重組人干擾素大腸桿菌高效表達(dá)系統(tǒng)的建立

1、天津醫(yī)藥年月第卷第期重組人干擾素大腸桿菌高效表達(dá)系統(tǒng)的建立劉新宇摘要梁東春左愛(ài)軍郭剛張鏡宇目的：構(gòu)建重組人干擾素方（）原核表達(dá)系統(tǒng)，以獲得在大腸桿菌中的高效表達(dá)。法：依據(jù)大腸桿菌遺傳密碼子頻率表，在不改變氨基酸組成的情況下，人工半合成適于在大腸桿菌中表達(dá)的編碼序列；經(jīng)擴(kuò)增后，克隆人表達(dá)型質(zhì)粒載體；篩選陽(yáng)性菌落，溫度誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物行聚丙烯酰胺凝蛋白質(zhì)印跡（）鑒定，并以人羊膜細(xì)胞水泡性口炎病毒（）系統(tǒng)鑒定膠電泳（）、抗病毒活性。結(jié)果：產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定可見(jiàn)與預(yù)期大小符合的的條帶；重組質(zhì)粒經(jīng)序列分析，證實(shí)含有與預(yù)期相符且讀碼框架正確的編碼序列；可見(jiàn)與分子質(zhì)量大小一致的蛋白質(zhì)條帶，鑒定此條帶

2、為，其比活性達(dá)（）×。結(jié)論：在大腸桿菌中的高效表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建成功，且能高水平地表達(dá)出具有生物活性的。關(guān)鍵詞干擾素大腸桿菌基因表達(dá)原核表達(dá)系統(tǒng)遺傳密碼，：（）：，：，（）×：干擾素（）是由機(jī)體的白細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，具有較強(qiáng)的廣譜抗病毒、抗腫瘤的作用并參與免疫調(diào)節(jié)作用。其中，在臨床上被用來(lái)治療慢性乙型肝炎、丙型肝炎、流行性腮腺炎、病毒性心肌炎及惡性腫瘤。目前獲取的主要途經(jīng)是用基因工程獲得重組人干擾素（），但表達(dá)量還不甚理想。大腸桿菌是基因工程中常用的工程菌，但由于其在密碼子的使用頻率上與哺乳動(dòng)物細(xì)胞有很大不同，因此一些真核基因難以在大腸桿菌中高效表達(dá)。人工改造基因則可通過(guò)對(duì)大

3、腸桿菌的稀有密碼子進(jìn)行優(yōu)化而獲得在大腸桿菌中的高表達(dá)。本研究擬構(gòu)建重組人干擾素大腸桿菌高效表達(dá)系統(tǒng)，旨在獲得大量重組人干擾素。材料與方法，質(zhì)粒（含有啟動(dòng)材料大腸桿菌菌株子），人羊膜細(xì)胞系（細(xì)胞系）和水泡性口炎病毒（）為本室保存。各種限制性內(nèi)切酶及購(gòu)自公司，山羊抗人多克隆一抗及標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)兔抗山羊二抗、膜及其余常用分子生物學(xué)試劑購(gòu)自鼎國(guó)公司。方法將序列中的稀引物及模板的設(shè)計(jì)有密碼子替換為大腸桿菌偏嗜性密碼子，然后將該序列分為端開(kāi)始分別標(biāo)記為，每段為段，自組，每組的個(gè)片段間有個(gè)堿基互補(bǔ)，共組。引物共作者單位：天津醫(yī)科大學(xué)生化教研室（劉新宇）；天津市內(nèi)分泌研究所（梁東春，左愛(ài)軍，

4、郭剛，張鏡宇）合成條，分別標(biāo)記為，。在的端引入限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)和起始密碼子，的端引入了限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)和終止密碼子，適量中。輸出能量下，冰浴中進(jìn)行超聲碎菌。×離心，以適量懸浮沉淀，取少量用于電泳鑒定。電泳結(jié)果經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描后，經(jīng)軟件分析表達(dá)蛋白的含量。（）包涵體的處理及蛋白質(zhì)印跡（）：鑒定以尿素洗滌沉淀后溶解包涵體于尿素中，以谷胱甘肽進(jìn)行復(fù)性。取少量復(fù)性液行及鑒定。行后，半干法將蛋白條帶電轉(zhuǎn)印至膜上，以山羊抗。引物，含有與相鄰片段分別匹配的序列?；驍U(kuò)增多步法完成全編碼見(jiàn)圖。以和為模板，序列的分段擴(kuò)增和拼接為引物，體系構(gòu)成（反應(yīng)體系）：（），（），（），（），（），&

5、#215;，體積補(bǔ)至。反應(yīng)條件：，個(gè)循環(huán)；最終延伸。產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，回收產(chǎn)物標(biāo)記為待用。以同樣的方法分別以，為模板，為引物及，多克隆抗體作一抗，以標(biāo)記的兔抗山羊作二抗進(jìn)行印跡，觀察結(jié)果并照相。（）生物活性分析：在將細(xì)胞培養(yǎng)成單系統(tǒng)上按細(xì)胞病變抑制法測(cè)定。層后，加不同濃度的干擾素處理，對(duì)照組用營(yíng)養(yǎng)液代替，培養(yǎng)后棄去干擾素，加病毒攻擊培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)至對(duì)照細(xì)胞完全病變后觀察結(jié)果。采用結(jié)晶紫染色，酶標(biāo)儀測(cè)定，并以標(biāo)準(zhǔn)品校正活性。為模板，為引物擴(kuò)增并回收產(chǎn)物，相應(yīng)標(biāo)記為，。再以，為模板，為引物進(jìn)行（加樣量及反應(yīng)條件同上），回收產(chǎn)物標(biāo)記為（）待用。以（），結(jié)果為模板，為引物，作體系（加樣量及反應(yīng)條件

6、同上），產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳。偏嗜性基因的擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)物中有與預(yù)期大小相符合的左右的條帶產(chǎn)生，見(jiàn)圖。：產(chǎn)物；：圖分段擴(kuò)增和拼接基因編碼序列示意圖圖產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建大量擴(kuò)增大腸桿重組質(zhì)粒的酶切鑒定電泳結(jié)果見(jiàn)圖，質(zhì)粒菌偏嗜性基因，以北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司純化試劑盒對(duì)瓊脂糖凝膠電泳的產(chǎn)物進(jìn)行回收，回收的產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶和進(jìn)行雙酶切。回收酶切產(chǎn)物，與相同酶切處理的原核表達(dá)質(zhì)粒載體，酶切進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌鑒定，篩選出陽(yáng)性克隆，命名為，并進(jìn)行序列分析。經(jīng)酶切后形成大小條條帶，一條為質(zhì)粒載體本身，另一條大小約為，與所插入的目的基因大小相符合，證明該質(zhì)粒為重組質(zhì)粒（）。序列分

7、析證實(shí)插入序列與序列相符。測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖，與預(yù)期相符。的肽鏈內(nèi)含有個(gè)半胱氨酸殘基可最終形挑取含重組質(zhì)粒的大溫度誘導(dǎo)表達(dá)腸桿菌單菌落至含抗生素的液體培養(yǎng)基中，成個(gè)分子內(nèi)二硫鍵及。震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)液至培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至，將培養(yǎng)溫度升高至，培養(yǎng)。表達(dá)產(chǎn)物的見(jiàn)圖，可見(jiàn)重組質(zhì)粒誘導(dǎo)，表達(dá)產(chǎn)物的碎菌后沉淀中含有與預(yù)期分子質(zhì)量大小相符的蛋白。表達(dá)產(chǎn)物的鑒定（）聚丙烯酰胺凝膠電泳（）：離心收集菌體，以清洗沉淀次，將沉淀重懸于電泳后染色經(jīng)掃描分析結(jié)果見(jiàn)圖，可見(jiàn)各天津醫(yī)藥年月第卷第期掃描后吸光度值蛋白條帶在凝膠上位置（）圖表達(dá)產(chǎn)物行后染色并掃描分析結(jié)果：；：圖重組質(zhì)粒的酶切鑒定鑒定結(jié)果見(jiàn)圖，經(jīng)顯色后在預(yù)期位置可見(jiàn)

8、深色條帶，位置與氨基黑染色后的深染條帶相對(duì)應(yīng)。圖的氨基酸構(gòu)成及其編碼序列的堿基組成：包涵體處理產(chǎn)物經(jīng)分離后氨基黑染色；：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)志，經(jīng)氨基黑染色；：包涵體處理產(chǎn)物經(jīng)分離后顯色圖鑒定結(jié)果生物活性測(cè)定結(jié)果包涵體經(jīng)處理后，獲得一定純度的，純度超過(guò)，比活性達(dá)（）×。討論根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性，多種不同的密碼子可編碼同一種氨基酸。但不同的生物在密碼子的使用頻：重組質(zhì)粒誘導(dǎo)，表達(dá)產(chǎn)物的碎菌后上清液；：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)志，；率上常表現(xiàn)出一定的偏嗜性，這種密碼子偏嗜性是由生物的物種特征決定的。由于基因工程的原因，重組基因在原核系統(tǒng)中高效表達(dá)的影響因素正日益受到關(guān)注，這其中探討較多的主要是密碼子的

9、偏嗜性。目前探討較多的大腸桿菌稀有密碼子有：重組質(zhì)粒誘導(dǎo)，表達(dá)產(chǎn)物的碎菌后沉淀圖重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的蛋白條帶掃描峰型，箭頭所指為目的蛋白條帶。經(jīng)計(jì)算表達(dá)的目的蛋白占菌體總蛋白的。和，它們均編碼精氨酸。在人類基因中常見(jiàn)的、屬于大腸桿菌的稀有密碼子，在大腸桿菌中出現(xiàn)的頻率僅為和。特別是當(dāng)這個(gè)密碼子串聯(lián)連續(xù)出現(xiàn)時(shí)，與天然的，的蛋白中殘留的問(wèn)題，這些都為的生產(chǎn)即下游工程奠定了基礎(chǔ)。總之，本研究通過(guò)構(gòu)建重組人干擾素大腸桿菌高效表達(dá)系統(tǒng)，獲得了有生物活性的的高效表達(dá)，同時(shí)也建立了一條在原核生物中表達(dá)真核基因的技術(shù)路線。參考文獻(xiàn)，：，：，：，：，（）：純化及抗的高效表達(dá)、李武平，呂宏亮，段招軍，等干擾素病

10、毒活性研究病毒學(xué)報(bào)，（）：（）序列（）近似，競(jìng)爭(zhēng)與結(jié)合，會(huì)造成外源基因表達(dá)錯(cuò)誤或提前終止。的開(kāi)放讀碼框中就含有個(gè)、個(gè)，其中就含有和這樣連續(xù)出現(xiàn)的稀有密碼子。筆者根據(jù)人和大腸桿菌密碼子使用頻率的不同，根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性，在不改變的一級(jí)結(jié)構(gòu)的情況下，在人工合成，對(duì)的基因時(shí)，通過(guò)密碼子優(yōu)化的方法在大腸桿菌中使用頻率極低的密碼子進(jìn)行了替換，將全部替換成，對(duì)其他使用頻率較低的密碼子也進(jìn)行了替換，以利于在大腸桿菌中的高效表達(dá)。利用化學(xué)法直接合成單鏈合成過(guò)程中，發(fā)生錯(cuò)誤的幾率隨著單鏈的延長(zhǎng)而增加，且直接合成法合成較長(zhǎng)片段的費(fèi)用極其昂貴。由于干擾素劉麗華，哈斯阿古拉，李宏，等按大腸桿菌高表達(dá)序列設(shè)計(jì)的人干擾素

11、基因的化學(xué)合成和克隆內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），（）：的序列相對(duì)較長(zhǎng)，不宜通過(guò)化學(xué)合成法直接合成。因此，本實(shí)驗(yàn)采取了分段擴(kuò)增，再通過(guò)拼接的方法：即先合成條單鏈，擴(kuò)增出條較長(zhǎng)的，再通過(guò)引物所引入的互補(bǔ)區(qū)拼接完整的編碼序列。本實(shí)驗(yàn)是以含啟動(dòng)子的質(zhì)粒作為高效表達(dá)的載體，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。啟動(dòng)子的啟動(dòng)為受溫度調(diào)節(jié)的強(qiáng)啟動(dòng)子，且無(wú)需異丙基硫代半乳糖苷（）誘導(dǎo)，避免了獲得的目，：，：（收稿修回）國(guó)外醫(yī)學(xué)動(dòng)態(tài)高血壓患者左室向心性幾何形狀對(duì)心血管預(yù)后有不良影響左室（）質(zhì)量和幾何形狀預(yù)示高血壓時(shí)發(fā)生心血管事件的危險(xiǎn)性。肥厚（）恢復(fù)可能含有重要預(yù)后意義。在抗高血壓治療時(shí)，幾何形狀改變與預(yù)后的關(guān)系尚未確定。等對(duì)例經(jīng)過(guò)基線和隨訪超聲心動(dòng)圖距最后一次檢查（±）個(gè)月而預(yù)期無(wú)并發(fā)癥的高血壓患者再隨訪（±）個(gè)月。患者由家庭醫(yī)生給予抗高血壓治療。結(jié)果：有例患者在最后的隨訪超聲心動(dòng)圖檢查之后發(fā)生第一次心血管事件。從基線到隨訪期間持續(xù)存在的，肯定是心血管事件的獨(dú)立性預(yù)告。在超聲心動(dòng)圖隨訪中有（）或無(wú)（）患者中，向心性幾何形狀的肥厚者（相對(duì)性室壁厚度）的心血管發(fā)