氨基酸分析方法包測定飼料中氨基酸

1、 Venusil AA氨基酸分析方法包測定飼料中氨基酸馬淑偉李倩楊定忠朱旭東孫永超(天津博納艾杰爾科技有限公司摘要:氨基酸分析是飼料中含氮量測定和蛋白質(zhì)含量測定的一種重要輔助手段,隨著反相色譜技術(shù)的發(fā)展,采用反相HPLC色譜測定氨基酸越來越普遍。本文使用Venusil-AA氨基酸分析方法包建立了飼料中氨基酸分析的HPLC方法,在50-1250nmol/mL的濃度范圍內(nèi),18種氨基酸具有良好的線性范圍,相關(guān)系數(shù)r大于0.999,檢測限約為5pmol,具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性,并且通過使用不同的HPLC儀器驗證了該方法具有良好的耐用性。1 實驗部分1.1 儀器高效液相色譜儀(配制要求:可梯度洗脫,

2、紫外檢測,可控柱溫; Venusil-AA氨基酸分析方法包(天津博納艾杰爾科技,包括:Venusil AA氨基酸分析專用柱1支,4.6×250mm, 5m;PITC異硫氰酸苯酯衍生劑10瓶,25L/瓶;含17種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液2瓶,2mL/瓶;內(nèi)標(biāo)物正亮氨酸1瓶,100mg/瓶;衍生溶媒三乙胺2瓶,1.4mL/瓶;塑料離心管,1.5mL;實驗室用樣品粉碎機;樣品篩: 孔徑0.25mm;離心機;真空泵;恒溫干燥箱;水解管:安瓿瓶體積2030mL(用去離子水沖洗干凈并烘干;氮吹儀,噴燈等鹽酸(優(yōu)級純;無水醋酸鈉(分析純;冰醋酸(分析純;乙腈(色譜純;去離子水;苯酚(蒸餾;高純氮氣(純度9

3、9.99%;冷凍劑(市售食鹽與冰按1:3混合1.3. 液相色譜條件色譜柱:Venusil-AA氨基酸分析專用柱(100Å,4.6mm×250mm ,5m檢測波長:254 nm;柱溫:40流動相A:稱取15.2g無水醋酸鈉,加水1850mL,溶解后用冰醋酸調(diào)pH至6.5,然后加乙腈140mL,混勻,用0.45µm濾膜過濾。流動相B:80%(V/V乙腈溶液,進樣量:2µL流速:1mL/min,梯度洗脫(不同色譜儀器,梯度洗脫條件略有不同,見表1 表1 不同色譜儀器洗脫梯度程序(不同型號儀器梯度條件略有不同:時間(min B(%時間(minB(%時間(minB

4、(%時間(minB(%時間(minB(%0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 1 2 0 2 0 11 7 14 20 12 4 15 10 14 7 13.9 12 33 34 15 20 25 30 29 30 14 15 33.02 100 24.5 20 33 45 32 50 29 34 41 100 27 100 33.1 100 33 100 29.02 100 41.02 033 100 38 100 39 100 37 100 49 0 33.1 0 38.1 0 39.1 0 37.02 045 0 45 0 45 0 45 0普析通用公司L6-2高效液相色譜儀Agi

5、lent 1100HPLC島津LC-20ADHPLC島津LC-10AD/ATHPLCWaters 1525HPLC1.4.1 0.1mol/L鹽酸溶液:量取9.0mL濃鹽酸,加去離子水稀釋至1000mL。1.4.2 正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液:稱取正亮氨酸約10mg,加0.1mol/L 鹽酸溶液 10mL溶解,混勻。1.4.3 三乙胺乙腈溶液:取三乙胺1瓶,加乙腈8.6mL,混勻。1.4.4 異硫氰酸苯酯乙腈溶液:取異硫氰酸苯酯1瓶,加乙腈2mL,混勻。1.4.5 6mol/L鹽酸(含0.1%苯酚:稱取苯酚20mg,加濃鹽酸10mL和水10mL溶解,混勻。1.4.6 混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(標(biāo)液氨基酸濃度見

6、表2:準(zhǔn)確量取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0mL,置于5mL容量瓶中,加0.1mol/L鹽酸溶液定容至刻度。(該溶液在4°C可保存2個月,在-20°C 下可保存6個月。1.4.7異硫氰酸苯酯乙腈溶液:取異硫氰酸苯酯1瓶,加乙腈2mL,混勻。 表2 Venusil-AA氨基酸分析方法包中的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中各氨基酸濃度氨基酸分子量濃度(mol/mL濃度(g/mL稀釋5倍的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(g/mL由于在酸水解過程中,色氨酸(Trp幾乎被破壞,因此如需測定色氨酸,則應(yīng)采用堿水解法來水解樣品。Venusil-AA氨基酸分析方法包的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中不含有色氨酸,如要測定色氨酸,需單獨購買,用

7、前配制。1.5 樣品制備準(zhǔn)確稱取適量飼料(使樣品中需測定的單個氨基酸含量在510mg或總氨基酸含量在100-150mg范圍內(nèi),置于燒杯中,加0.1 mol/L鹽酸30mL,攪拌提取15 min,靜置5分鐘,將上清液過濾到100 mL容量瓶中,殘渣加0.1 mol/L鹽酸25mL,攪拌3 min,重復(fù)提取兩次,再將上清液過濾到上述容量瓶中,用水沖洗濾紙上的殘渣,收集濾液并加0.1mol/L鹽酸定容至刻度,搖勻。1.5.2 飼料水解氨基酸含量測定樣品溶液制備1.5.2.1 酸水解法: 準(zhǔn)確稱取一定量樣品,使樣品氨基酸總量在5075mg范圍內(nèi), 置于20-30mL安瓿瓶中,加入10mL含0.1%苯酚

8、的6mol/L鹽酸, 振搖使樣品溶解或使樣品均勻分散于溶液中,將安瓿瓶置-20冰箱中冷凍35min,充氮后用噴燈熔封,然后置110±1烘箱中水解24小時, 取出冷卻,打開安瓿瓶,將水解液全部轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶內(nèi),用超純水或去離子水定容至刻度,混勻, 供衍生使用。1.5.2.2 堿水解法:準(zhǔn)確稱取一定量樣品,使樣品氨基酸總量在5075mg范圍內(nèi),置于聚四氟乙烯襯管中,加4mol/L氫氧化鋰溶液(稱取一水合氫氧化鋰16.78 g ,用水溶解并稀釋至100 mL,使用前取適量超聲或通氮脫氣 1.50 ml,于液氮中冷凍,而后將襯管插入水解玻管,抽真空至7Pa(510-2,mm汞柱,封管。

9、然后,將水解管放入(110士1恒溫干燥箱,水解20小時。取出水解管,冷至室溫,開管,將水解液定量地轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶中,加入6mol鹽酸溶液1.00 mL中和,并加水定容刻度。用0.45 m濾膜過濾后,取清液貯于冰箱中,供衍生使用。(注:若樣品顆粒較大,則在稱樣前應(yīng)對樣品粉碎,過孔徑為0.25mm的樣品篩,并充分混勻。另外若在試樣提取過程中,過濾太慢,也可離心10 min (4000 r/min。1.5.3 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的衍生準(zhǔn)確量取樣品溶液200L,置1.5mL塑料離心管中,準(zhǔn)確加入20L正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液,混勻,加220L 0.1mol/L鹽酸溶解,加入三乙胺乙腈溶液100L,

10、異硫氰酸苯酯乙腈溶液100L,混勻,室溫放置1小時,然后加入正己烷400L,振搖后放置10分鐘,取下層溶液,用0.45µm濾器過濾。另準(zhǔn)確量取混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液200L,置于1.5mL塑料離心管中,準(zhǔn)確加入20L正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液,混勻,加入三乙胺乙腈溶液100L,異硫氰酸苯酯乙腈溶液100L,混勻,室溫放置1小時,然后加入正己烷400L,振搖后放置10分鐘,取下層溶液,用0.45µm濾器過濾。 2 結(jié)果和分析2. 1專屬性 圖1 專屬性驗證圖譜出峰順序:1 Asp(門冬氨酸2 Glu(谷氨酸3 Ser(絲氨酸4 Gly(甘氨酸5 His(組氨酸6 Arg (精氨酸7 Thr

11、(蘇氨酸8 Ala(丙氨酸9 Pro(脯氨酸 10 NH3 (氨 ?11 Tyr(酪氨酸 12 Val(纈氨酸 13 Met(蛋氨酸 14 Cy2(胱氨酸 15 Ile(異亮氨酸 16 Leu(亮氨酸 17 Nle(正亮氨酸(內(nèi)標(biāo) 18 Phe(苯丙氨酸 19 Trp(色氨酸 20 Lys(賴氨酸專屬性實驗結(jié)果表明,包括氨及內(nèi)標(biāo)物在內(nèi)的20種氨基酸得到完全分離,相鄰氨基酸峰之間均達到基線分離,分離度均大1.5,本方法具有良好的專屬性。2.2 線性范圍及檢測限表3 線性范圍和檢測限數(shù)據(jù)Glu 50-1250Y=1186.4X-19.625, r=0.9995 5.6 Ser 50-1250Y=1

12、013X-15.56, r=0.9997 5.1 Gly 50-1250Y=929.56X-8.69,r=1.000 4.6 His 50-1250Y=947.35X-6.0674,r=1 5.0 Arg 50-1250Y=958.73X-14.17, r=0.9998 4.4 Thr 50-1250Y=1000.3X-18.106, r=0.9998 5.1 Ala 50-1250Y=934.8X-7.37, r=0.9999 4.7 Pro 50-1250Y=856.34X-11.96, r=0.9999 3.9 Tyr 50-1250Y=825.57X-8.96,r=1 3.6 Val

13、50-1250Y=845.34X-9.88, r=0.9999 3.7 Met 50-1250Ile 50-1250Y=821.02X+7.97,r=1 4.0 Leu 50-1250 Phe 50-1250Y=838.76X-7.74,r=1 3.5 Trp 50-1250Y=746.83X-9.717,r=1 2.9 Lys 50-1250在50-1250nmol/mL的濃度范圍內(nèi),18種氨基酸具有良好的線性范圍,相關(guān)系數(shù)r大于0.999,檢測限約為5pmol。表4 進樣重復(fù)性數(shù)據(jù)氨基酸保留時間RSD%(n=6氨基酸峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積RSD%(n=6 2.3.2衍生重復(fù)性(同一份樣品重復(fù)衍

14、生6份,分別進樣測定表5 衍生重復(fù)性數(shù)據(jù)氨基酸氨基酸峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積RSD%(n=6Nle 0Lys 0.61 重復(fù)性試驗結(jié)果表明:重復(fù)性良好,18種氨基酸保留時間RSD<0.2%,各氨基酸峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值的RSD<1%,18種氨基酸的衍生重復(fù)性RSD<1%。 結(jié)果表明,除胱氨酸外,其他氨基酸的衍生物在室溫下可穩(wěn)定24小時,衍生可靠 圖2 采用不同HPLC 儀器驗證耐用性譜圖由圖2可以看出:采用不同品牌的高效液相色譜儀進行分析,均可獲得良好的分離效果,表明該方法具有良好的耐用性。2.6 飼料氨基酸分析測定了市售兔肉肥飼料和益多快長素飼料,分別酸水解和堿水解后測定其氨基酸含量,結(jié)果見圖3 圖3 兔肉肥飼料的氨基酸分析圖譜與益多快長素飼料的氨基酸分析圖譜Pgeneral L6-2HPLC ,VWD Agilent 1100 HPLC,VWD 檢測器Shimadzu LC -10AD HPLC VWDWaters 1525 Binary pump HPLCDual Absorbance Detector樣品溶液中各種氨基酸濃度(g/mL =f1/f2×C其中:f1=樣品溶液中各氨基酸峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積f2=混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中各氨基酸峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積C=氨基酸對照品濃度(g/mL樣品中總氨基酸含量(%= 樣品溶液中所