秋季細胞生物學章王曉娟

1、細 胞 生 物 學（2011年秋季課程）主講：王曉娟 學習本課程目的和任務· 了解和掌握細胞的結構、功能、生活史以及各種生命活動的本質(zhì)和規(guī)律.· 學會從細胞的整體水平、亞細胞水平和分子水平三個方面來分析有關生命現(xiàn)象，能夠以動態(tài)的觀點考察細胞和細胞器的結構與功能.· 以此進一步了解細胞的基本生命活動規(guī)律，以實現(xiàn)對其進行控制和利用.學習的基本要求· 能夠運用分析與綜合的方法將細胞結構與功能的關系進行闡述，為后序相關專業(yè)基礎課的學習奠定基礎.第一章 緒 論第一節(jié) 細胞生物學發(fā)展簡史一、細胞的發(fā)現(xiàn)l 1604年 荷蘭眼鏡商詹森發(fā)明第一臺顯微鏡.l 1665年l

2、英國的物理學家羅伯特虎克發(fā)現(xiàn)植物細胞, 稱為“cella”（是死的細胞壁）.l 1674年l 荷蘭布商列文虎克為了檢查布的質(zhì)量, 親自磨制透鏡, 裝配了高倍顯微鏡(300倍左右), 并觀察到了血細胞、池塘水滴中的原生動物、人類和哺乳類動物的精子, 這是人類第一次觀察到完整的活細胞.二、細胞學說的建立及其意義l 1838年 德國植物學家施來登提出：盡管植物的不同組織在結構上有著很大的差異，但是植物是由細胞構成的, 植物的胚是由單個細胞產(chǎn)生的.l 1839年 德國動物學家施旺提出了細胞學說的兩條最重要的基本原理：1）地球上的生物都是由細胞構成的；2）所有的生活細胞在結構上都是類似的.l 1855年

3、 德國醫(yī)生和病理學家魏爾肖補充了細胞學說的第三條原理：所有的細胞都是來自于已有細胞的分裂，即細胞來自于細胞.一切植物、動物都是由細胞組成的，細胞是一切動植物的基本單位. 細胞學說 細胞學說的重要補充 新細胞在老細胞的核中產(chǎn)生,由非細胞物質(zhì)產(chǎn)生新細胞,并通過老細胞崩解而完成（一切細胞來自細胞）.細胞學說的主要內(nèi)容v地球上所有生物都是由細胞構成的v細胞是生物形態(tài)結構和功能活動的基本單位v所有的生活細胞在結構上都是類似的v細胞來自于細胞細胞學說的意義v細胞學說的創(chuàng)立大大推進了人類對生命自然界的認識, 論證了生物界的統(tǒng)一性和共同起源, 有力地促進了生命科學的進步.v恩格斯對細胞學說給予極高的評價, 把

4、它與進化論和能量守恒定律并列為19世紀的三大發(fā)明.三、細胞學的經(jīng)典時期原生質(zhì)理論的提出l 1840年普金耶(Pukinje)在動物中、1846年馮莫耳(von Mohl)在植物中分別看到了“肉樣質(zhì)”的物質(zhì),并將其命名為“原生質(zhì)”(protoplasm).l 原生質(zhì)理論n 有機體的組織單位是一小團原生質(zhì), 種物質(zhì)在一般有機體中是相似的.細胞分裂的研究v雷馬克（ Remak, 1841）在觀察雞胚血細胞時發(fā)現(xiàn)了細胞的直接分裂v費勒明（Flemming）在動物, 施特拉斯布格（Strasburger）在植物中發(fā)現(xiàn)間接分裂.v1875年赫特維希（O · Hertwig）發(fā)現(xiàn)受精后卵中兩親本核

5、的合并；1877年施特拉斯布格（Strasburger）在植物中也發(fā)現(xiàn)同樣現(xiàn)象.v1898年納互興（Nawaschin）和1899年吉格納特（Guignard）先后發(fā)現(xiàn)被子植物的“雙受精作用”.v1883年范.貝內(nèi)登（Van beneden）和1886年施特拉斯布格（Strasburger）分別在動物和植物中發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂現(xiàn)象.重要細胞器的發(fā)現(xiàn) 電子顯微鏡的發(fā)明和應用把細胞學帶入新的發(fā)展時期，觀察到各種細胞器: Ø中心體 范.貝內(nèi)登（Van beneden） 博費里（Boveri）Ø染色體 1888年沃爾德耶（Waldyer）Ø線粒體 1894年阿爾特曼（Altma

6、nn） 1897年本達（Banda）Ø高爾基體 1898年高爾基（Golgi）四、實驗細胞學時期細胞學與實驗胚胎學階段（1887-1900）v赫特維希兄弟（O.和H. Hertwig, 1887）等以海膽、蛔蟲的卵作為材料，研究它們在外界條件影響下，剛受精的卵，雌雄原核是否能合并，去掉細胞核以后的卵是否能繼續(xù)發(fā)育？v也有人用物理或化學的方法刺激沒有受精的卵也能使之發(fā)育成為人工的孤雌生殖.細胞遺傳學階段（1900-1926）v1902-1903年博韋里（T. Boveri）和薩頓（W. S. Sutton）提出了“染色體遺傳理論”.v1910年摩爾根以果蠅為材料，研究它的遺傳和變異，為

7、細胞遺傳學的發(fā)展奠定了基礎.細胞生理學的研究v1909年Harrison和Carrel創(chuàng)立了組織培養(yǎng)技術，為研究細胞生理學開辟了一條重要途徑.v本斯萊等（Bensley和Hoerr, 1934）和克勞德（Claude, 1943）用快速離心機將細胞內(nèi)的線粒體分離出來后，對這些細胞器的作用和化學組成的研究才有很大的進展.細胞生理學的主要內(nèi)容研究細胞對周圍環(huán)境的反應細胞生長與繁殖的機制細胞從環(huán)境中攝取營養(yǎng)的能力機體代謝功能與其復制方法, 細胞的興奮性、收縮性、分泌和細胞活動的其他表現(xiàn)機制生物膜的主動運輸和能量傳遞與生物電等.細胞化學v1924年孚爾根等（Feulgen和Rossenbeck）首創(chuàng)了

8、孚爾根核染色反應，以后就專門用來測定脫氧核糖核酸（DNA）.v1940年布勒歇（Brachet, 1940）用昂納（Unna）染色液來測定細胞中的核糖核酸（RNA）.v卡斯柏爾森（Caspersson, 1936, 1940）用紫外顯微分光光度法測定DNA在細胞中的含量.v顯微分光光度計v流式分光光度檢測技術v放射自顯影v分子定位雜交v免疫熒光v免疫膠體金v激光共焦點掃描顯微鏡技術五、分子細胞生物學時期（1953-現(xiàn)在）電鏡時代的細胞學v上世紀60年代，隨著電鏡技術和固定技術的改進，顯示出細胞質(zhì)基質(zhì)中微管、微絲和中等纖維的存在.v上世紀70年代，使用高壓電鏡技術，顯示出細胞的立體結構微梁系統(tǒng)，

9、認識到“細胞骨架”.分子生物學的興起v 分子生物學的新成就、新概念、新技術滲入細胞學各個領域v 一個基因一個酶（1941） v 轉(zhuǎn)化作用的證明（1944）v DNA含量恒定理論（1948） v DNA雙螺旋模型（1953）v DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)（1956） v 半保留復制（1958）v 中心法則（1958） v 氨基酸密碼的確定（1961）v 操縱子學說（1961）細胞生物學v 從分子水平、亞細胞水平、細胞整體水平來研究細胞的各種生命活動，如生長、發(fā)育、遺傳、變異、代謝、免疫、起源與進化.六、細胞生物學學科的形成與發(fā)展v 細胞生物學是生物學的一個分支學科，與生物學許多其它分支學科相聯(lián)系, 并是

10、這些學科的基礎.v 細胞生物學是生命科學研究的基礎，屬于現(xiàn)代生物學教育的中心.v 生物科學的許多基本問題必須在細胞中謀求解決.v 細胞生物學的基礎學科v 細胞生物學的分支細胞生物學的基礎學科v 物理學v 化學v 生物化學v 生物物理學v 生物數(shù)學v 以細胞生物學為基礎的學科l 植物學l 動物學l 形態(tài)學l 解剖學l 分類學l 生理學l 組織學l 胚胎學l 遺傳學l 免疫學l 分子生物學l 細胞生物學的分支v 細胞形態(tài)學v 細胞生理學v 細胞遺傳學v 細胞化學v 分子細胞學v 細胞生態(tài)學v 細胞病理學v 細胞能力學v 細胞動力學v 第二節(jié) 研究內(nèi)容與現(xiàn)狀主要研究內(nèi)容 v細胞核、染色體以及基因表達

11、的研究l 研究染色體結構動態(tài)變化與基因表達及其調(diào)控的關系，它是目前細胞生物學、遺傳學與發(fā)育生物學在細胞水平與分子水平相結合的最活躍的熱門課題.v生物膜與細胞器的研究l 生物膜的研究主要是膜的結構模型與物質(zhì)的跨膜運輸機制.v細胞骨架體系的研究l 細胞骨架在維持細胞形態(tài)與保持細胞內(nèi)部結構的合理布局中起主要作用.l 細胞骨架與細胞內(nèi)大分子的運輸、細胞信息的傳遞、基因表達等密切相關.v細胞增殖及其調(diào)控l 從環(huán)境中與有機體中尋找控制細胞增殖的因子，以及闡明它們的作用機制.l 尋找控制細胞增殖的關鍵性基因，并通過調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物來控制細胞的增殖.l 細胞的癌基因與抑癌基因及其表達產(chǎn)物均與細胞增殖有關.v細胞分

12、化及其調(diào)控l 細胞分化的研究已經(jīng)越來越顯示出其重要性，也是細胞生物學、發(fā)育生物學與遺傳學的重要匯合點.l 多數(shù)細胞生物學家認為腫瘤是不分化與去分化的結果，人們在考慮通過啟動分化基因的表達來抑制癌基因的表達.v細胞的衰老與凋亡l 人們力圖尋找細胞中的“衰老基因”及其信號轉(zhuǎn)導.l 細胞凋亡是近年來生命科學中發(fā)展起來的重要的新興領域之一.   v細胞的起源與進化l 分子生物學方法引入生物進化的研究，為細胞進化和細胞器進化的研究增添了新的內(nèi)容. v細胞工程 三大基本問題v細胞內(nèi)的基因組是如何在時間與空間上有序表達的？v基因表達的產(chǎn)物主要是結構蛋白與核酸、脂質(zhì)、多糖及其復合物，它們?nèi)?/p>

13、何逐級裝配成能行使生命活動的基本結構體系及各種細胞器？v基因表達的產(chǎn)物主要是大量活性因子與信號分子，它們?nèi)绾握{(diào)節(jié)細胞最重要的生命活動過程的？當前主要趨勢與重點領域 v染色體DNA與蛋白質(zhì)相互作用關系-主要是非組蛋白對基因組的作用v細胞增殖、分化、凋亡的相互關系及其調(diào)控v細胞信號轉(zhuǎn)導的研究  v細胞結構體系的組裝第二章 細胞基本知識概要第一節(jié) 細胞的基本概念一、細胞的化學組成1.1 細胞的元素組成Ø 水：約占細胞總質(zhì)量的70-90，是一切生命活動的基質(zhì)（溶劑）Ø 大量元素：碳、氫、氧、氮、磷、硫、鉀、鎂、鈣、鐵等Ø 微量元素：鋅、錳、鈉、氯、鉬、硒、鈷、銅

14、、鎢、鎳、硼等Ø 不同生物的細胞，其元素組成不同Ø 同種生物的不同生長期，元素組成不同Ø 元素含量有時能夠反映生物生活的生境特征1.2 細胞的物質(zhì)組成Ø 無機物質(zhì)：小分子的無機物質(zhì)和無機離子，包括水、無機鹽、各種離子等Ø 有機物質(zhì)：多糖、脂類、核酸、蛋白質(zhì)、維生素等二、組成細胞的主要器官與結構2.1 細胞壁Ø 真核生物的細胞壁主要由纖維素和幾丁質(zhì)構成，另外還含有少量的其它填充物質(zhì)。如小分子的糖、蛋白質(zhì)和脂類。Ø 真菌（包括酵母菌、絲狀真菌等）：主要成分是多糖類物質(zhì)，如葡聚糖。Ø 藻類：由纖維素構成。2.2 細胞質(zhì)膜

15、Ø 均為雙層磷脂，蛋白質(zhì)鑲嵌其間。但含有固醇類物質(zhì)以增加韌性。Ø 質(zhì)膜對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收方式有胞吞和胞飲作用Ø 具有細胞識別受體的糖脂類物質(zhì)2.3 細胞質(zhì)（cytoplasm）Ø 位于細胞膜和細胞核之間，包括：細胞基質(zhì)、細胞骨架和細胞器三部分。 細胞基質(zhì)Ø 細胞基質(zhì)：溶膠部分（液體部分），內(nèi)含蛋白質(zhì)（主要是酶）、代謝產(chǎn)物、內(nèi)含物等，是細胞代謝活動的基地。 細胞骨架Ø 細胞骨架：由維管、肌動蛋白絲和中間絲構成的支架。是細胞維持正常形態(tài)的主要支持物。此外，還有運輸功能。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum）Ø 內(nèi)質(zhì)

16、網(wǎng)指細胞中由脂質(zhì)雙分子構成的一個與細胞基質(zhì)相隔離、但彼此相連的囊腔和維管系統(tǒng)Ø 合成和運輸?shù)鞍踪|(zhì)、脂類代謝產(chǎn)物和鈣代謝產(chǎn)物等。 核糖體（ribosomes）Ø 存在于各類細胞中的無膜包裹的顆粒狀細胞器。Ø 主要功能是合成蛋白質(zhì) 葉綠體（chloroplast）Ø 綠色藻類及高等植物體內(nèi)存在的一類能把光能轉(zhuǎn)化為化學能的綠色顆粒狀細胞器。Ø 合成光合產(chǎn)物。 線粒體（mitochondria）Ø 是生物體內(nèi)進行氧化磷酸化反應的重要細胞器Ø 將有機物氧化分解，提供能量。 高爾基體（Golgi body)Ø 是細胞內(nèi)大分子運

17、輸?shù)囊粋€樞紐，對大分子物質(zhì)進行組裝、修飾和運輸。 微體、溶酶體和液泡Ø 微體是一種單層膜包裹的細胞器，內(nèi)含生化反應的酶類蛋白。Ø 溶酶體是內(nèi)含消化酶類蛋白的細胞器。Ø 液泡：生物體調(diào)節(jié)水份平衡的一類細胞器2.4 細胞核（nucleus）Ø 細胞核是細胞內(nèi)遺傳信息（DNA）儲存、復制和轉(zhuǎn)錄的主要場所。包括核膜、染色質(zhì)和核仁等。2.5 鞭毛和纖毛（cilia）Ø 真核生物具有鞭毛或纖毛，是由蛋白質(zhì)組成的維管構成，為“92”形式。三、細胞是生命活動的基本單位3.1 一切有機體都是由細胞構成，細胞是構成有機體的基本單位.3.2 細胞具有獨立的、有序的自

18、控代謝體系，細胞是代謝與功能的基本單位.3.3 細胞是有機體生長與發(fā)育的基本單位.3.4 細胞是遺傳的基本單位，細胞具有遺傳的全能性.3.5 沒有細胞就沒有完整的生命.四、細胞的其它基本知識概要4.1 細胞的基本結構體系l 生物膜系統(tǒng)l 生物膜系統(tǒng)構建了各種獨立的細胞器l 生物膜的厚度均在810 nm范圍l 生物膜是控制物質(zhì)運輸、合成、裝配、修飾等功能的場所l 生物膜系統(tǒng)將細胞內(nèi)環(huán)境分成不同的區(qū)域，分別執(zhí)行不同的功能l 遺傳信息表達結構系統(tǒng)l DNARNAPr 組成的信息表達系統(tǒng)構成生命活動的基礎l 細胞骨架系統(tǒng) l 由一系列特異的蛋白質(zhì)裝配形成的網(wǎng)架系統(tǒng)，與維持細胞形態(tài)、分裂、物質(zhì)運輸?shù)让芮?/p>

19、相關4.2 細胞的大小及其規(guī)律l 細胞體積的守恒定律4.3 細胞形態(tài)與功能的協(xié)調(diào)性Ø 長期的進化，使不同的細胞適應于其功能的需求五、原核細胞與真核細胞的比較第三章 細胞生物學研究方法一、光學顯微鏡技術1.1 光學顯微鏡的演變歷程光學顯微鏡從其誕生之日起至今： 結構由簡陋向精致發(fā)展 種類由單一向多樣化、專業(yè)化轉(zhuǎn)變 應用領域日趨廣泛1.2 光學顯微鏡的組成 光學放大系統(tǒng) 目鏡 物鏡 照明系統(tǒng) 光源 折光鏡 聚光鏡 機械和支架系統(tǒng)光學顯微鏡的性能參數(shù) 分辨率：區(qū)分開兩個質(zhì)點間的最小距離 放大倍數(shù)：人眼的分辯力/顯微鏡的分辯力熒光顯微鏡技術l Fluorescence microscopyl

20、 光鏡水平對特異蛋白質(zhì)等生物大分子定性定位的最有力的工具 免疫熒光技術 熒光素直接標記技術激光共焦點掃描顯微鏡技術Ø Laser scanning confocal microscopy（LCSM)Ø 在研究亞細胞結構和組分等方面的應用越來越廣泛 共焦點是指物鏡和聚光鏡同時聚焦到同一個小點，即它們互相共焦點LCSM 的工作原理Ø 系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個平面內(nèi)Ø 調(diào)焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像。Ø 這些圖像信息都儲于計算機內(nèi)，通過計算機分析和模擬，就能顯示細胞樣品的立體結構。相差顯微鏡技術Ø Phase

21、-contrast microscope（PCM） 相差顯微鏡的樣品不需染色，可以觀察活細胞，甚至研究細胞核、線粒體等的動態(tài)。 PZernike于1932年發(fā)明，并因此獲1953年諾貝爾物理獎 相差顯微鏡的原理Ø 把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，使各種結構變得清晰可見。 光線透過標本后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，同時被延遲了1/4（波長），如果再增加或減少1/4，則光程差變?yōu)?/2，兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或減下，提高反差。Ø 環(huán)形光闌（annular  diaphragm） 位于光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線

22、形成空心光錐，焦聚到標本上。Ø 相位板（annular phaseplate）在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4。微分干涉顯微鏡技術Ø Differential interference contrast microscope （DIC顯微鏡） 又稱Nomarski相差顯微鏡（Nomarki contrast microscope），其優(yōu)點是能顯示結構的三維立體投影影像。 與相差顯微鏡相比，其標本可略厚一點，折射率差別更大，故影像的立體感更強。 適于研究活細胞中較大的細胞器Ø 四個特殊的光學組件 偏振器（polarizer）l 裝在

23、聚光系統(tǒng)的前面，使光線發(fā)生線性偏振。 DIC棱鏡l 石英Wollaston棱鏡。可將一束光分解成偏振方向不同的兩束光（x和y），二者成一小夾角。聚光器將兩束光調(diào)整成與顯微鏡光軸平行的方向。最初兩束光相位一致，在穿過標本相鄰的區(qū)域后，由于標本的厚度和折射率不同，引起了兩束光發(fā)生了光程差。 DIC滑行器l 石英Wollaston棱鏡。它把兩束光波合并成一束。這時兩束光的偏振面（x和y）仍然存在。 檢偏器（analyzer）l 在光束形成目鏡DIC影像之前，檢偏器與偏光器的方向成直角。檢偏器將兩束垂直的光波組合成具有相同偏振面的兩束光，從而使二者發(fā)生干涉l x和y波的光程差決定著透光的多少。光程差值

24、為0時，沒有光穿過檢偏器；光程差值等于波長一半時，穿過的光達到最大值。于是在灰色的背景上，標本結構呈現(xiàn)出亮暗差。Ø DIC顯微鏡使細胞的結構，特別是一些較大的細胞器，如核、線粒體等，立體感特別強，適合于顯微操作。Ø 目前像基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基因等的顯微操作常在這種顯微鏡下進行。倒置顯微鏡Ø 組成和普通顯微鏡一樣，只是物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細胞，具有相差物鏡。 1.3 當代顯微鏡的發(fā)展趨勢Ø 采用組合方式，集普通光鏡加相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體。Ø 自動化與電子化二、電子顯微鏡&

25、#216; 電子顯微鏡的高分辯率 電子束光源，波長一般小于0.1nm 分辨率可達0.2nmØ 有效放大倍數(shù) 0.2mm/0.2nm106Ø 分辨本領 電鏡處于最佳狀態(tài)下的分辨率電子顯微鏡的基本構造l 電子束照明系統(tǒng) 電子槍 聚光鏡l 成像系統(tǒng) 物鏡 中間鏡 投影鏡l 真空系統(tǒng)l 記錄系統(tǒng)主要電鏡制樣技術介紹Ø 超薄切片（ultrathin section）技術 固定l 鋨酸（OsO4）和戊二醛 包埋l 環(huán)氧樹脂 切片l 切片厚度2050 nm 染色l 重金屬鹽染色Ø 負染色（negative staining）技術Ø 用重金屬鹽（如磷鎢酸、醋酸

26、雙氧鈾）對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進行染色；吸去染料，樣品干燥后，樣品凹陷處鋪了一薄層重金屬鹽，而凸的出地方則沒有染料沉積，從而出現(xiàn)負染效果。 Ø 冷凍斷裂或冷凍蝕刻（freeze etching）技術Ø 蝕刻（etching）是標本置于-100C的干冰或-196C的液氮中，進行冰凍。然后用冷刀驟然將標本斷開，升溫后，冰在真空條件下迅即升華，暴露出斷面結構，稱為蝕刻。Ø 蝕刻后，向斷面以45度角噴涂一層蒸汽鉑，再以90度角噴涂一層碳，加強反差和強度。Ø 然后用次氯酸鈉溶液消化樣品，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復膜（replica）。復膜顯示出了標本蝕刻面的形態(tài)

27、，在電鏡下得到的影像即代表標本中細胞斷裂面處的結構。Ø 掃描電鏡（scanning electron microscope，SME）掃描電鏡的工作原理Ø Scanning Electron MicroscopeØ 用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子。Ø 次級電子的多少與電子束入射角有關，也就是說與樣品的表面結構有關。Ø 次級電子由探測體收集，并在那里被閃爍器轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘枴?#216; 經(jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘杹砜刂茻晒馄辽想娮邮膹姸?，顯示出與電子束同步的掃描圖像。Ø 圖像為立體形象，反映了標本的表面結構。&

28、#216; 為了使標本表面發(fā)射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。SEM的分辨率和放大倍數(shù)Ø 分辨力為610nmØ 人眼能夠區(qū)別熒光屏上兩個相距0.2mm的光點Ø 則掃描電鏡的最大有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X 掃描隧道電子顯微鏡l Scanning tunneling microscope，STMl 具有原子尺度的高分辨率 測分辨率為0.1-0.2 nm 縱分辨率可達0.001 nml 可以在真空、大氣、液體（接近于生理環(huán)境的離子強度）等多種條件下工作l 非破壞性測量l 應用STM直接

29、觀察到DNA，RNA和蛋白質(zhì)等生物大分子及生物膜、病毒等的結構掃描隧道電子顯微鏡的工作原理l 利用量子理論中的隧道效應 將原子線度的極細探針和被研究物質(zhì)的表面作為兩個電極，當樣品與針尖的距離非常接近時（通常小于1nm），在外加電場的作用下，電子會穿過兩個電極之間的勢壘流向另一電極 。這種現(xiàn)象即是隧道效應。掃描隧道電子顯微鏡的優(yōu)點Ø STM 對樣品表面進行無損探測，避免了使樣品發(fā)生變化，也無需使樣品受破壞性的高能輻射作用。Ø STM 能夠輕而易舉地克服“光的衍射現(xiàn)象”造成的限制，可獲得原子級的高分辨率。 任何借助透鏡來對光或其它輻射進行聚焦的顯微鏡都不可避免的受到一條根本限制

30、：光的衍射現(xiàn)象。由于光的衍射，尺寸小于光波長一半的細節(jié)在顯微鏡下將變得模糊。STM與EM、FIM的各項性能指標比較三、細胞組分的分析方法3.1 用超速離心技術分離細胞器與生物大分子及其復合物1）差速離心Ø Differential centrifugationØ 在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細胞和細胞器。Ø 細胞器沉降的順序：核、線粒體、溶酶體、過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、核糖體 沉降系數(shù)的概念Ø 沉降系數(shù)（s）是測量某一種物質(zhì)在離心力作用時的沉降速度。以漂浮單位S來表示。每一個漂浮單位為1×10-13秒沉降系

31、數(shù)，如果某一個蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)（s）為1×10-11秒，則為100個漂浮單位，即100S。Ø 沉降系數(shù)不是簡單的相加，而是由顆粒的形狀來決定的。因為在離心機里旋轉(zhuǎn)時，形狀影響了沉降的速度。2）密度梯度離心Ø 用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力的作用使細胞分層、分離的技術密度梯度的配置Ø 介質(zhì)特性的要求： 能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高 pH中性或易調(diào)整為中性 濃度大時滲透壓不大 對細胞無毒 Ø 常用的介質(zhì)為氯化銫、蔗糖和多聚蔗糖密度梯度離心的分類a）速度沉降Ø v

32、elocity sedimentation 主要用于分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。 采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應小于被分離生物顆粒的最小密度。b）等密度沉降平衡Ø isopycnic sedimentation 細胞或細胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和足夠長時間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的細胞或細胞器分離。 適用于分離密度不等的顆粒。 介質(zhì)的最高密度應大于被分離組分的最大密度，而且介質(zhì)的梯度要求較高的陡度，不能太平緩。3.2 細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖類與脂質(zhì)的顯示方法 為了測定細胞內(nèi)所含有的蛋白質(zhì)、核酸、多糖和脂

33、類在細胞內(nèi)的分布和含量，而采用一些顯色劑與待測物質(zhì)之間的特異性反應的研究方法1）核酸的顯示方法l 孚爾根（Feulgen）反應 Feulgen和Rossenbeck于1924年發(fā)明 將切片先經(jīng)稀鹽酸處理后，使細胞內(nèi)DNA水解，打開DNA分子中脫氧核糖核酸和嘌呤堿之間的連接鍵，使其釋放出醛基，再用Schiff試劑處理，形成紫紅色反應產(chǎn)物。l 甲基綠派若寧反應 可同時顯示細胞內(nèi)的DNA和RNA 甲基綠與細胞核中的DNA結合呈藍綠色 派若寧與核仁及胞質(zhì)內(nèi)的RNA結合呈紅色2）酶的顯示方法l 酶的顯示法是通過顯示酶的活性來表明酶的存在，而不是酶的本身。l 將具有酶活性的組織放入含有一定底物的溶液中孵育

34、，底物經(jīng)酶的作用形成初級反應產(chǎn)物，它再與某種捕捉劑相反應,形成顯微鏡下可視性沉淀,即最終反應產(chǎn)物。Ø 酸性磷酸酶 將切片放入含有酶底物（常用-甘油磷酸鈉）的溶液（pH5.0）中孵育，底物經(jīng)酶的作用，水解并釋放出磷酸； 用捕捉劑硝酸鉛與磷酸反應，形成微細的磷酸鉛沉淀，此時，可在電鏡下檢出； 再用硫化銨處理時，磷酸鉛被置換成硫化鉛沉淀，可在光鏡下見到。Ø 堿性磷酸酶 格莫瑞（Gomori）方法檢測3）糖類的顯示方法Ø 過碘酸-席夫反應（periodic acid Schiff-PAS） 常用于顯示細胞、組織內(nèi)的多糖和蛋白多糖的方法 基本原理l 糖被強氧化劑過碘酸（HI

35、O4）氧化后，形成2-醛基；后者與Schiff試劑中的無色品紅亞硫酸復合物結合，形成紫紅色反應產(chǎn)物，PAS反應陽性部位即表示多糖的存在。4）脂質(zhì)的顯示方法Ø 脂肪與類脂Ø 標本用甲醛固定、冷凍切片Ø 脂溶性染料 油紅 蘇丹 蘇內(nèi) 蘇丹黑B 尼羅藍Ø 餓酸固定兼染色，脂類呈黑色 3.3 免疫細胞化學Ø 特異蛋白抗原的定位與定性Ø 免疫學基本原理與細胞化學技術相結合所建立起來的新技術，根據(jù)抗原與抗體特異性結合的特點，檢測細胞內(nèi)某種多肽、蛋白質(zhì)及膜表面抗原和受體等大分子物質(zhì)的存在與分布。 1）免疫熒光技術Ø Immunofluoe

36、nrescence techniqueØ 將免疫學方法（抗原抗體特異結合）與熒光標記技術相結合用來研究特異蛋白抗原在細胞內(nèi)分布的方法。Ø 用熒光素（常用異硫氰酸）標記抗體，并于熒光顯微鏡下觀察，稱免疫熒光技術 。2）免疫電鏡技術l immunoelectron microscopy 用熒光素標記抗體，進行酶顯示后，可在電鏡下觀察的技術稱為免疫電鏡術l 免疫鐵蛋白技術l 免疫酶標技術l 免疫膠體金技術3.4 原位雜交技術l 細胞內(nèi)特異核酸序列定位與定性l In situ hybridizationl 目的是為了確定特殊核苷酸序列在染色體或細胞中的位置l 用標記的核酸探針通過分

37、子雜交確定特殊核苷酸序列在染色體上或在細胞中位置的方法。l 使用帶放射性的DNA探針，通過放射自顯影來顯示位置。l 免疫探針法，將探針核苷酸的側(cè)鏈加以改造，探針雜交后，其側(cè)鏈可被帶有熒光標記的抗體所識別，從而顯示出位置。 3.5 放射自顯影技術u 即利用放射性標記技術研究生物大分子在細胞內(nèi)的合成動態(tài)u Autoradiographu 利用放射性同位素的電離輻射對乳膠（含AgBr或AgCl）的感光作用，對細胞內(nèi)生物大分子進行定性、定位與半定量研究的一種細胞化學技術u 放射自顯影技術主要用于追蹤某些物質(zhì)在體內(nèi)、組織或細胞中的分布與代謝徑路。u 同位素標記的生物大分子前體的摻入u 細胞內(nèi)同位素所在位

38、置的顯示u 將放射性同位素或放射性同位素的標記物注入動物體內(nèi)或加入培養(yǎng)基中，間隔一定時間取材，制成標本（如切片）u 在暗室中于標本的上面涂以液體原子核乳膠，置暗處曝光數(shù)日u 再經(jīng)顯影和定影處理，或經(jīng)染色后光鏡觀察，在放射性同位素或其標記物存在的部位，溴化銀被還原成黑色的微細銀顆粒u 可在電鏡下觀察則稱之為電鏡放射自顯影術(electron microscope autoradiography) 3.6 定量細胞化學分析技術Ø 測定某個細胞或細胞群體中某些蛋白質(zhì)或核酸等生物大分子含量的技術ü 顯微分光光度測定技術ü 流式細胞儀技術1）顯微分光光度測定技術Ø

39、 MicrospectrophotometryØ 利用細胞內(nèi)某些物質(zhì)對特異吸收光譜吸收的原理，用來測定這些物質(zhì)如核酸與蛋白質(zhì)等在每一個細胞內(nèi)含量的一種實驗技術Ø 顯微分光光度計是結合顯微鏡和分光光度計特點的分析的儀器。 顯微分光光度計用于刑事科學實驗室中進行文件和微量物證的檢驗。 顯微分光光度計能夠進行微量的文字色彩和成分分析，從而判斷檢驗材料中的書寫墨水是否是同一種物質(zhì)。2）流式細胞儀Ø 流式細胞術是對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術。Ø 包被細胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細胞計（flow cytometer）。Ø 可以定量地測

40、定某一細胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量；Ø 也可統(tǒng)計細胞群體中DNA、RNA或某一特異蛋白含量不同的細胞的數(shù)量；Ø 可以將某一特異染色的細胞從數(shù)以萬計的細胞群體中分離出來，以及將DNA含量不同的中期染色體分離出來。3.7 單克隆抗體技術1975年Milstein和konler將小鼠骨髓瘤細胞與羊紅血球免疫過的小鼠淋巴細胞融合形成雜種細胞能分泌抗羊紅血球抗體，用于制備單克隆抗體。獲1984年諾貝爾獎。正常淋巴細胞（如小鼠脾細胞）具有分泌抗體的能力，但不能長期培養(yǎng)，瘤細胞（如骨髓瘤）可以在體外長期培養(yǎng)，但不分泌抗體。Selective HAT Medium l HAT

41、？ 次黃嘌呤（hypoxantin） 氨基蝶呤（aminopterin） 胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidin） HAT培養(yǎng)基就是指含有這三種物質(zhì)的細胞培養(yǎng)基。l 在HAT培養(yǎng)基中，只有腫瘤細胞和正常細胞融合形成的雜交瘤細胞才能生存，而未融合的腫瘤細胞、正常細胞及非腫瘤細胞和正常細胞融合形成的細胞都會死亡。l 正常的未融合細胞具有核酸合成主要通路和旁路所必需的酶但不能在體外長期生長；l 突變后的腫瘤細胞只具有 RNA和 DNA合成所必需的主通路的酶，而缺乏利用胸腺嘧啶核苷合成 DNA的胸腺嘧啶核苷激酶(TK)或缺乏利用次黃嘌呤合成 RNA的磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)。當這些細胞的核酸合成主通路

42、被培養(yǎng)基中氨基喋呤阻斷后，則因核酸合成障礙而死亡。l 腫瘤細胞和具有合成旁路酶的正常細胞形成的融合細胞，才能在氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下利用其中的次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷合成核酸而得以生存。l 融合細胞具有腫瘤細胞和抗體分泌細胞雙重特征，在去除氨基喋呤這一核酸阻斷劑后即可在正常培養(yǎng)基中長期傳代增殖，并分泌抗體。單克隆抗體技術特點l 每個B淋巴細胞僅專一地產(chǎn)生、分泌一種針對某種抗原決定簇的特異性抗體，而腫瘤細胞可以無限增殖，因此雜交瘤細胞可在體外培養(yǎng)或移植到體內(nèi)條件下分泌大量單克隆抗體。l 單克隆抗體技術的最主要優(yōu)點是可以用不純的抗原分子大量制備純一的單克隆抗體。3.8 細胞拆合

43、與顯微操作技術細胞拆合l 為了探明核質(zhì)相互作用的機制，把核與質(zhì)分離開來，然后把不同來源的細胞質(zhì)和細胞核相互配合，形成核質(zhì)雜交細胞。l 細胞拆合方法 物理法（機械、短波光） 化學法（松胞素B）顯微操作術(micromanipulation)l 在顯微鏡下， 用顯微操作裝置對細胞進行解剖手術和微量注射的技術屬顯微操作技術。l 顯微操作儀是在顯微鏡下對細胞進行顯微操作的裝置，可用于細胞核移植、基因注入、染色體微切和胚胎切割等手術。第四章 細胞膜與細胞表面一、概述1、細胞質(zhì)膜 Cell (plasma) membraneØ 包圍在細胞表面的一層極薄的膜，基本作用是保持細胞內(nèi)微環(huán)境的相對穩(wěn)定，

44、并參與同外界環(huán)境進行物質(zhì)交換、能量和信息傳遞。2、胞質(zhì)膜cytoplasmic membraneØ 也稱細胞內(nèi)膜Ø 存在于細胞質(zhì)中各細胞器的膜，包括核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、高爾基體膜、溶酶體膜、線粒體膜、葉綠體膜、過氧化物酶體膜等。3、生物膜（Biomembrane/Biological membrane）Ø 細胞內(nèi)膜和質(zhì)膜的總稱Ø 生物膜是細胞的基本結構，它不僅具有界膜的 功能，還參與細胞的全 部生命活動。4、細胞膜的功能Ø 提供相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境Ø 選擇性的物質(zhì)運輸Ø 提供細胞識別位點，完成細胞內(nèi)外信息跨膜傳遞Ø 為多種

45、酶提供結合位點，使酶促反應高效而有序的進行Ø 介導細胞與細胞、細胞與基質(zhì)之間的連接Ø 質(zhì)膜參與形成具有不同功能的細胞表面特化結構二、細胞膜的結構模型Ø E. Overton 1895 發(fā)現(xiàn)凡是溶于脂肪的物質(zhì)很容易透過植物的細胞膜，而不溶于脂肪的物質(zhì)不易透過細胞膜，因此推測細胞膜由連續(xù)的脂類物質(zhì)組成。Ø E. Gorter & F. Grendel 1925 用有機溶劑提取了人紅細胞質(zhì)膜的脂類成分，將其鋪展在水面，測出膜脂展開的面積二倍于細胞表面積，因而推測細胞膜由雙層脂分子組成。Ø J. Danielli & H. Davson

46、 1935 提出"雙分子片層"結構模型，該模型是第一次用分子術語描述的結構，并將膜結構同所觀察到的生物學理化性質(zhì)聯(lián)系起來，對后來的研究有很大的啟發(fā)。Ø J. D. Robertson 1959 用超薄切片技術獲得了清晰的細胞膜照片，顯示暗-明-暗三層結構，它由厚約3.5nm的雙層脂分子和內(nèi)外表面各厚約2nm的蛋白質(zhì)構成，總厚約7.5nm。Ø 暗層是蛋白質(zhì)，透明層是脂，建議將這種結構稱為單位膜模型。Ø 1972年 S. J. Singer & G. Nicolson 根據(jù)免疫熒光技術、冰凍蝕刻技術的研究結果，提出了“流動鑲嵌模型”。三、細

47、胞膜的化學組成1、概 述l 膜結構是由膜脂（膜的基本骨架）和膜蛋白（膜功能的主要體現(xiàn)者）共同構成。l 蛋白質(zhì)與脂的比例依據(jù)膜的類型（如質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、高爾基體膜）、細胞類型（肌細胞、肝細胞）、生物類型（動物、植物和原核生物）的不同而不同。l 一般而言，脂占50%，蛋白質(zhì)占40%，碳水化合物約占1-10%。2、膜脂的成分u Membrane lipidsu 雙親媒性（amphipathic）：膜脂分子都有一個親水末端（極性端）和一個疏水末端（非極性端）u 使生物膜具有屏障作用，大多數(shù)水溶性物質(zhì)不能自由通過，只允許親脂性物質(zhì)通過。u 三類：磷脂、膽固醇、糖脂2.1 磷脂（Phospholipids

48、）Ø 約占膜脂的50%以上。Ø 磷脂分子的極性端是各種磷脂酰堿基, 稱作頭部Ø 磷脂分子的疏水端是兩條長短不一的烴鏈，稱為尾部，一般含有1424個偶數(shù)碳原子。Ø 磷脂烴鏈的長度和不飽和度可以影響磷脂的相互位置，進而影響膜的流動性。Ø 各種磷脂頭部基團的大小、形狀、電荷的不同與磷脂蛋白質(zhì)的相互作用有關。Ø 磷脂可分為兩大類: 甘油磷脂和鞘磷脂。甘油磷脂包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿(卵磷脂)、磷脂酰肌醇等。2.2 糖 脂 Ø 含糖而不含磷酸的脂類，含量約占脂總量的5以下，在神經(jīng)細胞膜上糖脂含量較高，約占5-10。Ø 糖

49、脂由一個或多個糖殘基代替了磷脂酰膽堿而與鞘氨醇的羥基結合2.3 膽固醇（cholesterol） Ø 存在于真核細胞膜中。Ø 膽固醇分子由三部分組成: 極性的頭部、非極性的類固醇環(huán)結構和一個非極性的碳氫尾部。7 膽固醇的親水頭部朝向膜的外側(cè),疏水的尾部埋在脂雙層的中央。7 膽固醇分子是扁平和環(huán)狀的,對其他脂肪酸尾部的運動具有干擾作用（膽固醇對調(diào)節(jié)膜的流動性、加強膜的穩(wěn)定性有重要作用）。7 動物細胞膜膽固醇的含量較高, 大多數(shù)植物細胞和細菌細胞質(zhì)膜中沒有膽固醇,酵母細胞膜中是麥角固醇。2.4 脂質(zhì)體Ø 將少量的磷脂放在水溶液中，它能夠自我裝配成脂雙層的球狀結構，這種

50、結構稱為脂質(zhì)體，脂質(zhì)體是人工制備的連續(xù)脂雙層的球形脂質(zhì)小囊。Ø 研究膜脂與膜蛋白及其生物學性質(zhì)的極好材料3、膜蛋白（membrane protein）Ø 膜功能的主要體現(xiàn)者。據(jù)估計核基因組編碼的蛋白質(zhì)中30%左右的為膜蛋白。Ø 根據(jù)膜蛋白與脂分子的結合方式，可分為： 外在膜蛋白（extrinsic protein）或膜周邊蛋白（peripheral protein） 內(nèi)在膜蛋白（integral protein）或稱整合膜蛋白3.1 整合膜蛋白Ø 部分或全部鑲嵌在細胞膜中或內(nèi)外兩側(cè)，以非極性氨基酸與脂雙層分子的非極性疏水區(qū)相互作用而結合在質(zhì)膜上。

51、6; 整合蛋白幾乎都是完全穿過脂雙層的蛋白，親水部分暴露在膜的一側(cè)或兩側(cè)表面; 疏水區(qū)同脂雙層分子的疏水尾部相互作用。Ø 跨膜蛋白可再分為單次跨膜、多次跨膜、多亞基跨膜等?？缒さ鞍滓话愫?5%50%的螺旋, 也有折疊。3.2 外周蛋白n 蛋白完全外露在脂雙層的內(nèi)外兩側(cè)，主要是通過非共價健附著在脂的極性頭部，或整合蛋白親水區(qū)的一側(cè)，間接與膜結合。 n 外周蛋白可用高鹽或堿性pH條件分離。 n 均為水溶性蛋白，占膜蛋白總量的20%-30%n 外周蛋白可以增加膜的強度，或是發(fā)揮酶的功能，或是參與信號分子的識別和信號轉(zhuǎn)導。3.3 脂錨定蛋白n lipid-anchoredn 通過共價鍵的方式

52、同脂分子結合，位于脂雙層的外側(cè)。n 同脂的結合有兩種方式： 1）蛋白質(zhì)直接結合于脂雙層分子 2）蛋白并不直接同脂結合，而是通過一個糖分子間接同脂結合n 通過與糖的連接被錨定在膜脂上的蛋白質(zhì)主要是通過短的寡糖與包埋在脂雙層外葉中的糖基磷脂酰肌醇（glycosylphophatidylionositol，GPI）相連而被錨定在質(zhì)膜的外側(cè)。這類脂錨定蛋白通常是膜受體、酶和細胞粘著分子。n 另一類存在于細胞質(zhì)面的脂錨定蛋白是通過長的包埋在脂雙層中的碳氫鏈進行錨定的。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)兩種蛋白（Src 和Ras）是通過這種方式被錨定在質(zhì)膜的細胞質(zhì)面，這種錨定方式與細胞從正常狀態(tài)向惡性狀態(tài)轉(zhuǎn)化有關。3.4 膜蛋白

53、的功能 功能蛋白示例作用方式運輸?shù)鞍譔aK泵主動將Na+泵出細胞，K+泵入細胞 連接蛋白整合素將細胞內(nèi)肌動蛋白與細胞外基質(zhì)蛋白相連 受體蛋白血小板生長因子(PDGF)受體同細胞外的PDGF結合、在細胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生信號， 引起細胞的生長與分裂 酶腺苷酸環(huán)化酶在細胞外信號作用下，導致細胞內(nèi)cAMP產(chǎn)生四、膜的流動性1、膜脂的流動Ø 膜脂分子的側(cè)向運動Ø 脂肪酸鏈越短，不飽和程度越高，膜脂的流動性越大2、膜蛋白的流動Ø 熒光抗體免疫標記實驗 抗鼠細胞膜蛋白的熒光抗體（綠色熒光） 抗人細胞膜蛋白的熒光抗體（紅色熒光） 滅活的仙臺病毒Ø 成斑現(xiàn)象（patching）&

54、#216; 成帽現(xiàn)象（capping） 在某些細胞中，當熒光抗體標記時間延長，已均勻分布在細胞表面的標記熒光會重新排布，聚集在細胞表面的某些部位，即所謂成斑現(xiàn)象，或聚集在細胞的一端，即成帽現(xiàn)象Ø 細胞骨架對膜蛋白流動的影響 阻止了膜蛋白的運動 松胞素B 非離子去垢劑3、膜蛋白與膜脂的復合流動Ø 光脫色恢復技術 Fluorescence Recovery After Photo bleaching （FRAP） 用熒光素標記膜蛋白或膜脂，然后用激光束照射細胞表面某一區(qū)域，使被照射區(qū)的熒光淬滅變暗。由于膜的流動性，淬滅區(qū)域的亮度逐漸增加，然后逐漸恢復到與周圍的熒光強度相等。根據(jù)

55、熒光恢復的速度可推算出膜蛋白與膜脂擴散速度（cm2/s）。五、膜的不對稱性1、細胞膜各部分的名稱Ø 細胞外表面（ES）Ø 原生質(zhì)表面（PS）Ø 細胞外小頁斷裂面（EF）Ø 原生質(zhì)小頁斷裂面（PF）2、細胞膜的不對稱性Ø membrane asymmetryØ 膜的主要成分是蛋白、脂和糖，膜的不對稱性主要是指上述成分分布的不對稱以及這些分子在方向上的不對稱。 2.1 膜脂不對稱性Ø 指細胞質(zhì)膜脂雙層中各種成分不是均勻分布的，包括種類和數(shù)量的不均勻。Ø 膜脂的不對稱性表現(xiàn)在脂雙層中分布的各類脂的比例不同，各種細胞的膜脂

56、不對稱性差異很大。2.2 膜蛋白的不對稱性Ø 包括外周蛋白分布的不對稱以及整合蛋白內(nèi)外兩側(cè)氨基酸殘基數(shù)目的不對稱 Ø 每種膜蛋白在膜中都有特定的排布方向，與其功能相適應，這是膜蛋白不對稱性的主要因素。2.3 膜糖的不對稱性Ø 膜糖以糖蛋白或糖脂的形式存在，無論是糖蛋白還是糖脂的糖基都是位于膜的外表面。3、細胞膜不對稱性研究方法Ø 冰凍斷裂技術（freeze fracture）Ø 冰凍斷裂法不僅可用于研究膜組份分布的不對稱，也是膜的脂雙層結構直接證據(jù)的來源 Ø 放射性標記法（radioactive labeling procedure)

57、 Ø 分離細胞膜，用乳過氧化物酶進行膜蛋白標記（分子較大而不能透過細胞膜，可以用于標記膜外表面的蛋白），標記后，分離膜蛋白，電泳分離和放射自顯影進行鑒定。Ø 脂酶處理法Ø 胰蛋白酶處理法研究膜蛋白的定位Ø 磷脂酶處理法研究膜脂在脂雙層中的定位細胞膜不對稱性的意義膜脂、膜蛋白及膜糖分布的不對稱性導致了膜功能的不對稱性和方向性。從而保證了生命活動的高度有序性。六、細胞膜與膜下結構紅細胞Ø Red blood cell，erythrocyteØ 結構最簡單的細胞，特別是成熟的紅細胞沒有細胞器，質(zhì)膜是它的唯一結構，并且易于提純和分離，是研究膜結構的最好材料。紅細胞的功能紅細胞的主要功能是將肺吸進的氧運送到身體的其他組織，并帶走呼出的CO2。紅細胞血影將紅細胞分離后放入低滲溶液中，水很快滲入到細胞內(nèi)部，使紅細胞膨脹、破裂，從而釋放出血紅蛋白（是紅細胞中惟一一種非膜蛋白)，此時的紅細胞就變成了沒有內(nèi)容物的空殼，由于紅細胞膜具有很大的變形性、柔韌性和可塑性，當紅細胞的內(nèi)容物滲漏之后，它的膜可以重新封閉起來，此時的紅細胞被稱為血