生物醫(yī)學(xué)在體成像技術(shù)作用

1、生物醫(yī)學(xué)在體成像技術(shù)作用本文作者：蘭海云汪愛(ài)勤尹文單位：第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部第四軍醫(yī)大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室在體成像技術(shù)的發(fā)展及成像策略的不斷提高，能夠在活的生物體內(nèi)揭示細(xì)胞和分子水平的諸多細(xì)微變化，有助于在生物整體、真實(shí)的體內(nèi)環(huán)境中高時(shí)間分辨率地研究生命過(guò)程。針對(duì)某一生物過(guò)程的帶有光學(xué)標(biāo)記的報(bào)告基因己被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)的研究，近年來(lái)正被更多地用于在活的動(dòng)物模型中探究人體內(nèi)生理機(jī)能和疾病的生物學(xué)過(guò)程。利用熒光蛋白、螢光素酶基因等生物材料標(biāo)記細(xì)胞、病原體和基因，早已被證實(shí)是一種在體內(nèi)設(shè)置檢測(cè)器、體外直觀檢測(cè)的非常可行的策略1。1在體生物發(fā)光成像技術(shù)的原理通過(guò)生物技術(shù)將構(gòu)建的以螢

2、光素酶基因作為標(biāo)記基因的載體（重組原核表達(dá)質(zhì)粒、重組真核表達(dá)質(zhì)粒或重組病毒），經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染并篩選得到重組病原菌、細(xì)胞（如免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞等）或重組病毒（如腺病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等）用于轉(zhuǎn)入小動(dòng)物；或是將含螢光素酶及調(diào)控序列的載體線性化后經(jīng)顯微注射等技術(shù)穩(wěn)定整合于小動(dòng)物基因組制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物24。標(biāo)記基因的表達(dá)可通過(guò)多種調(diào)控元件進(jìn)行調(diào)控，如靶基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子等；標(biāo)記的方法因研究領(lǐng)域、研究目的和實(shí)驗(yàn)策略的不同而各異4,但最終都是在體內(nèi)組織如血液、肝臟、腦、脾、腎等靶部位因特定生物過(guò)程的發(fā)生而伴隨產(chǎn)生有酶活性的螢光素酶。在注入底物即螢光素的條件下，螢光素酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生特

3、定波長(zhǎng)的光信號(hào)，通過(guò)成像系統(tǒng)可以直觀檢測(cè)到光信號(hào)的產(chǎn)生及變化，實(shí)時(shí)反映體內(nèi)發(fā)生的生物過(guò)程，如基因的調(diào)控表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)之間的相互作用、細(xì)胞增殖與分化等。因此，在體生物發(fā)光成像技術(shù)可廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、病毒學(xué)與免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等研究領(lǐng)域58。2在體生物發(fā)光成像技術(shù)的應(yīng)用2.1標(biāo)記于腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞等，轉(zhuǎn)入體內(nèi)后進(jìn)行成像螢光素酶基因作為一種報(bào)告基因，最初應(yīng)用于體外培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)目的基因的表達(dá)研究。在體生物發(fā)光成像技術(shù)的發(fā)展，使其能夠應(yīng)用于在體組織細(xì)胞的表達(dá)研究9。螢光素酶是一類(lèi)生物發(fā)光酶，1種細(xì)胞可同時(shí)被2種具有不同底物的螢光素酶標(biāo)記。例如其一可由一組成性穩(wěn)定表達(dá)的啟動(dòng)

4、子驅(qū)動(dòng)，作為內(nèi)參，反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的變化；另一螢光素酶由要研究的組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，其發(fā)光信號(hào)的變化，在消除細(xì)胞數(shù)量變化的影響后就可反映特定的啟動(dòng)子在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)活性1011。2.1.1腫瘤及抗腫瘤研究在體生物發(fā)光成像技術(shù)可直接實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)各種癌癥模型中腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并可對(duì)癌癥治療中癌細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)和評(píng)估，能夠無(wú)創(chuàng)傷地定量檢測(cè)小鼠整體的原位瘤、轉(zhuǎn)移瘤及自發(fā)瘤。Klerk等12研究證實(shí)了利用此技術(shù)測(cè)量腫瘤負(fù)荷具有很高的可靠性。Minn等13應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行了乳腺癌肺轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的研究，他們構(gòu)建能夠表達(dá)熒光蛋白、螢光素酶的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染己獲得的不同亞群腫瘤細(xì)胞，先通過(guò)熒光激活細(xì)

5、胞分選術(shù)篩選同一亞群內(nèi)具有相同轉(zhuǎn)染效果（穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白即熒光蛋白和螢光素酶，且水平一致）的細(xì)胞，并尾靜脈注射免疫缺陷小鼠，通過(guò)檢測(cè)生物發(fā)光的部位和大小，評(píng)價(jià)不同亞群腫瘤細(xì)胞向肺部位的轉(zhuǎn)移情況及其轉(zhuǎn)移能力，再通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)各基因的表達(dá)差異來(lái)分析肺轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。Gupta等1516又用相似的方法來(lái)研究乳腺癌腦轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及乳腺癌肺轉(zhuǎn)移過(guò)程中分化基因介導(dǎo)的腫瘤再起始，結(jié)果再次顯示了生物發(fā)光成像技術(shù)應(yīng)用于腫瘤及癌轉(zhuǎn)移機(jī)理研究領(lǐng)域的優(yōu)越性。2.1.2抗腫瘤免疫及腫瘤細(xì)胞疫苗的研究用帶有生物發(fā)光標(biāo)記基因的小鼠淋巴細(xì)胞或基因修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗，可以檢測(cè)放射及化學(xué)藥物治療的效果，并可尋找在腫瘤骨髓轉(zhuǎn)移及抗腫

6、瘤免疫治療中復(fù)雜的細(xì)胞機(jī)制。Cayeux等17用螢光素酶基因標(biāo)記基因修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗來(lái)免疫小鼠，而用另一種底物不同于前者的5,6-carboxy-succinimidyl-fluorescein標(biāo)記該小鼠內(nèi)一種與腫瘤相關(guān)的免疫細(xì)胞，通過(guò)2種不同的標(biāo)記研究了基因修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗免疫小鼠后抗原遞呈、免疫細(xì)胞之間的相互作用及不同免疫細(xì)胞在體內(nèi)免疫過(guò)程中的作用。2.1.3藥物促腫瘤細(xì)胞凋亡的研究當(dāng)螢光素酶與抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生的融合蛋白無(wú)螢光素酶活性,細(xì)胞不能發(fā)光，而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，活化的caspase-3在特異識(shí)別位點(diǎn)切去抑制多肽，螢光素酶活性得到恢復(fù)，由此可用于觀

7、察活體動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞凋亡相關(guān)事件。細(xì)胞凋亡時(shí)被激活的caspase-3/7與DEVD氨基螢光素（aminoluciferin）特異結(jié)合而被酶解為氨基螢光素，它可被螢光素酶識(shí)別而產(chǎn)生生物發(fā)光信號(hào)。Liu、Hickson等18一19利用這一現(xiàn)象設(shè)計(jì)的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法均能夠以極低的DEVD一氨基螢光素量獲得較強(qiáng)的發(fā)光強(qiáng)度，因而這一方法可用于評(píng)價(jià)TNFa（a腫瘤壞死因子）、FasL>TRAIL（TNF相關(guān)促凋亡配體）等因素針對(duì)腫瘤的治療效果。2.1.4胚胎干細(xì)胞及再生醫(yī)學(xué)的研究胚胎干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域極具應(yīng)用前景，然而注入活機(jī)體的胚胎干細(xì)胞及其分化細(xì)胞尚存在顯著的細(xì)胞死亡、畸胎瘤的形成、宿主免疫

8、排斥反應(yīng)等障礙。應(yīng)用在體生物發(fā)光成像技術(shù)，可對(duì)胚胎干細(xì)胞本身及其在注入機(jī)體后的存活、增殖、分化等生物事件的發(fā)生機(jī)理進(jìn)行深入研究，從而使上述諸多問(wèn)題得以解決20。2.2標(biāo)記病原微生物，用于研究感染致病機(jī)制、轉(zhuǎn)移途徑及宿主免疫反應(yīng)等在感染性疾病的研究中，在體生物發(fā)光成像技術(shù)的應(yīng)用，不僅可以提供疾病進(jìn)程中觀測(cè)病原體在動(dòng)物體內(nèi)的寄居部位、數(shù)量變化及對(duì)外界因素的反應(yīng)等實(shí)時(shí)變化信息，而且更有助于揭示感染體內(nèi)病原體逃逸宿主防御的機(jī)制21。對(duì)病原體感染過(guò)程非侵入性的檢測(cè)能夠?qū)膊∵M(jìn)程實(shí)時(shí)地提供新的信息，且有可能發(fā)現(xiàn)新的感染位點(diǎn)22。Lucker等2326以螢光素酶基因標(biāo)記HSV-1（單純皰疹病毒）并分別侵染團(tuán)類(lèi)干擾素受體缺失、團(tuán)類(lèi)干擾素受體缺失、團(tuán)和團(tuán)類(lèi)干擾素受體均缺失的小鼠，可觀察到