小麥質(zhì)核互作型雄性不育系及其保持系花藥差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析 -

1、小麥質(zhì)核互作型雄性不育系及其保持系花藥差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析*陳蕊紅葉景秀張改生*王俊生牛娜馬守才趙繼新朱建楚(西北農(nóng)林科技大學(xué),陜西省作物雜種優(yōu)勢研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/小麥育種教育部工程研究中心,楊凌712100摘要為了能從蛋白質(zhì)水平揭示小麥細(xì)胞質(zhì)雄性不育的分子遺傳機(jī)制,采用IEF/SDS-PAGE 雙向凝膠電泳技術(shù),對小麥質(zhì)核互作型雄性不育系(S-1376A 及其保持系(A-1376B 在花藥發(fā)育的單核期、二核期蛋白質(zhì)進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究,經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色,得到了重復(fù)性較好的雙向電泳圖譜.PDQuest 軟件在分子質(zhì)量9.0100.0ku 、等電點(diǎn)47線性范圍內(nèi),可識別約610個蛋白質(zhì)點(diǎn),

2、對28個差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)采用基質(zhì)輔助激光解吸分離飛行時間質(zhì)譜進(jìn)行肽指紋圖譜分析,并利用Mascot 軟件在NCBInr 數(shù)據(jù)庫搜索,鑒定出12個差異表達(dá)蛋白,其中5個差異表達(dá)蛋白可能與雄性不育有關(guān),分別是泛素結(jié)合酶E2、甘氨酸富集蛋白、抗壞血酸過氧化物酶、假定半胱氨酸蛋白酶抑制劑及1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小鏈克隆512,它們參與了物質(zhì)能量代謝、細(xì)胞程序化死亡及花發(fā)育調(diào)控等過程,推測不育系(S-1376A 雄性不育性可能與這些生理生化代謝有關(guān).研究結(jié)果為揭示雄性不育機(jī)理提供了理論依據(jù).關(guān)鍵詞小麥,質(zhì)核互作型雄性不育,差異蛋白質(zhì)組學(xué),雙向凝膠電泳,基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜學(xué)科分類號

3、Q946.1,Q51DOI:10.3724/SP.J.1206.2008.00515*國家自然科學(xué)基金(301705760,國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863(2002AA207004,陜西省“13115”科技創(chuàng)新工程重大科技專項(xiàng)(2007ZDKG-020,國家楊凌農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種中心專項(xiàng)基金(99-1A和西北農(nóng)林科技大學(xué)拔尖人才支持計劃項(xiàng)目資助項(xiàng)目.*通訊聯(lián)系人.Tel/Fax:029-*,E-mail:zhanggsh 收稿日期:2008-07-19,接受日期:2008-09-02生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展Progress in Biochemistry and Biophysics 2009,3

4、6(4:431440研究報告Research Papers 細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS是一種廣泛存在于高等植物中的生物學(xué)現(xiàn)象,因其雄性生殖系統(tǒng)不能產(chǎn)生有功能的花粉,而雌性生殖系統(tǒng)發(fā)育和營養(yǎng)生長完全正常的特點(diǎn),使其在雜交制種中免去了“去雄”的繁瑣步驟,已成為作物雜種優(yōu)勢利用的重要途徑.隨著一些模式植物及一些物種的基因組信息的不斷完善和豐富,對細(xì)胞質(zhì)雄性不育也有了新的認(rèn)識.目前普遍認(rèn)為,細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的不育性是由于線粒體基因組重排形成嵌合基因而造成的1,對雄性不育性的研究也主要集中在嵌合基因的分離和結(jié)構(gòu)分析及轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控等方面2,3.然

5、而,關(guān)于細(xì)胞質(zhì)雄性不育形成的內(nèi)在機(jī)理仍需更進(jìn)一步的研究.蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的最終產(chǎn)物,也是基因功能的執(zhí)行者.利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),比較研究與不育相關(guān)的關(guān)鍵發(fā)育時期不育系和保持系花藥蛋白質(zhì)組的變化,可以較全面地反映與育性相關(guān)蛋白質(zhì)或多肽的表達(dá)變化特征、以及蛋白質(zhì)的修飾及互作關(guān)系,對了解雄性不育花藥敗育發(fā)生的原因及其生理生化代謝機(jī)制具有重要作用.近幾年,利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行植物雄性不育性的研究已有一些報道,Mihr 等4研究表明,甘藍(lán)型油菜雄性不育系Tournefortii 及近等基因可育系兩者在花藥的全蛋白質(zhì)及線粒體蛋白質(zhì)之間存在明顯的差異,差異蛋白可能與雄性不育有關(guān).Wen 等5對紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄

6、性不育水稻的不育系(YTA和保持系(YTB及雜交F1代的四分體時期花藥總蛋白進(jìn)行雙向凝膠電泳分析,48個差異蛋白質(zhì)點(diǎn)分別參與了代謝、蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡等重要生理過程,推測可能是導(dǎo)致花藥敗育的原因.Hochholdinger 等6通過對玉米T 型胞質(zhì)不育系和可育系線粒體蛋白質(zhì)組的比較研究發(fā)現(xiàn),由核編碼的 線粒體蛋白質(zhì)的表達(dá)存在差異,且細(xì)胞質(zhì)對編碼線生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展Prog.Biochem.Biophys.2009;36(4粒體蛋白質(zhì)的核基因表達(dá)具有調(diào)控作用,認(rèn)為這很有可能與育性表達(dá)緊密相關(guān).前述研究都顯示出蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)作為進(jìn)一步闡釋植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育機(jī)理的潛力.然而,目

7、前針對小麥細(xì)胞質(zhì)雄性不育的蛋白質(zhì)組學(xué)研究工作報道甚少.有鑒于此,本研究特以小麥花藥為材料,在建立了相應(yīng)的蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上,對花藥差異蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了分析與研究,旨在為揭示小麥細(xì)胞質(zhì)雄性不育形成的機(jī)理提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐.1材料和方法1.1材料1.1.1實(shí)驗(yàn)材料.供試小麥雄性不育系(S-1376A(S代表具有斯卑爾脫小麥細(xì)胞質(zhì)是西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省作物雜種優(yōu)勢研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,采用具有斯卑爾脫小麥(Triticum spelta L.不育細(xì)胞質(zhì)的不育系(S-8230-144A與普通小麥(T.aestivum L.栽培品種西農(nóng)1376通過多代核置換回交育成的穩(wěn)定不育系,目前回

8、交世代已在20代(BC20以上,不育性非常穩(wěn)定,綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良.其不育系和保持系多年來已成為本重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室用來進(jìn)行多種不育類型小麥雜種優(yōu)勢理論研究與實(shí)踐應(yīng)用的重要骨干親本種質(zhì)材料.不育系(S-1376A和保持系(A-1376B(A代表具有普通小麥細(xì)胞質(zhì),于2005年秋種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)場試驗(yàn)田.細(xì)胞學(xué)觀察表明,不育系(S-1376A花粉敗育的主要時期為單核期,但也有少量花粉發(fā)育至二核期發(fā)生敗育.依次,本實(shí)驗(yàn)于2006年4月中旬,先行形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞學(xué)鏡檢,分別采集(S-1376A和保持系(A-1376B小孢子發(fā)育至單核期、二核期幼穗,液氮速凍后存儲于-80冰箱備用.1.1.2儀器和試劑.

9、PROTEAN IEF Cell等電聚焦系統(tǒng)、PROTEANxi Cell垂直電泳系統(tǒng)、PDQuest8.0.1凝膠圖像分析軟件均為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品;UMAX Power Look2100XL光密度掃描儀為臺灣力捷公司產(chǎn)品; Autoflex MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀為德國Bruker公司產(chǎn)品.固相pH梯度預(yù)制IPG膠條(17cm,pH47,載體兩性電解質(zhì),礦物油購自美國Bio-Rad公司;丙烯酰胺,N,N-2甲叉雙丙烯酰胺,十二烷基磺酸鈉(SDS,二硫蘇糖醇(DTT,CHAPS,尿素,硫脲,Tris,甘氨酸,過硫酸銨(AP,碘乙酰胺, TEMED均為Sigma公司產(chǎn)品;胰蛋白

10、酶、氨基-4-羥基肉桂酸、三氟乙酸(TFA為Roche公司產(chǎn)品,其他為國產(chǎn)分析純試劑.1.2方法1.2.1花藥蛋白質(zhì)樣品制備.蛋白質(zhì)樣品提取參照Damerval等7的方法,用前在4下剝?nèi)』ㄋ?約2g,加10%PVP和少量石英砂,液氮中研磨成細(xì)粉.低溫下用TCA-丙酮法制得蛋白干粉,蛋白干粉1mg與20l蛋白質(zhì)裂解緩沖液7mol/L尿素, 2mol/L硫脲,4%CHAPS,65mmol/L DTT,2%兩性電解質(zhì)Biolyte(其中1%pH310,1%pH46的比例充分混合,4攪拌,懸浮振蕩2min,在液氮與35水浴中交替凍融3次,每融一次渦旋振蕩2min,于24下20000g離心15min.上

11、清液即為蛋白質(zhì)樣品,Bradford法8測定樣品液蛋白質(zhì)的濃度后,分裝至1.5ml離心管,-80儲存?zhèn)溆?1.2.2第一向等電聚焦電泳.主要參照Bio-Rad公司等電聚焦系統(tǒng)說明進(jìn)行,根據(jù)濃度測定結(jié)果,取1mg蛋白質(zhì)樣品加適量水化液7mol/L尿素,2mol/L 硫脲,4%CHAPS,65mmol/L DTT,0.2%兩性電解質(zhì)Biolyte(其中0.1%pH310,0.1%pH46,痕量溴酚藍(lán)至終體積為350l,充分混勻后,沿IPG聚焦盤槽緩慢均勻加入.將pH47,17cm IPG 膠條膠面朝下覆蓋在樣品上,并在膠面上覆蓋2ml 礦物油,置于PROTEAN IEF Cell型等電聚焦電泳儀上

12、,水化和聚焦在20自動進(jìn)行,以50V低電壓水化12h后,按500V1h,1000V1h,4000V 1h,8000V4h電泳后,最后在8000V恒壓下繼續(xù)進(jìn)行等電聚焦,總電壓時間積為80000Vh時結(jié)束電泳.1.2.3第二向SDS-PAGE.第一向等電聚焦結(jié)束后,將IPG膠條放于5ml膠條平衡緩沖液6mol/L 尿素,2%SDS,0.375mol/L Tris-HCl(pH8.8,20%甘油,2%DTT(現(xiàn)加中振蕩平衡15min,再轉(zhuǎn)入5ml膠條平衡緩沖液6mol/L尿素,2%SDS, 0.375mol/L Tris-HCl(pH8.8,20%甘油,2.5%碘乙酰胺(現(xiàn)加中振蕩平衡15min.

13、平衡完畢后將膠條轉(zhuǎn)移到13%SDS-PAGE凝膠上,低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠后,進(jìn)行第二向SDS-PAGE,15循環(huán)水冷卻,待溴酚藍(lán)至凝膠底部時停止電泳.凝膠染色采用膠體考馬斯亮藍(lán)染色法.1.2.4圖譜分析.采用UMAX Powerlook2100XL型432陳蕊紅等:小麥質(zhì)核互作型雄性不育系及其保持系花藥差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析2009;36(4光密度掃描儀對經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色的2-DE 凝膠進(jìn)行掃描照相,分辨率設(shè)為600dpi ;用PDQuest8.0.1軟件對圖像進(jìn)行分析,包括背景消減、斑點(diǎn)檢測、匹配、數(shù)據(jù)分析等,獲取差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn).1.2.5差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜分析及鑒定.a .考染蛋白質(zhì)點(diǎn)的膠內(nèi)

14、酶解.在2-DE 凝膠上切取差異蛋白質(zhì)點(diǎn)于1.5ml EP 管內(nèi),雙蒸水洗后,用50%乙腈和50mmol/L 碳酸氫鈉溶液反復(fù)脫色,每次5min ,至藍(lán)色褪去后,乙腈脫水真空抽干.加入含10mmol/L DTT 的25mmol/L 碳酸氫銨溶液,于56還原1h ,再用含55mmol/L 碘乙酰胺的25mmol/L 碳酸氫銨于室溫黑室中烷基化45min,依次用25mmol/L 碳酸氫銨、50%乙腈溶液和乙腈洗,乙腈脫水到膠粒完全變白為止,真空干燥后,加2025l Trypsin 酶液(Promega Sequencing Grade Modified Trypsin 1015mg/L 于25mm

15、ol/L NH 4HCO 3,pH8.0,覆蓋膠塊,等待吸脹15min 左右,調(diào)整酶液.37過夜15h 左右.酶解后的肽片段用50%乙腈(內(nèi)含0.5%TFA萃取2次,合并萃取液,冷凍干燥.b .MALDI-TOF-MS 肽質(zhì)量指紋分析.將0.75l 樣品與基質(zhì)(新鮮配制10g/L 的-氰基-4-羥基肉桂酸等體積混合,點(diǎn)于靶上,讓靶自然干燥.最后將靶裝入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析,儀器相應(yīng)的參數(shù)為反射模式,離子源加速電壓1為19.1kV ,加速電壓2為16.4kV ,N 2激光波長337nm ,離子延遲提取90ns ,真空度1.5e 006mbar ,質(zhì)譜信號單次累加200次,正離子譜測定.肽質(zhì)量指紋圖譜(

16、PMF質(zhì)量掃描范圍為7004000u .c .數(shù)據(jù)庫檢索分析.將獲得的肽指紋圖譜(PMF數(shù)據(jù)通過Mascot 搜索引擎(并用下列參數(shù)在NCBInr 數(shù)據(jù)庫中檢索蛋白質(zhì)信息:Species ,green plant ;酶,胰蛋白酶(trypsin;肽質(zhì)量模式,monoisotopic ;肽質(zhì)量允錯,100ppm ;荷電狀態(tài),1+;最大漏切位點(diǎn),1;一般認(rèn)為Sequence coverage10%,至少有4個片段匹配.2結(jié)果與分析2.1小麥花藥雙向電泳圖譜的建立及圖像分析選用pH47,17cm 的IPG 膠條,采用IEF/SDS-PAGE 雙向凝膠電泳技術(shù)對小麥細(xì)胞質(zhì)雄性不育(S-1376A 和保

17、持系(A-1376B 不同發(fā)育時期花藥總蛋白質(zhì)進(jìn)行了分離,經(jīng)考馬斯亮藍(lán)G-250染色后,獲得了分辨率和重復(fù)性均較好的2-DE 圖譜(圖1.實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次,以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠Fig.12-DE anther protein maps of the male -sterile line (S-1376A and its maintainer (A-1376B(a,cUninucleate anther stage and binucleate anther stage of (S-1376A.(b,dUninucleate anther stage and binucleate anther s

18、tage of (A-1376B.The arrows show spots analyzed by MALDI-TOF/MS.433生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展Prog.Biochem.Biophys.2009;36(4性.PDQuest 8.0.1軟件對不育系(S-1376A(單核期、二核期及保持系(A-1376B(單核期、二核期不同時期花藥的2-DE 圖譜進(jìn)行比較分析,在Local regression 模式下,Floating Ball 40背景抽提,Median 33噪聲過濾類型,點(diǎn)檢測靈敏度為39.33下,在等電點(diǎn)4.07.0,分子質(zhì)量9.0100.0ku 之間,不育系(S-1376A(

19、單核期,二核期和保持系(A-1376B(單核期,二核期的2-DE 圖譜上平均可識別623、612、608、596個清晰的蛋白質(zhì)點(diǎn),各個時期蛋白質(zhì)點(diǎn)圖譜十分相似,且蛋白質(zhì)點(diǎn)大多分布在偏酸性pH 4.56.5、分子質(zhì)量15.094.0ku 范圍內(nèi).(S-1376A 單核期與(A-1376B 單核期的雙向電泳圖譜匹配率為95%,與(S-1376A 二核期的匹配率為93%,與(A-1376B 二核期的匹配率為92%,表明這四者之間主要蛋白質(zhì)表達(dá)水平基本相同,僅有少量蛋白質(zhì)發(fā)生了變化.2.2不同時期蛋白質(zhì)譜表達(dá)差異的分析PDQuest 軟件對兩個不同時期的蛋白質(zhì)點(diǎn)在不育系和保持系中的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了分

20、析,為了獲得較準(zhǔn)確的比較結(jié)果,以所有檢測出的蛋白質(zhì)點(diǎn)的濃度總和進(jìn)行均一化處理,以消除不同凝膠間的實(shí)驗(yàn)誤差,分析結(jié)果表明,在兩個不同時期,(S-1376A 和(A-1376B 兩者之間存在有明顯的差異,包括量的差異和有無的差異.將在任意兩個2-DE 圖譜表達(dá)量度差異大于2倍點(diǎn)的差異視為量的差異,低于2倍的差異視為系統(tǒng)誤差,共獲得有無或量的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)28個(圖1箭頭所示.這28個蛋白質(zhì)點(diǎn)的相對豐度如圖2.圖3為部分差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的局部放大圖.依據(jù)其表達(dá)變化特點(diǎn)將這28個蛋白質(zhì)點(diǎn)分為5組.第一組包括點(diǎn)3,5,7,10,16,18,19,26,28等,表現(xiàn)為在不育系單核期、二核期特異表達(dá),而在保持系的

21、兩個時期均缺失,其中點(diǎn)5,10,16,18,26,28在不育系單核期的表達(dá)量大于二核期的表達(dá)量.第二組為在保持系兩個時期同時出現(xiàn),而在不育系的兩個時期均未表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn),包括點(diǎn)17,20,21,23等.第三組為點(diǎn)4,9,11,24,25是與不育系兩個時期相比,在保持系單核期,二核期表達(dá)量均大于2倍以上的點(diǎn).第四組包括點(diǎn)1,2,6,8,12,13,14,22,27等,其在不育系兩個時期表達(dá)量均比保持系兩個時期大于2倍以上的點(diǎn).第五組為15號點(diǎn),在保持系單核期及不育系兩個時期表達(dá)量均較低,而在保持系的二核期表達(dá)量急劇增加.Fig.2Histograms showing the volume cha

22、nges of 28differentially displayed spots from 2-DEThe T-ticks on the top of each bar indicate the standard error.:Uninucleate stage of (S-1376A;:Uninucleate stage of (A-1376B;:Binucleatestage of (S-1376A;:Binucleate stage of (A-1376B.434陳蕊紅等:小麥質(zhì)核互作型雄性不育系及其保持系花藥差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析2009;36(4Fig.3Enlargements of

23、some differentially expressed protein spots in Fig.1(a,cUninucleate anther stage and binucleate anther stage of (S-1376A.(b,d.Uninucleate anther stage and binucleate anther stage of (A-1376B.Spot No.Accession No.Theoretical M /p I ExperimentalM /p I Sequence coverage(%Score Protein name5gi|538138917

24、.2/6.1417.9/6.7943%82Ubiqutin-protein ligase E28gi|4036375919.6/5.6319.8/5.5991%144Putative glycine-rich protein 13gi|11849785864.65/8.0964.1/5.7933%80Long chain fatty acid CoA ligase 14gi|5072650116.99/10.8716.4/5.1348%78Hypothetical protein 15gi|1580877927.96/5.1029.3/4.8049%125Ascorbate peroxidas

25、e 16gi8/6.6956.2/6.7417%71Hypothetical protein17gi|5678376323.26/5.8223.9/5.9035%77Putative cysteine proteinase inhibitor 18gi|11848370722.78/5.1222.5/5.2149%69Unkown20gi|1199089719.73/8.821.4/6.5255%114Ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase /oxygenase small subunit24gi|13139427.4/8.8429.

26、5/5.5172%17723ku subunit of oxygen evolving system of photosystem 25gi|13210713.2/5.8415.1/5.7257%78Ribulose bisphosphate carboxylase small chain clone 512(rubico small subunit26gi|1199089319.73/9.0620.5/6.1154%82Ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase /oxygenase small subunit2.3差異表達(dá)蛋白的MALDI -TOF -MS 分

27、析及數(shù)據(jù)庫檢索將28個差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)從2-DE 膠上切下,進(jìn)行蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的脫色和膠上原位消化、酶解,酶解后的肽混合物經(jīng)MALDI-TOF-MS 分析,均獲得了肽質(zhì)量指紋圖,應(yīng)用Mascot 軟件在NCBInr 數(shù)據(jù)庫中搜索鑒定蛋白質(zhì),28個蛋白質(zhì)點(diǎn)中有12個點(diǎn)得到了陽性結(jié)果(表1,而對于其他的16個點(diǎn)未能鑒定出有意義的結(jié)果.對12個陽性結(jié)果結(jié)合雙向凝膠電泳相應(yīng)點(diǎn)的表觀等電點(diǎn)、分子質(zhì)量、匹配肽段的多少及得分進(jìn)行綜合分析,有7個蛋白質(zhì)點(diǎn)被鑒定為,泛素結(jié)合酶E2,甘氨酸富集蛋白,抗壞血酸過氧化物酶,假定半胱氨酸蛋白酶抑制劑,1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小鏈克隆512及2個功能未知的蛋白質(zhì).

28、圖4是spot 5的肽質(zhì)量指紋及匹配的肽段數(shù).Table 1Differentially -expressed proteins identified by PMF query4353討論3.1不同發(fā)育時期雄性不育系及保持系花藥蛋白質(zhì)的變化生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的存在是一個動態(tài)的過程,具有明顯的時空性和可調(diào)節(jié)性.植物同一組織在不同空間和時間內(nèi)所表達(dá)的蛋白質(zhì)都不相同,細(xì)胞質(zhì)雄性不育花藥敗育過程中所涉及的蛋白質(zhì)變化是個動態(tài)的變化過程,運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)對在不同發(fā)育時期,不育系和保持系兩種材料表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行差異比較,對了解雄性不育花藥敗育發(fā)生的原因具有重要作用.以往在其他作物雖有相關(guān)報道5,9,但多數(shù)都集中在

29、對花藥發(fā)育的某一個時期進(jìn)行差異比較分析,所得出的結(jié)果并不能全面反映在雄性不育花藥敗育過程中蛋白質(zhì)的動態(tài)變化過程.細(xì)胞學(xué)觀察表明,小麥質(zhì)核互作型雄性不育系(S-1376A花粉敗育的主要時期為單核期,但也有少量花粉發(fā)育至二核期敗育.因此,本研究對質(zhì)核互作型雄性不育系(S-1376A及保持系(A-1376B在兩個不同時期的花藥蛋白質(zhì)進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)組比較研究.為了明確小麥花藥蛋白質(zhì)組分布特點(diǎn),我們最初采用17cm,pH310的非線性膠條對小麥花藥蛋白質(zhì)進(jìn)行分離,染色后,在膠面上檢測到大約320 350個蛋白質(zhì)點(diǎn)10,但其中大部分蛋白質(zhì)集中在pH47范圍內(nèi),有的高豐度蛋白質(zhì)斑點(diǎn)出現(xiàn)重疊現(xiàn)象,未能對此區(qū)

30、域蛋白質(zhì)進(jìn)行很好的分離.為了獲得更好的分離效果,我們再改用pH47范圍的線性膠條進(jìn)行雙向電泳分離,可檢測到大約600個蛋白質(zhì)點(diǎn),大大地提高了小麥花藥蛋白質(zhì)的分辨率.表明pH47的線性膠條更適合于對小麥花藥Fig.4MALDI-TOF-MS analysis of spot5(aPeptide mass fingerprinting of protein spot5.(bMowse score and Database query result of spot5.Protein score is-10Lg P,where P is the probability that the observe

31、d match is a random event.Protein scores greater than81are significant(P0.05.蛋白的分離.選用pH47,17cm的IPG膠條,在雄性不育系(S-1376A及保持系(A-1376B兩個不同時期共獲得差異蛋白質(zhì)點(diǎn)28個,這28個差異蛋白質(zhì)點(diǎn)一方面表現(xiàn)為,在花藥發(fā)育的單核期,不育系相對于保持系出現(xiàn)了一些特異表達(dá)或表達(dá)量上調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn),同時與保持系相比也有一些蛋白質(zhì)點(diǎn)缺失,或部分蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)量下調(diào),說明在花藥敗育的關(guān)鍵時期,一些特定的蛋白質(zhì)參與了此過程,這些特異表達(dá)或上調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)可能起到一種阻遏作用,遏制了一些正?；ǚ郯l(fā)育所

32、需要蛋白質(zhì)的表達(dá),表現(xiàn)在2-DE膠上即為不育系上一些蛋白質(zhì)點(diǎn)的缺失或表達(dá)量的下調(diào).另一方面表現(xiàn)為不育系二核期的花藥蛋白質(zhì)較其單核期部分蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)量的下調(diào),說明在花粉敗育后,可能由于參與正?；ǚ郯l(fā)育的部分蛋白質(zhì)被降解或正常的代謝受阻所致.對這28個差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行PMF鑒定,初步鑒定出了7個差異表達(dá)蛋白,經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索,這些差異蛋白為泛素結(jié)合酶E2、甘氨酸富集蛋白、抗壞血酸過氧化物酶、假定半胱氨酸蛋白酶抑制劑、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小鏈克隆512及2個功能未知的蛋白質(zhì),很有可能與(S-1376A雄性不育性有關(guān).3.2差異表達(dá)蛋白的功能推測Spot5被鑒定為泛素蛋白結(jié)合酶E2(ub

33、iqutin-protein ligase E2,泛素-蛋白酶體途徑是目前已知的所有真核生物體內(nèi)具有高度選擇性的最為重要的蛋白質(zhì)降解途徑.在該過程中涉及一系列的酶參與反應(yīng),包括泛素活化酶(E1、泛素結(jié)合酶(E2和泛素蛋白結(jié)合酶(E3,該途徑是細(xì)胞內(nèi)短壽命蛋白和一些異常蛋白降解的普遍途徑,并參與細(xì)胞的多種生理活動代謝過程,在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、發(fā)育和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物衰老等方面具有重要的調(diào)控作用,對維持細(xì)胞正常的生理功能具有十分重要的意義1114.有研究表明,泛素-蛋白酶體途徑對花器官發(fā)育及花發(fā)育方面具有重要的調(diào)控作用15,16.本研究在不育材料中檢測到泛素蛋白結(jié)合酶E2的高表達(dá),由此推測可能由

34、于不育系中泛素蛋白結(jié)合酶E2的特異表達(dá),引起泛素-蛋白酶體途徑紊亂,使細(xì)胞正常代謝受阻,細(xì)胞凋亡異常,花粉發(fā)育受阻,最終導(dǎo)致不育發(fā)生.本實(shí)驗(yàn)室李紅霞等17利用SSH技術(shù)研究了具有相同細(xì)胞質(zhì)的雄性不育系及近等基因可育系中不育和可育cDNA文庫的基因表達(dá)情況,結(jié)果也表明,泛素-蛋白酶體途徑的代謝與小麥雄性不育過程細(xì)胞凋亡有關(guān),這可進(jìn)一步驗(yàn)證泛素-蛋白酶體途徑與小麥雄性不育緊密相關(guān)性.Spot8被鑒定為甘氨酸富集蛋白質(zhì)(putativeglycine-rich protein,植物中的甘氨酸富集蛋白質(zhì)(glycine-rich protein,GRP是一類結(jié)構(gòu)簡單、主要由富含甘氨酸的高度重復(fù)序列組成

35、的蛋白質(zhì),它是單子葉植物細(xì)胞壁的一種重要結(jié)構(gòu)蛋白,其表達(dá)具有組織特異性,并受發(fā)育階段和多種環(huán)境因素的調(diào)控.有研究報道,有些GRP基因是絨氈層組織特異表達(dá)的,已被廣泛用于產(chǎn)生雄性不育的轉(zhuǎn)基因植物.Mariani等18在煙草花藥的絨氈層細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一個特異表達(dá)的啟動子TA29,該啟動子為一個編碼相對分子質(zhì)量為33000的富含甘氨酸的蛋白質(zhì),將該啟動子與核糖核酸酶基因Barnase相連構(gòu)建成嵌合基因TA29-Barnase進(jìn)行轉(zhuǎn)化煙草和油菜,獲得了植物雄性不育植株.羅玉英等19的研究發(fā)現(xiàn),TA29是一個具有嚴(yán)格時空特異性的啟動子,它的特異表達(dá)的部位是絨氈層細(xì)胞,特異表達(dá)時間是花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂至小孢

36、子有絲分裂時期.康俊根等20以cDNA-AFLP技術(shù)分別對4種具有不同敗育時期特征的甘藍(lán)雄性不育材料和遺傳背景一致的可育材料進(jìn)行分析,序列分析結(jié)果表明富含甘氨酸蛋白、糖基水解酶家族基因等與花藥發(fā)育4個時期雄性育性的建成有關(guān).本研究中,甘氨酸富集蛋白質(zhì)僅在不育系中表達(dá),而在保持系中缺失,推測可能由于甘氨酸富集蛋白在絨氈層組織中的特異表達(dá),在花粉發(fā)育的特定階段,使得絨氈層組織的正常發(fā)育受到影響,致使小孢子失去營養(yǎng)來源而逐漸消退,導(dǎo)致雄性不育的發(fā)生.Spot15被鑒定為抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX,APX是一種存在于高等植物中的一種以抗壞血酸為電子供體的專一性

37、很強(qiáng)的過氧化物酶,其催化的反應(yīng)為:2AsA(抗壞血酸+H2O22MDA(單脫氫抗壞血酸+2H2O,在該反應(yīng)途徑中,底物過氧化氫(H2O2是一種活性氧,它會通過Haber-Weiss反應(yīng)生成毒性更大的活性氧(如OH,生物體內(nèi)產(chǎn)生的H2O2和O2等活性氧若得不到及時清除,就會在細(xì)胞中積累,引起細(xì)胞凋亡21.Mittler等22在病毒誘導(dǎo)煙草細(xì)胞程序化死亡(PCD的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)抗壞血酸過氧化物酶活性下降,據(jù)此他們認(rèn)為細(xì)胞清除H2O2能力下降所導(dǎo)致H2O2的積累誘發(fā)了PCD過程.Jiang等23認(rèn)為哈克尼西棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育是一種由線粒體基因突變引起的活性氧積累傷害花粉母細(xì)胞的程序性死亡,是雄性細(xì)胞

38、對活性氧積累過程的過敏反應(yīng). Li等24在水稻紅蓮型雄性不育系中的研究結(jié)果表明,在花粉發(fā)育過程中,小孢子母細(xì)胞遭受活性氧的危害,并引起了細(xì)胞的PCD,并最終導(dǎo)致花粉敗育.本研究中,我們推測,由于清除活性氧的酶促系統(tǒng)中抗壞血酸過氧化物酶在不育系中表達(dá)量的明顯下調(diào),使得其不能及時清除體內(nèi)的H2O2,致使H2O2等活性氧在花藥中大量積累,引起了花藥組織細(xì)胞的細(xì)胞凋亡,并最終導(dǎo)致了花粉的敗育.Spot17被鑒定為假定的半胱氨酸蛋白酶抑制劑(putative cysteine proteinase inhibitor,半胱氨酸蛋白酶是一類重要的蛋白酶家族,與植物細(xì)胞程序化死亡有關(guān)25,26,曾維英等9報

39、道,在大豆胞質(zhì)雄性不育系NJCMS1A中,半胱氨酸蛋白酶可能參與了細(xì)胞程序化死亡過程,并將其與大豆胞質(zhì)雄性不育系小孢子敗育緊密相關(guān)聯(lián)系.更多的證據(jù)表明,花藥組織的細(xì)胞程序化死亡與雄性不育有關(guān)27,28,花藥組織中絨粘層細(xì)胞的程序化死亡是小孢子敗育的原因之一24,29.半胱氨酸蛋白酶抑制劑是半胱氨酸蛋白酶的抑制因子,能與半胱氨酸蛋白酶活性部位結(jié)合而抑制該酶的催化活性,可以保護(hù)細(xì)胞免受不合適的內(nèi)源或外部的蛋白質(zhì)水解25,30,是植物組織中重要的一種防衛(wèi)體系.有研究證明,半胱氨酸蛋白酶抑制劑可以阻止線粒體中細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(AIF的釋放31.Solomon等25發(fā)現(xiàn),可通過內(nèi)源半胱氨酸蛋白酶抑制劑基

40、因的異位表達(dá)抑制半胱氨酸蛋白酶的活性,由此阻抑了由氧化態(tài)脅迫觸發(fā)的細(xì)胞凋亡.Zhang等32的研究發(fā)現(xiàn),在玉米S-Mo17Rf3Rf3可育系中,半胱氨酸蛋白酶抑制劑是細(xì)胞程序化死亡的抑制因子,在可育系中的上調(diào)表達(dá),可能抑制絨粘層細(xì)胞程序化死亡的進(jìn)程.鑒于半胱氨酸蛋白酶抑制劑在保持系中的高活性表達(dá)而在不育系中缺失,推測可能由于半胱氨酸蛋白酶抑制劑在不育系的缺失,使得植物的自身防衛(wèi)代謝調(diào)控紊亂,致使半胱氨酸蛋白酶的過量表達(dá),導(dǎo)致花藥組織中的絨粘層細(xì)胞的過早或延遲凋亡解體,最終引起小孢子的敗育.1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小鏈克隆512(ribulose bisphosphate carbox

41、ylase small chain clone512,是Rubisco小亞基的一個片段, Rubisco是光合作用和光呼吸的關(guān)鍵酶,參與乙醛酸和乙二酸代謝及碳固定的過程,與能量代謝有關(guān),其在不育系的兩個時期表達(dá)量明顯下調(diào),表明能量代謝可能與花藥發(fā)育緊密相關(guān).差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)16,18鑒定為假定蛋白,可能與雄性不育性有關(guān),但其功能有待于進(jìn)一步的研究,而點(diǎn)13,14,24,26由于其理論等電點(diǎn)與實(shí)際表觀等電點(diǎn)差距較大,對其并未做進(jìn)一步的研究.至于28個差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)中的其他17個點(diǎn),可能由于現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫的不完善及鑒定方法等原因未能搜索出有意義的結(jié)果,可結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜和增加數(shù)據(jù)庫等進(jìn)行進(jìn)一步鑒定,為探

42、索小麥質(zhì)核互作型雄性不育的機(jī)理提供更多線索.參考文獻(xiàn)1Hanson M R,Bentolila S.Interactions of mitochondrial and nuclear genes that affect male gametophyte development.Plant Cell,2004, 16(Suppl:S154S1692Schnable P S,Wise R P.The molecular basis of cytoplasmic male sterility and fertility restoration.Trends Plant Sci,1998,3(5:17

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