凝膠成像及QuantityOne使用說明

1、GelDocTM XR The Discovery Series Quantity One® 1-D Analysis Software使用說明書昆明友寧科技有限公司2008年9月儀器各組成部分介紹鏡頭及濾光片位控制面板紫外透射平臺(tái)I Universal Hood（正面 大體）II控制面板Universal Hood電源開關(guān)（ChemiDoc另有鏡頭開關(guān)）III 背面開關(guān)及保險(xiǎn)絲GelDoc鏡頭ChemiDoc鏡頭濾光片選擇桿IV鏡頭及CCD V Universal Hood內(nèi)頂部圖像采集 用成像儀自帶的熒光標(biāo)尺和帶刻度的透明塑料板，參照后文GelDoc XR成像的方法，按紫外透射、

2、白光透射以及側(cè)面白光三種模式分別采集一次圖像。要求成像清晰、明暗適中。凝膠切割將抽屜式紫外透射平臺(tái)完全拉開至最大，將待切割的樣品放置其上。安裝上有機(jī)玻璃保護(hù)屏，打開“Trans UV”和“Prep UV”。操作者戴上手套，站在保護(hù)屏后進(jìn)行切膠操作。注意事項(xiàng)：1 安裝ChemiDoc XRS的圖像采集卡時(shí)，要先安裝其驅(qū)動(dòng)程序，再將圖像采集卡插入；2 如果軟件的密碼狗不能被正常識(shí)別，請(qǐng)安裝帶補(bǔ)丁的驅(qū)動(dòng)程序或向Bio-Rad安裝工程師求助；3 在給用戶安裝圖像儀和軟件前，先提醒用戶保存好申請(qǐng)來的密碼、軟件序列號(hào)和密碼狗。4 培訓(xùn)儀器時(shí)，提醒用戶不要將潮濕的樣品長期放在暗箱內(nèi)，以防腐蝕濾光片，更不要將

3、液體濺到暗箱底板上，以免燒壞主板。5 提醒用戶儀器用完，及時(shí)關(guān)上電源，特別是ChemiDoc XRS的CCD電源；6 提醒用戶勿用控制成像儀的電腦上網(wǎng)，也不要自行重裝電腦操作系統(tǒng)或給操作系統(tǒng)升級(jí)。第二部分 儀器及Quantity One軟件分析操作簡(jiǎn)介凝膠電泳是每個(gè)做分子生物學(xué)的研究者天天都要打交道的基本技術(shù)。電泳之后的信息處理與電泳本身同樣重要。目前有大量軟件可以用于分析電泳結(jié)果，今天要向大家介紹的是Bio-Rad公司的1D凝膠分析軟件Quantity One（Bio-Rad還有一個(gè)做2D凝膠分析的軟件PDQuest）。Quantity One軟件是常用1D凝膠分析軟件中功能最強(qiáng)大，自動(dòng)化程

4、度最高的軟件。這個(gè)軟件的最新版本可以在Bio-Rad的網(wǎng)站（http:/www.bio-）免費(fèi)下載，以供試用或用戶升級(jí)之用。Quantity One軟件的主要功能包括定量分析(Volumes Quick Guide)，電泳條帶分析(Band Analysis)，差顯分析(Differential Display Analysis)，克隆計(jì)數(shù)(Colony Counting Analysis)等，此外，還可以直接控制Bio-Rad公司的各類圖像儀和ExQuest自動(dòng)切膠儀，使您的凝膠分析工作變得極為輕松。Quantity One軟件擁有與windows操作系統(tǒng)下絕大多數(shù)應(yīng)用軟件相同的友好界面。插

5、入密碼狗，打開Quantity One軟件，可以看到最上緣藍(lán)色橫條幅是標(biāo)題欄，往下依次是菜單欄和工具欄。每個(gè)菜單的主要功能如下：File圖像打開、保存、引入、打印等操作Match分子量估算、條帶匹配分析Edit圖像普通編輯操作Volumn定量分析View圖像縮放、三維視圖、看光密度值等操作Analysis濃度估算、克隆計(jì)數(shù)等分析Image圖像旋轉(zhuǎn)、翻轉(zhuǎn)、裁切等操作Reports分析結(jié)果輸出Lane泳道分析Window窗口分析Band條帶分析Help幫助、快捷菜單、軟件注冊(cè)等 往下一行是工具欄，上面每個(gè)按鈕的功能見下表：打開文件圖像顯示控制條帶分析工具保存操作顯示條帶匹配工具打印圖像去除分析標(biāo)記

6、輪廓修改工具看全圖圖像工具打印快捷指南局部放大文字工具定量分析快捷指南拖曳定量工具條帶分析快捷指南放大并居中灰度分析工具克隆計(jì)數(shù)快捷指南縮小并居中泳道分析工具Quantity One軟件HelpàQuick Guide快捷指南提示如何實(shí)現(xiàn)一個(gè)功能，如定量分析(Volumes Quick Guide)，電泳條帶分析(Band Analysis)，差顯分析(Differential Display Analysis)，克隆計(jì)數(shù)(Colony Counting Analysis)等?？旖葜改舷掠?，2，3步驟，根據(jù)提示完成。使用Quantity One軟件進(jìn)行電泳結(jié)果分析，通常包括圖像獲取

7、、圖像優(yōu)化、分析、結(jié)果輸出四部分，參考下圖：圖像獲取就是通過軟件控制掃描儀（GS-800、PharosFX等）或凝膠成像系統(tǒng)（GelDoc、ChemiDoc、VersaDoc等）獲取圖像的過程。圖像優(yōu)化就是將掃描或拍照獲得的原始圖像進(jìn)行初步處理，以便更好地進(jìn)行后續(xù)分析。接下來是分析過程，根據(jù)分析的方法和目的不同，又可以分為定量分析、條帶分析、克隆計(jì)數(shù)、差異（聚類）分析等等。不管如何分析，最終我們都必須通過軟件的輸出功能，得到我們想要的結(jié)果。Quantity One軟件提供了多種結(jié)果輸出方式。在接下來的幾章里，我們將按照這個(gè)思路，一步步引導(dǎo)您使用這一軟件。圖像獲取Quantity One 4.4

8、4.6版本可以控制Bio-Rad目前幾乎所有的圖像儀，如GelDoc XR、ChemiDoc XRS等。這些圖像儀采集到的圖像，可以直接保存成軟件可直接分析的圖像，即擴(kuò)展名1sc的原始圖像文件。下面將具體介紹如何通過Quantity One軟件從GelDoc XR獲取圖像。GelDoc XR是Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中最常用，操作最簡(jiǎn)便的儀器，它可以用來拍攝EB、SYBR Green等染料染的核酸電泳凝膠；Sypro Ruby、銀染、考馬斯亮藍(lán)等方法染的蛋白電泳凝膠；以及化學(xué)顯色的印記膜等。使用GelDoc XR之前，先接通電源，打開位于儀器背面右下角的電源開關(guān)；然后根據(jù)具體的應(yīng)用選擇合適的

9、照明和濾光片位置。原則如下：模式1模式2模式3照明類型紫外透射白光透射側(cè)面白光適用樣品EB、SYBR Green、Sypro Ruby等需要紫外激發(fā)的透明樣品金屬銀、考馬斯亮藍(lán)等染料染色，直接可見的透明樣品化學(xué)顯色等非透明可見樣品載物平臺(tái)抽屜式紫外透射平臺(tái)白光轉(zhuǎn)換屏(170-8001)或白光板(170-7950)抽屜式紫外透射平臺(tái)光源按鈕“Trans UV”白光板：“Trans UV”白光轉(zhuǎn)換屏 白光轉(zhuǎn)換屏有自己的電源開關(guān)，位于屏下方，打開后不必每次都關(guān)閉這個(gè)開關(guān)。：“Trans White”“Epi White”濾光片位IIO不管使用何種模式，基本的操作過程都是這樣的：1 將樣品置于適當(dāng)?shù)妮d

10、物平臺(tái)上2 關(guān)閉暗箱門3 調(diào)整濾光片4 打開相應(yīng)光源5 接下來打開Quantity One軟件，選擇FileGelDoc XR，按以下順序操作： 按下Live/Focus，成像儀進(jìn)入實(shí)時(shí)成像； 選擇照明模式，一般熒光樣品選擇UV,普通透射或反射樣品選擇White模式 注意：該選項(xiàng)對(duì)圖像數(shù)據(jù)格式有影響，但不能代替光源選擇。 此功能有三個(gè)上下鍵按鈕：IRIS（光圈），ZOOM（縮放），F(xiàn)OCUS（聚焦），您可在軟件上直接調(diào)節(jié)或在儀器面板上手工調(diào)節(jié) 調(diào)節(jié)步驟：a 調(diào)大IRIS，以看到圖像 b點(diǎn)ZOOM, 將膠適當(dāng)放大 c 調(diào)節(jié)IRIS至合適大?。ㄒ话闱闆r下盡量選擇小光圈，因?yàn)樾」馊吧畲?，圖像更清晰

11、) d調(diào)節(jié)FOCUS，至圖像最清晰 單擊Auto Expose,系統(tǒng)將自動(dòng)選擇曝光時(shí)間成像（系統(tǒng)默認(rèn)0.15%的像素飽和的成像時(shí)間為最佳時(shí)間，在Options對(duì)話框中可以修改該項(xiàng)設(shè)置），如不滿意，單擊Manual Expose，并輸入曝光時(shí)間（秒） 圖像曝光滿意后，按下“Freeze”按鈕。 按下“Analyze”按鈕，將彈出一個(gè)新窗口顯示圖像，以供分析。 第5步結(jié)束后，也可以按下“Save”鍵，保存圖像?；緢D像優(yōu)化通過圖像儀采集的圖像，可能會(huì)有偏斜、對(duì)比度不佳、數(shù)據(jù)關(guān)系錯(cuò)誤等問題影響分析。所以新采集的圖像應(yīng)經(jīng)過優(yōu)化后再進(jìn)行分析。優(yōu)化的基本過程是：Rotate（旋轉(zhuǎn)）Crop（裁剪）Tran

12、sform（轉(zhuǎn)化）。另外，當(dāng)數(shù)據(jù)關(guān)系錯(cuò)誤的時(shí)候，需要改變之。詳細(xì)步驟見下。1旋轉(zhuǎn)（Rotate） 在ImageRotate菜單中選擇適當(dāng)?shù)男D(zhuǎn)角度，其中“Custom Rotation”工具可以實(shí)現(xiàn)任意角度的旋轉(zhuǎn)，點(diǎn)擊后，圖像上出現(xiàn)如下圖所示的情況：圖中出現(xiàn)一個(gè)白圈和黃色十字，鼠標(biāo)靠近黃色箭頭，可以任意角度拖動(dòng)這個(gè)箭頭。旁邊有個(gè)小窗口顯示所需要旋轉(zhuǎn)的角度和弧度，點(diǎn)擊“Rotate”按鈕旋轉(zhuǎn)即可完成，請(qǐng)保存旋轉(zhuǎn)后圖像。2裁剪（Crop） 裁剪的目的是去掉電泳區(qū)域以外的部分，僅保留從電泳起點(diǎn)到前緣有泳道的部分。選擇ImageCrop，在圖像適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)畫一個(gè)方框。鼠標(biāo)移動(dòng)到框邊變成雙向的箭頭，可以

13、改變框的大小和形狀。最后鼠標(biāo)移動(dòng)到框內(nèi)，當(dāng)鼠標(biāo)變成一剪刀形的時(shí)候，單擊，選擇“拷貝并裁剪”。3轉(zhuǎn)化（Transform）優(yōu)化圖像顯示，便于肉眼觀察。選擇ImageTransform，會(huì)彈出右圖所示窗口：選擇“Auto-scale”，軟件會(huì)自動(dòng)調(diào)整對(duì)比度至最優(yōu) 這種對(duì)比度調(diào)整并不改變具體的灰度數(shù)據(jù)，只是將圖中最“淡”的點(diǎn)顯示成白色，最“深”的點(diǎn)顯示成黑色。除此之外，有時(shí)還必須檢查數(shù)據(jù)關(guān)系是否正確。即圖中黑色部分的數(shù)據(jù)是否高于白色部分。正常情況下是的，但有時(shí)會(huì)反過來。這種情況往往出現(xiàn)在用軟件分析其它公司的圖像儀時(shí)或者使用GelDoc XR，第二步“Image Mode”選錯(cuò)的情況下。方法是：1選擇

14、ViewPlot DensityDensity at Cursor，在圖像中顏色較深的地方點(diǎn)擊一下，觀察彈出的灰度數(shù)值2再在顏色較淺的地方點(diǎn)擊一下，觀察灰度數(shù)值。3比較前次數(shù)值是否大于后次的，如果是，則不用再進(jìn)行任何改動(dòng)；如不是，選擇ImageInvert Data，按彈出的對(duì)話框的提示一步步往下做。最后進(jìn)行一次“Transform”。圖像分析Quantity One的圖像分析功能相當(dāng)強(qiáng)大，根據(jù)不同的需要，可以分為定量分析、條帶分析、相似性分析以及克隆計(jì)數(shù)(用于藍(lán)白斑篩選)等等，而且每種分析法都有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)和輸出方式。本章重點(diǎn)介紹常用的定量分析和條帶分析方法，其余更細(xì)更深的功能請(qǐng)參考軟件自帶的

15、用戶手冊(cè)。一 定量分析（Volumn Analysis）定量分析是計(jì)算選定區(qū)域內(nèi)信號(hào)強(qiáng)度的總和，是Quantity One最方便的定量工具。這種分析方式考慮全定區(qū)域的真實(shí)形狀，可用于電泳條帶、斑點(diǎn)、大型芯片以等圖像的定量。這種定量的方法可以扣除背景，可以按照用戶的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出條帶或斑點(diǎn)的濃度，但它不能計(jì)算分子量，也不能進(jìn)行條帶匹配和相似性分析。Quantity One軟件稱這類定量的結(jié)果為Volume。 Volume選定區(qū)域內(nèi)所有像素信號(hào)強(qiáng)度的總和×像素面積 Volume的單位：int×mm2快捷指南Volumes Quick Guide，能夠指導(dǎo)您對(duì)任意所選區(qū)域進(jìn)行定量

16、分析,此分析可以報(bào)告多種結(jié)果，常用的結(jié)果是相對(duì)濃度和絕對(duì)濃度（須提供標(biāo)準(zhǔn)品）。具體的操作方法如下：1 選擇成像系統(tǒng)或打開已保存的文件(軟件可以控制Bio-Rad所有的成像系統(tǒng)如GelDoc,ChemiDoc,VersaDoc,GS-800,FX,如不是Bio-Rad成像系統(tǒng)所攝取的圖象，將圖象保存為Tiff 必須是8位（bit）或16位（bit）無壓縮的tiff文件文件格式，軟件也可進(jìn)行分析處理)2 Zoom Box，縮放，對(duì)圖象進(jìn)行放大觀察3 選擇待分析區(qū)域：Volumn Contour Tool等高線勾勒區(qū)域，自動(dòng)連接濃度濃度相同的點(diǎn)，如U1 Volume Free hand Tool自由

17、畫筆選擇區(qū)域，可以勾勒出無規(guī)則形狀,如U2Volume Rect Tool 矩形區(qū)域選擇，如U3Volumn Circle Tool圓形選擇區(qū)域，如U4按上面4種方法選擇需要定量的區(qū)域。5雙擊所選區(qū)域，出現(xiàn)如下窗口，定義樣品類型，如未知樣品Unkonwn(U1,U2即待計(jì)算樣品)，背景Background(B1,B2，軟件在算濃度時(shí)會(huì)將此區(qū)域的濃度自動(dòng)扣除) 或標(biāo)準(zhǔn)樣品Standard（Std1,Std2, 如果該樣品是濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品，即定量標(biāo)準(zhǔn)，需在濃度concentration一欄輸入該樣品的濃度）。6 Select Tool選擇不同區(qū)域7 Print Image打印圖像8 Volume A

18、nalysis Report 定量報(bào)告結(jié)果。打開出現(xiàn)如下窗口，選擇要報(bào)告的參數(shù)，主要有2個(gè)參數(shù)Volume、adj. Vol. (即adjusted volume) 和Concentration。Volume為定量值，adj. Vol. 為扣除背景后的定量值，如有濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品（Std），軟件可報(bào)告Concentration絕對(duì)濃度。參數(shù)選好后，按下按鈕“done”。 打印文本輸出7軟件報(bào)告如上圖所示：按右側(cè)輸出按鈕，可將表格保存成txt文件，按左側(cè)打印按鈕，可將報(bào)告打印出來。二條帶分析（Band Analysis）條帶分析是Quantity One最基本的分析工具，它可以自動(dòng)識(shí)別電泳泳道和識(shí)別

19、條帶，依據(jù)泳道的平均光密度和條帶寬度對(duì)每個(gè)條帶進(jìn)行模式化定量。這種分析方式雖然不如定量分析來得方便，但這樣可以實(shí)現(xiàn)非常復(fù)雜的電泳分析，滿足各種不同的結(jié)果需要。這種方式的最大優(yōu)點(diǎn)在于它可以完全拋棄人為主觀因素而進(jìn)行全自動(dòng)定量。用條帶分析的方法進(jìn)行定量的結(jié)果叫Trace Quantity（Trace Qty），計(jì)算方法是：首先軟件自動(dòng)計(jì)算條帶上每一橫排像素的平均光密度和平均光密度分布曲線，然后每個(gè)具體條帶的定量值是平均光密度曲線的線下面積的積分，即：Trace Quantity平均光密度×條帶上下邊界的距離Trace Quantity的單位：OD*mm條帶分析中的條帶定量模型下面介紹用此

20、功能對(duì)泳道內(nèi)的所有條帶進(jìn)行分子量確定，相對(duì)濃度分析1 打開已保存的文件(如不是Bio-Rad成像系統(tǒng)所攝取的圖象，將圖象保存為Tiff 必須是8位（bit）或16位（bit）無壓縮的tiff文件文件格式，軟件也可進(jìn)行分析處理)2 Zoom Box，縮放，對(duì)圖象進(jìn)行放大觀察3 Transform轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)圖象的對(duì)比度黑白4 確定泳道(lane),并對(duì)泳道進(jìn)行各種調(diào)整（實(shí)際實(shí)驗(yàn)中泳道往往不是垂直的而出現(xiàn)各種變形）。按下圖所示在軟件的工具欄中有一Lane Tool圖標(biāo)，包含有更多泳道編輯工具。Band Tool條帶編輯工具包Lane Tool泳道編輯工具包5選擇Frame Lanes，輸入圖像實(shí)際泳

21、道(lane)數(shù)并確認(rèn)。此時(shí)圖像上泳道的位置上會(huì)出現(xiàn)一條條紅線，每條紅線就代表一根泳道。6選擇Add/Adjust Anchors，此時(shí)泳道紅線上會(huì)出現(xiàn)一些小圓圈。這些小圓圈稱為錨定點(diǎn)(anchor)，錨定點(diǎn)規(guī)定了泳道走向。當(dāng)泳道不直時(shí)，點(diǎn)擊出現(xiàn)彎曲的泳道部位，就可以增加錨定點(diǎn)。鼠標(biāo)按住錨定點(diǎn)，可以拖動(dòng)錨定點(diǎn)，讓每根紅線始終位于泳道的中間線上。7Lane Background去除泳道背景。點(diǎn)擊該按鈕，選擇一條適當(dāng)?shù)挠镜傈c(diǎn)擊之，然后在彈出的對(duì)話框中選“All Lane On”，在“Rolling Disk Size”中填入適當(dāng)?shù)臄?shù)值 數(shù)值代表背景扣除數(shù)，值越大則背景扣除越少，被計(jì)入條帶定量值越多

22、，反之則背景扣除越多。從經(jīng)驗(yàn)來看，該數(shù)值以240之間為宜。 8Detect Band，檢測(cè)泳道內(nèi)的條帶，打開出現(xiàn)如下窗口。通過調(diào)節(jié)sensitivity靈敏度可調(diào)節(jié)檢測(cè)出的條帶數(shù)，調(diào)節(jié)Lane Width使代表表帶的紅色橫線與條帶寬度差不多寬。中間一行人工編輯按鈕可以用來增加/減少條帶、調(diào)節(jié)條帶的上、下邊界等。打開工具欄中Band Tool條帶編輯工具包可看到更多編輯工具（如上圖）人工編輯按鈕9. Standard輸入分子量標(biāo)準(zhǔn)，軟件自帶有許多Bio-Rad的分子量標(biāo)準(zhǔn)，如你用的是自己的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)入New Standard建立新的分子量標(biāo)準(zhǔn)，軟件可以選擇標(biāo)準(zhǔn)單位是MW（蛋白質(zhì)）還是BP（核酸）等

23、（左下圖）。在Protein-Standard對(duì)話框中輸入分子量數(shù)值，完成后單擊賦值圖標(biāo)（右下圖），回到圖象文件上單擊標(biāo)準(zhǔn)樣品的泳道，軟件自動(dòng)將所輸?shù)姆肿恿繑?shù)值和泳道內(nèi)的條帶一一對(duì)應(yīng)。賦值圖標(biāo)：告訴軟件哪條是分子量標(biāo)準(zhǔn)樣品的泳道輸入分子量數(shù)值10. Band Attribute條帶屬性，在完成第9步以后，軟件已自動(dòng)計(jì)算出了其他未知條帶的分子量,打開band attribute選擇要報(bào)告的參數(shù)，這里我們選擇Molecular Weight，圖象上可以看到所有條帶的分子量（紅顏色標(biāo)記），標(biāo)準(zhǔn)分子量為藍(lán)色標(biāo)記。11. Print Image打印圖象相對(duì)豐度 （純度）分子量條帶號(hào)條帶定量12. All Lane Report所有泳道條帶結(jié)果報(bào)告。打開窗口，選擇要報(bào)告的參數(shù)，如Mol.Wt.（分子量，如左下圖），軟件將報(bào)告結(jié)果（右下圖），在報(bào)告的右下腳有一報(bào)告輸出工具，點(diǎn)擊可將報(bào)告結(jié)果輸出成TXT文本格式或輸出至剪貼板，可粘貼到EXCE