微生物實驗論文

1、摘要取適量的土壤樣品進(jìn)行蒸餾水溶解、富集培養(yǎng)、剛果紅纖維素培養(yǎng)基篩選等操作后，分離出能夠分解纖維素的細(xì)菌和真菌，對這些菌進(jìn)行純培養(yǎng)，觀察其菌落顏色、形態(tài)等特征，并對所得菌用革蘭氏染色法染色。實驗后期分別通過甲基紅試驗、淀粉水解實驗、pH梯度試驗等生理生化反應(yīng)，檢測所得纖維素分解菌在分解過程中是否產(chǎn)酸、能否水解淀粉，以及不同pH值下分解纖維素的能力，為日后進(jìn)一步的研究打下基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞 土壤 纖維素分解菌 分離篩選pH試驗Isolation and Screening of Soil Cellulose-Decomposing MicrobesZhou Yudi, Zhu Liang, Zhu X

2、iaoyu, Zong LuSchool of Life Science, Shandong University, Jinan,250100Corresponding author zhuliang0532AbstractIn our experiment, we took an appropriate amount of soil sample, dissolved them in distilled water, put them in enrichment culture, and then sifted the bacteria and fungus which can break

3、down cellulose by Congo red-cellulose medium. After that, we did the pure cultures to observe the color, shape and some other characteristics of the colonies, moreover, we stained the bacteria we got with Gram stain. Later we did some physiological and biochemical experiments such as methyl red test

4、, amyl hydrolysis experiment and pH gradient test to see whether these bacteria can produce acid, whether they can hydrolyze starch and their ability of breaking down cellulose under different PH valves. We hope that by doing this experiment, we can lay the foundation for further research in the fut

5、ure.Keywords Soil, Cellulose-decomposing microbes, Isolation and screening, PH experiment前言在工業(yè)化水平日益提高、科學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展的今天，我們同時也面臨著世界人口激增、礦產(chǎn)資源枯竭等嚴(yán)峻的問題。保護(hù)環(huán)境資源，尋找可利用的新型能源已成為科學(xué)工作者的新課題。對于人類來說，生物質(zhì)資源是寶貴的可再生資源，是我們賴以生存的基本物質(zhì)資源。據(jù)統(tǒng)計，地球上每年光合作用的產(chǎn)物中，90%以上為木質(zhì)纖維素類物質(zhì)。因此，開發(fā)高效轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素類可再生資源的微生物技術(shù)，將生產(chǎn)生活中產(chǎn)生的工農(nóng)業(yè)廢棄物轉(zhuǎn)化為可利用的新能源，將具有極其

6、重要的意義和廣闊的前景。土壤中的某些微生物有分解纖維素的能力。地球上的植物每年產(chǎn)生的纖維素超過70億噸，其中40%60%能被這些微生物分解利用。微生物分解纖維素主要是因為它們能夠分解纖維素酶。本次試驗就是的目的就是從土壤中將這些能夠分解纖維素的細(xì)菌分離出來，并對它們的形態(tài)特征、生理生化等進(jìn)行研究和探討。1. 土壤中纖維素分解菌的分離及篩選1.1 土樣的采集土壤中的微生物，大約70%-90%是細(xì)菌。細(xì)菌適宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長，絕大多數(shù)分布在距地表約38cm的土壤層。因此，土壤取樣時，一般要鏟去表層土。另外，土樣的采集要選擇富含纖維素的環(huán)境，這是因為在纖維素含量豐富的環(huán)境，通常會聚集

7、較多的分解纖維素的微生物。綜合各種因素，本小組分別從生科院南樓后的花園中和學(xué)生公寓4號樓下的落葉堆下取土壤樣品。1.2 分離與篩選1.2.1 土壤懸液的制備稱取土樣5 g，迅速倒人帶玻璃珠的45 mL無菌水瓶中，振蕩20 min，使土樣充分打散，即成為土壤懸液。1.2.2 富集培養(yǎng)在將樣品稀釋涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基之前，先通過選擇培養(yǎng)增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離到所需要的微生物。富集培養(yǎng)所需要的儀器有：250ml錐形瓶、天平、藥匙、玻璃棒、電爐、搖床、玻璃珠、稱量紙等。選擇培養(yǎng)基的制備比例見下：纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基纖維素粉 5gNaNO31gNa2HPO47H2O

8、 0.5gKH2PO40.9gMgSO47H2O 0.5gKCl 0.5g酵母膏 0.5g水解酪素 0.5g將上述物質(zhì)溶解后,用蒸餾水定容到1000ml按上表比例配制50ml選擇培養(yǎng)基。在250ml錐形瓶中裝入50ml培養(yǎng)基，放56顆玻璃珠，用8層紗布做成瓶塞，將瓶口塞緊，再在瓶塞外包裹兩層牛皮紙，用線繩扎緊，在121下高壓蒸汽滅菌20min。用移液器移取10mL土壤懸液于選擇培養(yǎng)基中，將瓶置于搖床上，在30下振蕩培養(yǎng)34d，至培養(yǎng)基變渾濁。1.2.3 梯度稀釋所需儀器：試管（8支）、移液器、槍頭。需要先經(jīng)高壓蒸氣滅菌的儀器：試管（每只內(nèi)裝9ml蒸餾水）、槍頭（黃色、藍(lán)色）。用量程為1000L

9、的移液管從富集培養(yǎng)土壤液中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無菌水的試管中充分混勻。然后換槍頭從此試管中吸取1ml加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10-1,10-2,10-3,10-4, 10-5,10-6,10-7不同稀釋度的土壤溶液。1.2.4 剛果紅染色法分離所需儀器：無菌培養(yǎng)皿（12個）、涂布器（3個）、移液器、槍頭、溫箱等。 需要滅菌的儀器：無菌培養(yǎng)皿（12個）、涂布器（3個）、移液器、槍頭。(1) 鑒別培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基成分如下：纖維素剛果紅培養(yǎng)基（NH4）2SO4 2.0gMgSO47H2O 0.5g（或MgSO4 0.25g）KH2PO40.5gNaCl

10、0.1g纖維素 2.0g剛果紅 0.4g瓊脂 20g水 1000mLpH 7.0（2）涂布平板釋倍數(shù)分別為105、106、107的樣品溶液涂布到纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)34 d（3）菌落形態(tài)觀察選取一株生長較好的白色菌株（菌1）和一株粉紅色菌株（菌2）和一株水解圈非常明顯的菌株（菌3）和一株黃色真菌（菌4）進(jìn)行劃線分離。（4）劃線分離將步驟(1)中的鑒別培養(yǎng)基加熱熔化后倒入4個無菌平皿中，凝固后，用接種環(huán)挑取(3)中4種菌落在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)，至長出單菌落。2. 革蘭氏染色及菌種保存1. 革蘭氏染色基本原理：革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)

11、家Christain Gram氏創(chuàng)立的，而后一些學(xué)者在此礎(chǔ)上作了某些改進(jìn)。革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中最重要的鑒別染色法。革蘭氏染色法的基本步驟是：先用初染劑結(jié)晶紫進(jìn)行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脫色，最后用復(fù)染劑(如番紅)復(fù)染。經(jīng)此方法染色后，細(xì)胞保留初染劑藍(lán)紫色的細(xì)菌為革蘭氏陽性菌；如果細(xì)胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細(xì)菌染上復(fù)染劑的顏色(紅色)，該菌屬于革蘭氏陰性菌。革蘭氏染色的主要原理是由于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在化學(xué)組成和生理性質(zhì)上有很多差別，染色反應(yīng)不一樣?，F(xiàn)在一般認(rèn)為革蘭氏陽性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢，不易脫色，陰性菌復(fù)合物

12、結(jié)合程度底，吸附染料差，易脫色，這是染色反應(yīng)的主要依據(jù)。另外，陽性菌菌體等電點較陰性菌為低，在相同PH條件下進(jìn)行染色，陽性菌吸附堿性染料很多，因此不易脫去，陰性菌則相反。所以染色時的條件要嚴(yán)格控制。例如，在強(qiáng)堿的條件下進(jìn)行染色，兩類菌吸附堿性染料都多，都可呈正反應(yīng)；PH很低時，則可都呈負(fù)反應(yīng)。此外，兩類菌的細(xì)胞壁等對結(jié)晶紫碘復(fù)合物的通透性也不一致，陽性菌透性小，故不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色。所以脫色時間，脫色方法也應(yīng)嚴(yán)格控制。所需儀器或試劑：菌種1，2的平板培養(yǎng)物、革蘭氏染色液（結(jié)晶紫碘液，番紅染液）、顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環(huán)、雙層瓶（內(nèi)裝香柏油和二甲苯）、擦鏡紙、蒸餾水等。操作步

13、驟：制片（涂布、干燥、固定）結(jié)晶紫初染12min，水洗碘液媒染1min，水洗乙醇脫色30s，水洗番紅復(fù)染1min，水洗干燥鏡檢，油鏡觀察。鏡檢結(jié)果見表1和圖1、2、3、4。表1 革蘭氏染色結(jié)果（“+”表示陽性，“”表示陰性）陰性/陽性白色菌（菌1）粉色菌（菌2）+水解圈菌（菌3）黃色菌（菌4）+圖1 黃色菌（菌4）圖2白色菌（菌1）圖3 粉色菌（菌2）圖4 水解圈菌（菌3）2. 菌種保存斜面（CMC培養(yǎng)基：NaCl 6.0g，MgSO47H2O 0.1g、KH2PO4 0.5g、CaCl20.1g、K2HO4 2.0g、CMC15g、（NH4）2SO4 2.0g、pH7.07.4、水1000m

14、L。配好后，滅菌 121，20min）馬鈴薯培養(yǎng)基（馬鈴薯20g、蔗糖 2g、自來水 100mL、瓊脂 2g、pH 自然（約6.0）、滅菌 121，20min）將分離得到的3種菌白色菌株（菌1）、粉紅色菌株（菌2）、水解圈非常明顯的菌株（菌3）分別接種在六個試管中CMC斜面上，用于菌種保存和生理生化試驗。黃色真菌（菌4）接種在馬鈴薯培養(yǎng)基斜面上。3. 生理生化鑒別反應(yīng)3.1 淀粉水解實驗3.1.1方法（1）培養(yǎng)基成分：蛋白胨1g , NaCl 0.5g，牛肉膏0.5g，可溶性淀粉0.2g，瓊脂1.52.0g，蒸餾水100mL，高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)121滅菌20min.（2）滅菌后,將試劑瓶取出,冷

15、卻至50左右，無菌操作制成平板。用記號筆在平板底部劃成4部分，將黃色菌、白色菌、粉色菌和x菌（在剛果紅培養(yǎng)基上出現(xiàn)透明圈的菌）分別在不同的部分劃線接種，在平板的反面分別在4部分寫上菌名，將平板倒置在30溫箱中培養(yǎng)3天。（3）將所有的培養(yǎng)物放入37中培養(yǎng)48h后取出，觀察各種菌的生長情況。關(guān)產(chǎn)淀粉培養(yǎng)物中菌長的程度，打開平板蓋子，滴入少量碘液于平板中，輕輕旋轉(zhuǎn)平板，使碘液均勻鋪滿整個平板。觀察菌苔周圍有無出現(xiàn)無色透明圈以及透明圈的大小。3.1.2結(jié)果見圖5，表2圖5 淀粉水解實驗結(jié)果表2淀粉水解實驗結(jié)果（“+”表示陽性，“”表示陰性）項目水解結(jié)果黃色菌（菌4）+白色菌（菌1）+粉色菌（菌2）水解

16、圈菌（菌3）+結(jié)果分析：其中，加入碘液后不久，黃色菌和x菌就出現(xiàn)明顯的水解圈，不久，白色菌也出現(xiàn)水解圈。水解圈大小為：黃色菌 x菌白色菌3.2 甲基紅實驗3.2.1方法（1）培養(yǎng)基成分：蛋白胨1.25g，葡萄糖1.25g，K2HPO40.5g,量取蒸餾水250mL，放入燒杯中，加熱攪拌并溶解，調(diào)整pH為7.07.2，分裝試管，每管10mL，112滅菌30min（2）滅菌后，取出培養(yǎng)液，冷卻后將大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌以無菌操作接種于培養(yǎng)基中，放入30恒溫箱中培養(yǎng)3天。(3)將1支葡萄糖蛋白胨水溶液培養(yǎng)基培養(yǎng)物內(nèi)加入甲基紅試劑2滴，培養(yǎng)基變?yōu)榧t色這為陽性，變?yōu)辄S色的為陰性。注意：甲基紅試劑不能加的太

17、多，否則會有假陽性出現(xiàn)。3.2.2結(jié)果圖6 甲基紅實驗結(jié)果表3甲基紅實驗結(jié)果（“+”表示陽性，“”表示陰性）名稱 結(jié)果黃色菌（菌4）白色菌（菌1）粉色菌（菌2）+水解圈菌（菌3）+結(jié)果分析：見圖6，表3滴入甲基紅試劑后，培養(yǎng)黃色菌和白色菌的培養(yǎng)液變?yōu)辄S色，而培養(yǎng)粉色菌和x菌的培養(yǎng)液成為紅色，這說明了四種細(xì)菌在培養(yǎng)的早期均產(chǎn)生有機(jī)酸，但粉色菌和x菌在培養(yǎng)后期仍能維持酸性pH4，而黃色菌和白色菌則轉(zhuǎn)化有機(jī)酸為非酸性末端產(chǎn)物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大約6。因此，粉色菌和x菌為陽性，黃色菌和白色菌為陰性。3.3不同pH對菌生長的影響3.3.1方法（1）培養(yǎng)基成分：無機(jī)鹽營養(yǎng)液1000mL（KH2

18、PO42g、MnSO4 1.6mg、ZnCl2 1.7mg、CoCl2 2.0mg、（NH4）2SO41.4g、MgSO47H2O 0.3g、CaCl20.3g、FeSO4 5mg、水1000mL，pH 5.5）于直徑為1.5cm、長15cm的試管中加入上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基5mL，加入一條去淀粉處理的濾紙（6cm1cm）垂直于試管中，用酸和堿調(diào)整它們的pH值，使之pH分別約為4，5，6，7，8，9，10，并做好標(biāo)記。放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)112滅菌30min。（2）滅菌后，在無菌條件下，將黃色菌接種于其中，再放入30恒溫箱中培養(yǎng)3天。3.3.2結(jié)果在以濾紙條為唯一碳源情況下，不同pH值對黃色菌分解纖

19、維素的酶有較大影響，pH為6的試管中濾紙的絮狀沉淀最多，其次為pH為5，7，8，4.當(dāng)pH為9和10時幾乎看不到絮狀沉淀，說明黃色菌在此條件下纖維素分解酶活性最低?？傮w，黃色菌在不同pH條件下纖維素分解酶活性大小為pH6pH5pH7pH8pH4。其中pH9和pH10時，其酶已經(jīng)基本失活。見圖7。圖7 從左至右pH分別為4，5，6，7，8，9，104. 結(jié)果與分析4.1結(jié)果在菌種篩選中，取土壤懸液于富集培養(yǎng)基中，將其置于搖床上富集培養(yǎng)了三天，一開始由于稀釋倍數(shù)太小導(dǎo)致初篩得到的菌落長勢不好，菌落又小又密。于是，我們重新做了稀釋，最終選擇稀釋了105，106，107 倍等稀釋倍數(shù)較大的富集液用涂布器涂布在纖維素剛果紅平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)了三天后觀察到較明顯的四種菌落，粉紅色菌落，黃色菌落，白色菌落和產(chǎn)生有水解圈的X菌。將它們再次接種到纖維素剛果紅培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)篩培養(yǎng)。之后接種到土豆培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)。最后進(jìn)行鑒定和做生理生化實驗。剛果紅纖維素培養(yǎng)基作為篩選菌種的培養(yǎng)基，可以很快識別出菌種講解纖維素能力的高低，大大方便了篩選得到較純菌種的工作。但是染料濃度的高低、每個培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基的多少常常會導(dǎo)致培養(yǎng)基本身的背景值大小有所差異，因此限制了觀察的效果。不同菌株對纖維素類物質(zhì)的分解能力不一樣。在同一個培養(yǎng)