淺論磁性脂質(zhì)超聲微泡造影劑的制備及影像增強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)研究

1、淺論磁性脂質(zhì)超聲微泡造影劑的制備及影像增強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)研究         【摘要】  目的：探討自制磁性脂質(zhì)微泡超聲造影劑在體外的基本特性及體內(nèi)的影像增強(qiáng)效果，為研制既能在超聲診斷中使影像增強(qiáng)，又能對腫瘤進(jìn)行熱療的超聲造影劑提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：（1） 采用化學(xué)共沉淀法制備Fe3O4磁性納米材料，機(jī)械振蕩法制備磁性脂質(zhì)微泡。（2） 馬爾文粒徑測量儀測量磁性脂質(zhì)微泡粒徑，血球計(jì)數(shù)板測量濃度，掃描電鏡及能譜分析對其形態(tài)和成分進(jìn)行分析。（3） 將已制備的磁性脂質(zhì)微泡原溶液放入4 冰箱里儲存2周后觀察其形態(tài)和

2、粒徑的變化。（4） 大型彩超儀評價(jià)其在兔肝臟的顯像效果。（5） 分別將含有不同濃度磁性納米粒子的脂質(zhì)微泡置于頻率230 kHz、輸出電流30 A的SPG06A高頻磁感應(yīng)加熱設(shè)備平板線圈上加熱1 h，觀察其體外升溫情況。結(jié)果：此微泡平均粒徑為1 127 nm，濃度為3×109ml1。在4 冰箱中放置2周后，其形態(tài)和粒徑未發(fā)生明顯改變。經(jīng)耳緣靜脈注入兔肝臟后，肝實(shí)質(zhì)回聲可見明顯增強(qiáng)。一定濃度的磁性脂質(zhì)微泡在一定磁場作用下具有升溫恒溫的特性，溫度可恒定在4262 之間。結(jié)論：此磁性脂質(zhì)微泡造影劑粒徑小，性質(zhì)穩(wěn)定，影像增強(qiáng)效果好，在磁場作用下具有升溫恒溫能力，為今后臨床的進(jìn)一步應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)

3、依據(jù)。 【關(guān)鍵詞】  脂質(zhì)微泡磁性納米粒子影像增強(qiáng)   Abstract：Objective  To study the characteristics of selfmade magnetic lipid microbubble ultrasound contrast agent in vitro and image contrast enhancement in vivo and provide the evidence of theory and experiment for making the ultrasound microbubble pr

4、oviding image enhancement and hyperthermia to the tumor.Methods  (1) Fe3O4 magnetic nanoparticles and magnetic lipid microbubble were prepared by chemical coprecipitation technique and mechanical vibration technique.(2) The surface morphology,size distribution and concentration of the contrast

5、agent were measured by Malvern,at the same time the appearance and composition was analyzed by SEM and EDS.(3) Morphology and size of the lipid microbubble saved in refrigerator at 4  were observed after two weeks.(4) Rabbits were examined to observe the enhancement time and intensity in liver

6、using color ultrasound.(5) Thermodynamic test was used to observe temperature change of various doses of Fe3O4 magnetic lipid microbubble under alternating magnetic field(AMF).Results  The selfmade magnetic lipid microbubble were well shaped,with a mean diameter of 1127 nm and at a concentratio

7、n of 3×109ml1.The morphology and size of the lipid microbubble in refrigerator with 4 were consistent with the previous ones.The prepared Fe3O4 magnetic lipid microbubble raised the temperature and maintained it at 4262 in certain magnetic field.Conclusion  The magnetic lipid microbubble s

8、teadily and conspicuously functions as a contrast enhancer that provide dependable guarantee for clinic application in future.   Key words：lipid microbubble； magnetic nanoparticle； image contrast enhancement隨著分子生物學(xué)和超聲造影技術(shù)的不斷發(fā)展，超聲造影劑不僅可作為影像對比增強(qiáng)劑用于實(shí)質(zhì)器官的顯像，還可以作為藥物和基因的載體而起到靶向治療的作用1。本研究旨在利用納米技術(shù)

9、和傳統(tǒng)的超聲微泡制備技術(shù)相結(jié)合的方法研制出一種新型的磁性脂質(zhì)微泡超聲造影劑，并檢測其體外基本特性和體內(nèi)顯像情況，為今后實(shí)現(xiàn)將該微泡造影劑用于腫瘤的影像診斷和治療（如靶向化療、基因治療、熱療等）提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1 材料與方法1.1 試劑DPPE(二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺)、DSPC(二硬脂酰磷脂酰膽堿) (Sigma公司)，吐溫80、甘油、丙二醇、葡萄糖、FeCl2、FeCl3、氨水(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)，SF6氣體(南京特種氣體公司)。1.2 儀器機(jī)械振蕩儀（重慶影像研究所），激光粒度分析儀(MALVERN，英國)，磁力攪拌器（榮華儀器制造有限公司），掃描電鏡(JEOL JSM6360LV，日本)

10、，能譜儀（Thermo NORAN, antage，美國），彩色超聲診斷儀（PHILIPS，德國），廣口瓶。 1.3 實(shí)驗(yàn)方法1.3.1  Fe3O4磁性納米材料的制備及表征 采用化學(xué)共沉淀法2，F(xiàn)e3+Fe2+按53的比例分別加入100 ml溶液于燒瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)和磁力攪拌下滴加氨水，待溶液中出現(xiàn)沉淀物并且該沉淀物由紅褐色轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏珪r(shí)停止滴加氨水，繼續(xù)攪拌30 min后于80 水浴中熟化，棄上層廢液，用去離子水沖洗生成物后真空干燥備用。用掃描電鏡和能譜儀對其形態(tài)和成分進(jìn)行分析。1.3.2 磁性脂質(zhì)微泡的制備和性質(zhì)檢測 將準(zhǔn)確稱取的DSPC、DPPE、

11、磁性納米材料、吐溫80和葡萄糖等為主要成分的水合液按一定比例混合入3 ml的小西林瓶，用SF6氣體置換溶液上方的空氣，蓋緊蓋子后將小西林瓶放入機(jī)械振蕩器中揺振45 s，靜止數(shù)分鐘后用PBS稀釋，使用馬爾文測量儀檢測其粒徑分布，血球計(jì)數(shù)板測量其濃度，倒置顯微鏡觀察其形態(tài)特征，掃描電鏡對其形態(tài)和成分進(jìn)行鑒定。1.3.3 兔肝臟顯影實(shí)驗(yàn) 采用20%的烏拉坦5 ml·kg1經(jīng)耳緣靜脈將兔子麻醉后，經(jīng)耳緣靜脈團(tuán)注0.1 ml·kg1的濃度為3×109 ml1的磁性脂質(zhì)微泡溶液，即刻追注1ml的生理鹽水。采用Philips彩超診斷儀，以高頻探頭對兔肝進(jìn)行造影，用超聲

12、影像工作站儲存動態(tài)造影圖像。1.3.4 磁性脂質(zhì)微泡體外升溫實(shí)驗(yàn) 將磁性脂質(zhì)微泡用1×PBS溶液配制成含F(xiàn)e3O4濃度分別為1.0、1.5、2.0、2.5 g·L1的溶液，各取5 ml入25 mm平底試管中,分別置于頻率230 kHz、輸出電流30 A的SPG06A高頻磁感應(yīng)加熱設(shè)備平板線圈上加熱1 h，起始室溫20 ，試管底距高頻磁感應(yīng)加熱線圈中心0.5 cm,每隔5 min用TM 902C數(shù)字測溫儀測溫1次，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、溫度為縱坐標(biāo)繪制Fe3O4納米磁流體的升溫曲線。2 結(jié) 果2.1 Fe3O4磁性納米粒的表征掃描電鏡示Fe3O4磁性納米粒呈細(xì)顆粒狀外觀，

13、大小均一，粒徑大小為15 nm,散在分布（圖1）；表面能譜分析(圖2)示磁性納米粒樣品中只含有Fe和O兩種元素。2.2 磁性脂質(zhì)微泡造影劑的表征制備的磁性脂質(zhì)微泡光鏡下呈圓球形外觀(圖3)，外包被一層脂質(zhì)膜，內(nèi)充有透亮的SF6氣體，分散度好，馬爾文粒徑測量儀示平均粒徑為1127 nm。掃描電鏡圖(圖4)見磁性脂質(zhì)微泡近似圓球形，表面能譜分析結(jié)果(圖5)見磁性脂質(zhì)微泡中含有P、O、Fe等元素,其中P為脂質(zhì)成分，F(xiàn)e、O為磁性材料的成分，證實(shí)磁性脂質(zhì)微泡已制備成功。2.3 正常兔肝影像增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果注射磁性脂質(zhì)微泡3 s后肝血管內(nèi)出現(xiàn)造影劑充填,6 s后肝實(shí)質(zhì)回聲出現(xiàn)增強(qiáng),710 min達(dá)高峰,10

14、 min后仍可見較明顯增強(qiáng)（圖6）。2.4 體外升溫實(shí)驗(yàn)結(jié)果當(dāng)磁場強(qiáng)度一定時(shí)，磁性脂質(zhì)微泡在磁場作用下，其升溫能力與Fe3O4磁性納米粒子濃度呈正相關(guān)，濃度越大升溫能力越強(qiáng)、溫度上升越快，但具有共同的規(guī)律：在作用前30 min內(nèi)升溫迅速，3050 min升溫平緩，50 min后溫度幾乎不再上升而恒定在之間（圖7）。3 討論超聲造影劑以其增強(qiáng)實(shí)質(zhì)器官灰階顯像的特性而被廣泛應(yīng)用于臨床腫瘤的影像診斷中。不僅如此，利用脂質(zhì)微泡在超聲介導(dǎo)下產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，還可大大加強(qiáng)攜載藥物或基因的脂質(zhì)微泡的靶向釋放及基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)。       

15、;  Miller等3指出,超聲微泡作為一種人為的空化核，增加了血液里空化核的密度，降低了聲空化的閾值，加強(qiáng)了超聲空化效應(yīng)。空化效應(yīng)所產(chǎn)生的強(qiáng)大沖擊波、內(nèi)切力、微速流使臨近的毛細(xì)血管通透性增加，組織細(xì)胞膜出現(xiàn)可逆性小孔4，這就為基因的轉(zhuǎn)染和藥物的靶向釋放提供了有利條件。為了實(shí)現(xiàn)微泡造影劑的諸多應(yīng)用及潛在價(jià)值，一些學(xué)者致力于制備出安全性高、靶向性好、多功能的超聲微泡造影劑。超聲造影劑自誕生以來不斷發(fā)展，已從無穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)的氣體、蛋白質(zhì)和多糖類為外殼的空氣微泡造影劑發(fā)展到以脂質(zhì)和多聚化合物為外殼、氟碳?xì)怏w為核心的微泡造影劑。磁性微泡造影劑是將磁性納米材料和脂質(zhì)微氣泡相結(jié)合而研制出的一種新型

16、造影劑。其目的是制備出兼具影像增強(qiáng)和靶向熱療作用的微泡。本研究的特點(diǎn)是利用磁性納米材料的磁感應(yīng)加熱特性2，使制備出的磁性微泡既具有影像診斷功能，又可對腫瘤進(jìn)行靶向熱療。各項(xiàng)指標(biāo)的檢測證實(shí)此造影劑已制備成功。超聲造影劑特異性成像技術(shù)5的主要原理是利用聲波對氣體反射比對液體大近1 000倍的原理及微泡的非線性聲學(xué)效應(yīng)，通過聲衰減、聲速的改變和增強(qiáng)后散射等方式改變聲波與組織間的吸收、反射和折射等相互作用,使超聲回聲增強(qiáng),從而提高灰階成像的對比分辨率和空間分辨率。本研究制備出的磁性微泡造影劑經(jīng)兔耳緣靜脈注入兔血液系統(tǒng)，當(dāng)此造影劑到達(dá)兔肝時(shí)，可增強(qiáng)視頻強(qiáng)度和多普勒血流信號，使肝實(shí)質(zhì)影像顯著增強(qiáng)。根據(jù)超聲

17、成像原理，在超聲場下，包有磁性納米粒子的微泡聲振幅度要小于單純的脂質(zhì)微泡，產(chǎn)生的回波信號大于單純的脂質(zhì)微泡，因此包有磁性納米粒子的微泡對實(shí)質(zhì)器官的增強(qiáng)效應(yīng)要更顯著6。   本實(shí)驗(yàn)采用改良的化學(xué)共沉淀法制備Fe3O4磁性納米粒，該方法制備技術(shù)成熟，應(yīng)用范圍廣泛。在制備過程中優(yōu)化了反應(yīng)混合液中Fe3+和Fe2+的比例和反應(yīng)體系的pH值，此二者是制備出純度高、粒徑小的磁性Fe3O4納米粒的關(guān)鍵?？紤]到制備過程中溶液與空氣的接觸存在部分Fe2+氧化為Fe3+的因素，可適當(dāng)增加Fe2+的比例7。為了減少反應(yīng)過程中產(chǎn)生的氧化現(xiàn)象，提高產(chǎn)物的純度，在生產(chǎn)過程中采用了氮?dú)獗Ｗo(hù)措施。有研究表

18、明8，反應(yīng)溶液的pH值過高或過低均會影響所制備的磁性納米粒子的特性。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)渭影彼练磻?yīng)體系的pH值為9時(shí)，制備出的納米粒子效果最好。本研究所制備的納米粒子為黑色粉末狀，在磁鐵或者磁場作用下可見明顯的磁力線。在掃描電鏡下觀察呈球形外觀，散在分布。表面能譜分析發(fā)現(xiàn)此納米粒只含F(xiàn)e、O兩種元素，且此兩種元素的質(zhì)量百分比與Fe3O4中Fe、O的百分比一致。本實(shí)驗(yàn)采用機(jī)械振蕩法制備磁性脂質(zhì)微泡，此微泡成膜材料為合成磷脂，其中包裹有磁性納米粒子。研究表明，磁性納米粒子具有很好的生物相容性9，脂質(zhì)微泡成膜材料為合成磷脂，膜內(nèi)填充SF6氣體，該氣體無毒且在血循環(huán)中性質(zhì)穩(wěn)定。此微泡粒徑小于2 m，可

19、自由通過肺循環(huán)，防止肺栓塞形成。微泡性質(zhì)穩(wěn)定，在4 冰箱中放置2周后，前后對比發(fā)現(xiàn)其形態(tài)及粒徑未發(fā)生明顯改變。體外升溫實(shí)驗(yàn)顯示，在磁場強(qiáng)度一定的條件下，磁性脂質(zhì)微泡的濃度越高，其溫度上升得越快，當(dāng)溫度升到一定程度時(shí)，溫度不再隨時(shí)間而改變。這是由于微泡中磁性納米粒子吸收電磁波所產(chǎn)生的熱和散發(fā)到環(huán)境中的熱相等而使溫度保持不變。我們將一定濃度的包有磁性納米粒的脂質(zhì)微泡懸浮液放在交變磁場中作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)達(dá)到穩(wěn)定時(shí)的溫度在4262 之間（圖7），此溫度為腫瘤熱療的有效溫度。因此，我們可以利用不同濃度磁性脂質(zhì)微泡在一定磁場下的升溫恒溫來實(shí)現(xiàn)對腫瘤的熱療。隨著進(jìn)一步的研究，磁性微泡造影劑不僅可用于腫瘤的臨床診

20、斷，同時(shí)也為超聲造影劑對腫瘤進(jìn)行熱療等提供了可能性。目前，該磁性超聲微泡造影劑正處于基礎(chǔ)研究中，真正的面向臨床應(yīng)用還有很長的路要走?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1ter HAAR G R.Ultrasonic contrast agents: safety considerationsJ.Eur J Radiol,2002,41(3): 217221.2YAN S Y,ZHANG D S,GU N,et al.Therapeutic effect of Fe2O3 nanopaticles combined with magnetic fluid hyperthermia on cultured liver cancer cells and xenograft cancersJ.J Nanosci Nanotech,2005,5(8): 11851192.3MILLER M