(fā)及細(xì)胞學(xué)鑒定-山東大學(xué)

1、 山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告 2014年 4 月11日科目 遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目 多倍體誘發(fā)及細(xì)胞學(xué)鑒定 多倍體誘發(fā)及細(xì)胞學(xué)鑒定摘要 多倍體是指由受精卵發(fā)育而來(lái)并且體細(xì)胞中含有三個(gè)或三個(gè)以上染色體組的個(gè)體。多倍體育種在目前的植物育種領(lǐng)域相對(duì)較廣。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大蒜根尖組織人工進(jìn)行秋水仙素處理，使其成為多倍體，再經(jīng)固定、解離、染色和壓片制作成大蒜根尖分生組織臨時(shí)裝片。通過(guò)在顯微鏡下觀察染色體的形態(tài)和數(shù)目，從細(xì)胞學(xué)上鑒定誘導(dǎo)是否成功，從而掌握人工誘導(dǎo)多倍體植物的方法和利用染色體分析鑒定多倍體細(xì)胞。1. 引言1916 年Winker1在研究Salanum nigum嫁接時(shí)從愈傷組織得到了四倍體植物，首先引入了多倍體這一

2、概念。多倍體育種是指利用人工誘變或自然變異等，通過(guò)細(xì)胞染色體組加倍獲得多倍體育種材料，用以選育符合人們需要的優(yōu)良品種。自然界中大約有3035的被子植物，其中70的禾本科植物屬于多倍體，它們?cè)谥参镞M(jìn)化中起了重要的作用。多倍體具有以下特性：巨大性：隨著染色體加倍，細(xì)胞核和細(xì)胞變大，組織器官也變大；可孕性低：部分多倍體（例如三倍體）是高度不孕的，會(huì)表現(xiàn)為無(wú)籽且種子皺縮的現(xiàn)象；適應(yīng)性強(qiáng)：植物多倍化不僅能使植物基因活性及酶的差異性增強(qiáng)，而且還增強(qiáng)植株的生態(tài)適應(yīng)性、對(duì)逆境的抗耐性；有機(jī)合成速率增加：多倍體有多套基因，新陳代謝旺盛，酶活性加倍，利于提高有機(jī)物的合成速率；克服遠(yuǎn)緣雜交的不結(jié)實(shí)性等。多倍體能夠通

3、過(guò)合子染色體數(shù)加倍、植株分生組織內(nèi)細(xì)胞的染色體加倍和生殖細(xì)胞的染色體加倍來(lái)形成。自然界中，多倍體的產(chǎn)生多是適應(yīng)惡劣環(huán)境條件的結(jié)果。其產(chǎn)生的原因是由于溫度驟變，細(xì)胞分裂時(shí)染色體不分離或染色體分離而細(xì)胞沒有分裂，導(dǎo)致體細(xì)胞染色體加倍。在人工誘導(dǎo)的過(guò)程中，多倍體形成大多數(shù)是由分生組織細(xì)胞內(nèi)的染色體加倍后所產(chǎn)生的結(jié)果。人工誘導(dǎo)多倍體的方法主要有：（1）物理方法：溫度劇變、機(jī)械損傷、各種射線處理等；（2）化學(xué)方法：各種植物堿、麻醉劑、植物生長(zhǎng)激素處理等。其中，最常用、最有效的多倍體育種方法是用秋水仙素或低溫誘導(dǎo)來(lái)處理萌發(fā)的種子或幼苗。秋水仙素能抑制細(xì)胞有絲分裂時(shí)形成紡錘體并抑制細(xì)胞板的形成，但不影響染色

4、體的復(fù)制，使細(xì)胞不能形成兩個(gè)子細(xì)胞，而染色數(shù)目加倍。本次實(shí)驗(yàn)用秋水仙素處理常見的大蒜根尖材料使其成為多倍體，經(jīng)過(guò)固定、解離、染色和壓片等步驟制作臨時(shí)裝片，并在顯微鏡下觀察染色體數(shù)目和形態(tài)。2. 材料和方法2.1 實(shí)驗(yàn)材料 材料：大蒜顯微鏡，刀片，鑷子，解剖針，載玻片，蓋玻片；0.15%秋水仙素溶液，卡諾氏固定液，蒸餾水，70%乙醇，1MHCl，染液：改良苯酚品紅。2.2 實(shí)驗(yàn)方法2.2.1 獲取實(shí)驗(yàn)材料取大蒜的發(fā)根至0.5-1cm，然后轉(zhuǎn)入盛有0.15%秋水仙素水溶液的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，待觀察到根部有膨大時(shí)取出固定。固定時(shí)間最適宜選在下午5-6點(diǎn)，染色體凝縮至最短。與在水中培養(yǎng)的材料做

5、對(duì)照。（一般植物的生長(zhǎng)周期17-18小時(shí)）2.2.2 固定將植物根尖材料至于卡諾固定液中固定24小時(shí)，移至70%乙醇中保存或備用。2.2.3 解離植物的分生組織需要經(jīng)過(guò)處理以便除去細(xì)胞之間的果膠層并使細(xì)胞壁軟化，經(jīng)解離的組織才能順利壓片。解離常用方法有：（1）酸解法：固定好的材料用清水洗滌一遍，用1mol/L HCl在60水浴恒溫處理5-10min。然后水洗三次。一定要掌握好酸解過(guò)程的溫度和時(shí)間。若解離不夠，則壓片不易分散；若解離太過(guò)，則下一步處理材料時(shí)會(huì)因材料過(guò)軟而易丟失。（2）酶解法：用10-20g/L的果膠酶或與10-50g/L的纖維素酶混合使用。2.2.4 染色 在解剖鏡下切取一小段根

6、尖分生組織區(qū)，用改良苯酚品紅溶液染色15Min。2.2.5 壓片將染色后的材料蓋上蓋玻片，用一個(gè)雙面刀片插到蓋玻片和載玻片之間的一個(gè)小角，蓋上兩層吸水紙，用左手食指緊壓蓋玻片防止其滑動(dòng)，用右手用解剖針針柄輕敲蓋玻片，使材料均勻分散。再將刀片撤出，用針柄重新敲蓋玻片，使細(xì)胞更好地分散壓平。在顯微鏡下粗略觀察，若染色體基本展開，則用拇指垂直按壓裝片；若細(xì)胞均未展開或展開不完全，則在玻片下滴幾滴清水后重新敲片直至其分散開來(lái)。2.2.6 鏡檢鏡檢時(shí)先用低倍鏡進(jìn)行觀察，找到分散較好的染色體再轉(zhuǎn)用高倍鏡觀察。3. 結(jié)果3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖 圖1 低倍鏡下的染色體（10X10）圖2大蒜根尖分生區(qū)四倍體細(xì)胞染色

7、體圖（32條，10X40）圖3 大蒜根尖分生區(qū)二倍體細(xì)胞分裂后期染色體圖（10X40）3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析根據(jù)圖1，總體來(lái)看實(shí)驗(yàn)結(jié)果一般，部分細(xì)胞已分散開來(lái)，細(xì)胞質(zhì)著色較淺，背景清晰無(wú)過(guò)多雜質(zhì)。由于敲片力度的不均勻?qū)е掠行┘?xì)胞中染色體斷裂而有些細(xì)胞中染色體仍舊成一團(tuán)。觀察圖2中的染色體，可以較清楚的數(shù)出有32條染色體，是分裂前期的四倍體細(xì)胞。但仔細(xì)看發(fā)現(xiàn)染色體略微有些不處于同一平面，不過(guò)不大影響觀察計(jì)數(shù)。圖3中是另一張裝片的染色體，由于染色過(guò)淺且染色體有重疊，觀察具體計(jì)數(shù)比較費(fèi)勁。根據(jù)染色體的形態(tài)和排列方式看，細(xì)胞可能處在分裂后期，大致估計(jì)是16條染色體的二倍體。4. 討論4.1注意事項(xiàng)及改進(jìn)

8、之處：（1） 壓片時(shí)不應(yīng)在材料上方直接敲擊材料，而是在材料的邊緣通過(guò)敲擊蓋玻片的震動(dòng)使材料細(xì)胞均勻分散。敲擊過(guò)程需要耐心，否則容易出現(xiàn)染色體斷裂或是細(xì)胞分散不均勻的情況。（2） 多倍體植物具有巨大性，所以制片時(shí)應(yīng)該選擇較粗的根尖，其中多倍體細(xì)胞相對(duì)較多。（3） 酸解過(guò)程中要掌握好時(shí)間和溫度，若解離不夠，則壓片不易分散。若解離太過(guò)，在下一步處理材料時(shí)由于材料過(guò)軟而易丟失。（4） 染色的時(shí)間需要掌控好，注意不要讓染液干了，如果染液偏干，應(yīng)補(bǔ)加染液。4.2 擴(kuò)展知識(shí)根據(jù)查找文獻(xiàn)知2，植物多倍體誘導(dǎo)過(guò)程中出現(xiàn)嵌合體的現(xiàn)象是經(jīng)常的，即一部分細(xì)胞或器官為二倍體，而另一部分則為多倍體。在誘導(dǎo)過(guò)程中，二倍體向

9、多倍體轉(zhuǎn)化，如果處理時(shí)間短、濃度低，在解除處理后二倍體細(xì)胞多于多倍體細(xì)胞，在競(jìng)爭(zhēng)中具優(yōu)勢(shì)，則產(chǎn)生回復(fù)突變，細(xì)胞或器官經(jīng)繼續(xù)分裂生長(zhǎng)后均回復(fù)為二倍體，誘變沒有效果。隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，二倍體細(xì)胞數(shù)目越來(lái)越少，多倍體細(xì)胞數(shù)目越來(lái)越多，當(dāng)多倍體細(xì)胞數(shù)量明顯多于二倍體細(xì)胞時(shí)，去掉誘導(dǎo)劑的抑制作用，多倍體細(xì)胞在與二倍體細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)中處于優(yōu)勢(shì)時(shí)，則形成多倍體生物個(gè)體。當(dāng)然，當(dāng)誘變劑濃度過(guò)高或處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，雖然被誘導(dǎo)的生物體細(xì)胞均變?yōu)槎啾扼w或高倍體，但細(xì)胞活力近于喪失，難于恢復(fù)分裂能力而死亡。參考文獻(xiàn)1 Winkler H. Ueber die experimentelle Erzeugung yon Pflanzen mit abweichenden Chromosomenza