空間微重力環(huán)境對人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞的影響初探_圖文

1、近年來,隨著空間技術(shù)的發(fā)展,國內(nèi)外有關(guān)研究表明。空間環(huán)境可以改變動物細(xì)胞的生物性狀和發(fā)育,空間微重力環(huán)境可為細(xì)胞提供特殊的三維培養(yǎng)空間,這為組織工程學(xué)研究提供了新的實(shí)驗(yàn)條件1,因此,空間組織工程應(yīng)運(yùn)而生?？臻g生物學(xué)近年來也取得了一些進(jìn)展,國內(nèi)外學(xué)者對各種組織細(xì)胞進(jìn)行了空間微重力研究,但在這一領(lǐng)域?qū)ρ例X細(xì)胞的報道較少,尤其是對人類牙齒細(xì)胞的研究尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)將人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞搭載宇宙飛船進(jìn)入空間環(huán)境,回收細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng),以探索其在經(jīng)歷空間環(huán)境后是否能夠成活及細(xì)胞形態(tài)、功能、細(xì)胞骨架發(fā)生的改變?？臻g微重力環(huán)境對人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞的影響初探張鋒1,2,鄧旭亮2,梅芳3,王新知21.武警北京總隊第二

2、醫(yī)院口腔科,北京1000372.北京大學(xué)口腔醫(yī)院,北京1000813.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部解剖與組織胚胎學(xué)系,北京100083摘要通過實(shí)際空間搭載實(shí)驗(yàn),研究空間環(huán)境對人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞的影響。將人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞無源(細(xì)胞保存于密閉環(huán)境條件中,沒有細(xì)胞培養(yǎng)所需的5%CO2、37、飽和濕度標(biāo)準(zhǔn)條件的適宜環(huán)境搭載長征2號飛船進(jìn)入空間環(huán)境,空間飛行時間為17d,返回地面后,繼續(xù)培養(yǎng)成活并傳代,觀察其細(xì)胞骨架的改變。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示:空間實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞骨架出現(xiàn)彌散性的變化,局部微絲解聚。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞經(jīng)歷空間飛行后可以繼續(xù)成活,并且細(xì)胞骨架發(fā)生了明顯改變。關(guān)鍵詞人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞;空間環(huán)境;細(xì)

3、胞骨架中圖分類號R85文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號1000-7857(200702-0034-04Periminary Study on the Effect of Space Environments on the Human Dental Pulp Stroma CellsZHANG Feng1,2,DENG Xuliang2,MEI Fang3,WANG Xinzhi21.Department of Stomatology,The2nd Hospital of Beijing Armed Police Force,Beijing100037,China2.School and Hospital

4、of Stomatology,Peking University,Beijing100081,China3.Department of Anatomy and Histio-embryology,Peking University,Beijing100083,ChinaAbstract:The effects of space environments on the human pulp stroma cells are studied by putting them into a real outer space environment.The human pulp stroma cells

5、 are put on board of a spacecraft for17days,and then are cultivated continually after they have returned to the earth.The changes of the cells cytoskeleton are observed under laser scanning confocal microscopy.The result shows that human pulp stroma cells can survive the spaceflight and the space en

6、vironment can significantly alter the human pulp stroma cells cytoskeleton.Key Words:human pulp stroma cells;space environments;cells cytoskeletonCLC Number:R85Doumen Coder:A Article ID:1000-7857(200702-0034-04收稿日期:2006-12-14基金資助:國家自然科學(xué)基金科學(xué)部主任基金(3044008203作者簡介:張鋒,女,北京市西城區(qū)月壇北街丁3號武警北京總隊第二醫(yī)院口腔科,主治醫(yī)師,主要

7、研究方向?yàn)榭谇恍迯?fù)學(xué);E-mail:zf3164王新知(通訊作者,女,北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街北京大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科,教授,主要研究方向?yàn)榭谇恍迯?fù)學(xué);E-mail:xinzwang1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞來源于北大口腔醫(yī)院因正畸目的而拔除的健康青少年的雙尖牙(經(jīng)患者同意,患牙無齲,無牙髓病變,無牙周病變。-MEM 培養(yǎng)基(Gibco 公司、胎牛血清(Hyclone 公司、HEPES (Sigma 公司、胰蛋白酶(Sig-ma 公司、青霉素鈉、鏈霉素(華北制藥股份有限公司、細(xì)胞保護(hù)劑、微載體(見圖1,圖2及特制試管由中日友好醫(yī)院惠贈。1.2實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器包括超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)公

8、司、CO 2恒溫培養(yǎng)箱(Forma 公司、Labofuge 400R 型低溫離心機(jī)(Heraeus 公司、LD4-2A 型離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠、電子天平(OHAUS 、光學(xué)顯微鏡(OLYM-PAS 公司、倒置相差顯微鏡(NIKON 公司、數(shù)碼照相機(jī)(OLYMPAS 公司。1.3人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞的獲得和培養(yǎng)征得患者同意,將因正畸需要而拔除的健康年輕恒牙用含雙抗的生理鹽水沖洗后置于-MEM 培養(yǎng)液中,離體后4h 之內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室處理。在無菌操作間內(nèi),在無菌狀態(tài)下劈開離體牙,將冠根髓組織取出,在培養(yǎng)液浸潤下剪成1mm 3大小的碎塊均勻平鋪于的6孔培養(yǎng)板中,加入-MEM 培養(yǎng)液,放入恒溫培養(yǎng)箱中(

9、37,5%CO 2,3d 后小心換液,防止沖起組織塊。約1421d后可看到組織塊周圍有細(xì)胞爬出。細(xì)胞貼壁后57d 鋪滿瓶底的80%時,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。棄去原培養(yǎng)液,用0.01mol/LPBS 洗滌1次,加入0.25%胰蛋白酶,倒置相差顯微鏡下觀察,35min 后可見大多數(shù)細(xì)胞已收縮近圓形時加入等量含血清的-MEM 培養(yǎng)液終止消化。用尖吸管反復(fù)輕輕吹打培養(yǎng)瓶底壁,制成細(xì)胞懸液,離心1000rpm ×3min 。棄上清,加入含血清的-MEM 培養(yǎng)液重新懸浮,以1:3比例傳代,接種于新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。選取第45代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)。1.4實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置1.5人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞搭載

10、飛船進(jìn)入空間環(huán)境人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞搭載長征2號返回式衛(wèi)星于2004年9月30日發(fā)射升空,在空間飛行17d ,返回地面48h 內(nèi)將細(xì)胞取回實(shí)驗(yàn)室。1.6人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞返回地面后發(fā)生的形態(tài)改變1.6.1肉眼及倒置相差顯微鏡下觀察空間及地面組細(xì)胞狀態(tài)觀察試管中培養(yǎng)液顏色,然后將空間細(xì)胞及地面對照組細(xì)胞從特制試管轉(zhuǎn)移至六孔板中,倒置顯微鏡下觀察。1.6.2將空間組和地面組細(xì)胞復(fù)溫,同時復(fù)蘇冰凍保存的正常組細(xì)胞將空間組細(xì)胞及地面對照組細(xì)胞更換條件培養(yǎng)液(原細(xì)胞升空前細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液過濾后加入特殊培養(yǎng)液,比例為1:5,置于37,5%CO 2飽和濕度恒溫箱中復(fù)溫24h 。與此同時,復(fù)蘇冰凍保存的正常牙髓間

11、充質(zhì)細(xì)胞。1.6.3將3組細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)并傳代1.6.4細(xì)胞激光共聚焦顯微鏡觀察羅丹明標(biāo)記的細(xì)胞骨架。激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架之前需先將細(xì)胞用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色,染色步驟:PBS 洗35min ;PBS 稀釋的3.7%的甲醛浸泡10min ;PBS 洗35min ;0.1%Triton (PBS 配制洗5min ;PBS 洗35min ;1%BSA (PBS 配制洗30min ;PBS 洗35min ;10"l 羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽混勻,室溫避光處理細(xì)胞樣品20min ;PBS 洗1次5min ;甘油封片劑封片。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1肉眼觀察結(jié)果肉眼可見空間組培養(yǎng)液顏色呈淺紫粉紅

12、色,pH 值8.0左右。倒置顯微鏡下觀察可見空間組細(xì)胞從微載體上脫落的死細(xì)胞較多,細(xì)胞多呈皺縮狀(見圖3,圖4,圖2微載體(1×200Fig.2The microcarrier(1×200圖1微載體(1×100Fig.1The microcarrier (1×100空間飛行組地面對照組正常對照組培養(yǎng)基特殊培養(yǎng)液特殊培養(yǎng)液-MEM 培養(yǎng)液加DMSO 保存容器特制試管(放入高品質(zhì)保溫杯中特制試管(放入高品質(zhì)保溫杯中凍存管保存條件空間環(huán)境冰箱4及常溫(晝伏夜出-196液氮罐冰凍保存實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置見表1。表1實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置Table 1Experiment grou

13、ps圖7正常對照組細(xì)胞倒置顯微鏡下形態(tài)(1×200Fig.7Normal control cells under inverted microscope (1×200而地面對照組細(xì)胞則與微載體結(jié)合良好較少脫落。2.2倒置顯微鏡下觀察結(jié)果1周后鏡下觀察,空間及地面組均有細(xì)胞貼壁生長,地面組細(xì)胞貼壁較早且顯著多于空間組細(xì)胞。與此同時,復(fù)蘇培養(yǎng)冰凍保存的正常組細(xì)胞。20d 后3組細(xì)胞均消化傳代培養(yǎng),3組細(xì)胞的鏡下形態(tài)無顯著區(qū)別,空間組細(xì)胞形態(tài)略顯細(xì)小,生長傳代稍慢,顆粒較多(見圖5圖7。2.3激光共聚焦顯微鏡下顯示的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)空間組細(xì)胞與地面及正常對照組相比,微管及微絲發(fā)生解聚

14、,有序度降低,微管變短,熒光染色減弱,細(xì)胞周邊胞膜不完整。地面及正常對照組細(xì)胞骨架清晰,熒光染色強(qiáng),微管微絲粗大,排列整齊有序(見圖8圖10。3討論以往空間搭載實(shí)驗(yàn)證明,微重力和空間輻射可以改變細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)2,細(xì)胞骨架系統(tǒng)對微重力環(huán)境非常敏感3;可能參與微重力導(dǎo)致的細(xì)胞形態(tài)功能變化過程4,細(xì)胞可通過細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞骨架系統(tǒng),協(xié)同化學(xué)信號傳導(dǎo)通路將重力變化的刺激級聯(lián)傳遞到細(xì)胞核,激發(fā)相關(guān)基因表達(dá)變化,進(jìn)而影響細(xì)胞功能5-6。Infanger M.7通過模擬微重力促進(jìn)人類上皮細(xì)胞凋亡的研究表明模擬微重力可以導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(extracellular matrix proteins,簡稱ECM

15、P增加,改變細(xì)胞骨架組分(如alpha 微管蛋白和中間絲,誘導(dǎo)凋亡。Grimm D.8發(fā)現(xiàn)回轉(zhuǎn)器模擬失重可誘導(dǎo)濾泡性甲狀腺癌細(xì)胞的凋亡。Dai Z.Q.9的研究也表明,在微重力下細(xì)胞骨架微絲解聚。細(xì)胞骨架系統(tǒng)是重力的感受器,在重力條件下,細(xì)胞骨架同細(xì)胞的形態(tài)、功能、信號傳導(dǎo)等相關(guān),但細(xì)胞骨架與基因傳導(dǎo)之間的關(guān)系尚不清楚10。在本實(shí)驗(yàn)中,空間組細(xì)胞返回地面后,在與對照組細(xì)胞同時培養(yǎng)的過程中,倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)空間組細(xì)胞死細(xì)胞較多,細(xì)胞生長傳代較慢,細(xì)胞形態(tài)較為細(xì)小,細(xì)胞內(nèi)顆粒較多。采用激光共聚焦顯微鏡同時檢測了地面、正常對照組和空間組細(xì)胞微絲骨架結(jié)構(gòu)的變化,發(fā)現(xiàn)人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞在經(jīng)歷空間環(huán)境之后,

16、細(xì)胞骨架胞圖3游離于微載體之外的太空組細(xì)胞(1×100Fig.3Space control cells dissociated from the microcarrier (1×100圖4游離于微載體之外的太空組細(xì)胞(1×200Fig.4Space control cellsdissociated from the microcarrier (1×200圖5太空組細(xì)胞倒置顯微鏡下形態(tài)(1×200Fig.5Space control cells under inverted microscope(1×200圖6地面對照組細(xì)胞倒置顯微鏡下

17、形態(tài)(1×200Fig.6Ground controlcells under inverted microscope (1×200圖8激光共聚焦顯微鏡下空間組細(xì)胞骨架形態(tài)Fig.8Space control cells under the confocal microscopy圖10激光共聚焦顯微鏡下正常對照組細(xì)胞骨架形態(tài)Fig.10Normal control cells under the confocal microscopy圖9激光共聚焦顯微鏡下地面組細(xì)胞骨架形態(tài)Fig.9Ground control cells under the confocal microsc

18、opy膜不完整,細(xì)胞骨架出現(xiàn)彌散性變化,局部微絲解聚,張力纖維減少、骨架蛋白彌散分布、細(xì)胞骨架的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)消失;而對照組細(xì)胞的微絲骨架排列有序、粗細(xì)均勻、走向清晰,微管束粗長整齊,熒光染色強(qiáng),說明人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞骨架對空間微重力環(huán)境敏感,空間微重力環(huán)境可以破壞人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞骨架,促進(jìn)其凋亡。本實(shí)驗(yàn)屬于無源搭載,即將細(xì)胞保存于密閉環(huán)境條件中,沒有細(xì)胞培養(yǎng)所需的適宜環(huán)境5%CO2、37、飽和濕度標(biāo)準(zhǔn)條件。細(xì)胞要經(jīng)歷空間微重力和空間射線輻射,以及宇宙飛船升空過程中的溫度變化,這些因素對細(xì)胞的生長狀態(tài)及基因都可能會有所影響,所以,筆者設(shè)置了地面對照組(除沒有經(jīng)歷空間環(huán)境之外其他條件均相同與空間組

19、相對照。為了盡量排除細(xì)胞受溫度變化的影響,將細(xì)胞保存于高品質(zhì)的保溫杯中以隔絕溫度變化。正常對照組采用與空間及地面對照組同源同代的細(xì)胞,并利用液氮深低溫冰凍保存,這就保證了細(xì)胞處于同一代次,國外已有學(xué)者證實(shí)深低溫保存是可以保持細(xì)胞生長分化特性的11-12?？臻g的特殊微重力環(huán)境,可以為細(xì)胞提供一個不受重力約束的三維生長空間,這是在地面上無法實(shí)現(xiàn)的?，F(xiàn)有的各種組織工程材料都或多或少地有一些不利于細(xì)胞生長的因素,移植入體內(nèi)會使機(jī)體產(chǎn)生排斥反應(yīng),而空間環(huán)境本身提供的三維生長空間,可以使細(xì)胞不借助支架材料生長,這為牙組織工程提供了新的思路和線索。目前的空間實(shí)驗(yàn)研究大多是空間環(huán)境對植物或?qū)δ[瘤細(xì)胞的影響,而

20、空間環(huán)境也可能會使人類正?；虬l(fā)生改變,牙髓是較易得到的正常細(xì)胞的樣本,牙髓基因的改變可以作為研究空間環(huán)境對人類正?；蛴绊懙难芯枯d體?？臻g特殊的空間環(huán)境可以改變生物體基因表達(dá)而誘發(fā)變異,這種變異可能是有益的也有可能是有害的,通過實(shí)驗(yàn)研究,可以探索充分利用空間環(huán)境得天獨(dú)厚的優(yōu)勢,誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞向我們所期望的方向去增殖分化,牙髓干細(xì)胞有望成為一個較易得到的干細(xì)胞庫的種子來源。此外,隨著人類對空間的探索,世界各國都加快了空間研究的腳步,越來越多的宇航員進(jìn)入空間環(huán)境,空間環(huán)境對宇航員機(jī)體的影響也越來越受到關(guān)注。牙齒是人類生活的重要器官之一,對生活質(zhì)量有著很大的影響,為保證宇航員在空間探索工作的順利進(jìn)行

21、,空間環(huán)境對牙齒的影響應(yīng)該受到關(guān)注和深入的研究。4結(jié)論將人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞搭載宇宙飛船進(jìn)入太空,回收細(xì)胞后,繼續(xù)培養(yǎng)成活,對經(jīng)歷空間微重力環(huán)境之后的人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)特性有了初步的了解,發(fā)現(xiàn)空間環(huán)境能使人牙髓間充質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)、功能、細(xì)胞骨架發(fā)生改變,為進(jìn)一步利用空間平臺研究牙組織工程提供了線索。參考文獻(xiàn)(References1蔡哲,張嵐,舒峻,等.空間生物技術(shù)在干細(xì)胞和組織工程學(xué)研究中的應(yīng)用J.中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2004,10(1:9-10.CAI Zhe,ZHANG Lan,SHU Jun,et al.The application of space biotechnology in th

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