第二章分子發(fā)光分析

1、 分子發(fā)光分析一教學(xué)內(nèi)容1 熒光和磷光分析法的基本原理（光譜的產(chǎn)生、各種光譜的特征、光譜與化合物結(jié)構(gòu)的關(guān)系、強(qiáng)度及影響因素等）2 熒光和磷光儀器3 熒光、磷光分析法的特點(diǎn)及大致應(yīng)用4 化學(xué)發(fā)光的基本原理、發(fā)光類型、儀器及大致應(yīng)用二重點(diǎn)與難點(diǎn)1 分子的去激發(fā)過(guò)程及熒光、磷光的發(fā)射2 熒光、磷光的發(fā)射與物質(zhì)結(jié)構(gòu)的關(guān)系3 各種光譜的特征、區(qū)別與聯(lián)系4 熒光（磷光）強(qiáng)度表達(dá)式的意義及影響因素三教學(xué)要求1 基本掌握熒光和磷光發(fā)射的原理及與物質(zhì)結(jié)構(gòu)的關(guān)系2 了解各種光譜的繪制方法、特征與聯(lián)系3 掌握強(qiáng)度表達(dá)式的意義、影響因素及適應(yīng)性4 掌握熒光、磷光儀器的組件、工作流程及異同點(diǎn)5 基本了解化學(xué)發(fā)光分析法的

2、原理、發(fā)光類型第一節(jié) 分子熒光和磷光分析基本原理熒光和磷光的產(chǎn)生 在電磁輻射基礎(chǔ)中，已經(jīng)簡(jiǎn)單地討論過(guò)熒光及磷光的產(chǎn)生機(jī)理。這里將根據(jù)分子結(jié)構(gòu)理論，將進(jìn)一步討論。處于分子基態(tài)單重態(tài)中的電子對(duì)，其自旋方向相反，當(dāng)其中一個(gè)電子被激發(fā)時(shí)，通常躍遷至第一激發(fā)態(tài)單重態(tài)軌道上，也可能躍遷至能級(jí)更高的單重態(tài)上。這種躍遷是符合光譜選律的，如果躍遷至第一激發(fā)三重態(tài)軌道上，則屬于禁阻躍遷。單重態(tài)與三重態(tài)的區(qū)別在于電子自旋方向不同，激發(fā)三重態(tài)具有較低能級(jí)。在單重激發(fā)態(tài)中，兩個(gè)電子平行自旋，單重態(tài)分子具有抗磁性，其激發(fā)態(tài)的平均壽命大約為10-8s，而三重態(tài)分子具有順磁性，其激發(fā)態(tài)的平均壽命為10-4 1s以上（通常用S

3、和T分別表示單重態(tài)和三重態(tài)）。處于激發(fā)態(tài)的電子，通常以輻射躍遷方式或無(wú)輻射躍遷方式再回到基態(tài)。輻射躍遷主要涉及到熒光、延遲熒光或磷光的發(fā)射；無(wú)輻射躍遷則是指以熱的形式輻射其多余的能量，包括振動(dòng)弛豫（VR）、內(nèi)部轉(zhuǎn)移（IR）、系間竄躍（IX）及外部轉(zhuǎn)移（EC）等，各種躍遷方式發(fā)生的可能性及程度，與熒光物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)及激發(fā)時(shí)的物理和化學(xué)環(huán)境等因素有關(guān)。 下面結(jié)合熒光和磷光的產(chǎn)生過(guò)程，進(jìn)一步說(shuō)明各種能量傳遞方式在其中所起的作用。設(shè)處于基態(tài)單重態(tài)中的電子吸收波長(zhǎng)為1和2的輻射光之后，分別激發(fā)至第二單重態(tài)S2及第一單重態(tài)S1。振動(dòng)弛豫 它是指 在同一電子能級(jí)中，電子由高振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)至低振動(dòng)能級(jí)，而將多余的

4、能量以熱的形式發(fā)出。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間為10-12s數(shù)量級(jí)。內(nèi)轉(zhuǎn)移當(dāng)兩個(gè)電子能級(jí)非?？拷灾疗湔駝?dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，常發(fā)生電子由高能級(jí)以無(wú)輻射躍遷方式轉(zhuǎn)移至低能級(jí)。右圖中指出，處于高激發(fā)單重態(tài)的電子，通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)移及振動(dòng)弛豫，均躍回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。熒光發(fā)射 處于第一激發(fā)單重態(tài)中的電子躍回至基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)時(shí)，將得到最大波長(zhǎng)為3的熒光。注意：基態(tài)中也有振動(dòng)馳豫躍遷。很明顯，3的波長(zhǎng)較激發(fā)波長(zhǎng)1或2都長(zhǎng)，而且不論電子開(kāi)始被激發(fā)至什么高能級(jí)，最終將只發(fā)射出波長(zhǎng)3為的熒光。熒光的產(chǎn)生在10-7-10-9s內(nèi)完成系間竄躍指不同多重態(tài)間的無(wú)輻射躍遷，例如S1T1就是一種系間竄躍。通常，發(fā)生系間竄躍時(shí)

5、，電子由S1的較低振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)移至T1的較高振動(dòng)能級(jí)處。有時(shí)，通過(guò)熱激發(fā)，有可能發(fā)生T1S1，然后由S1發(fā)生熒光。這是產(chǎn)生延遲熒光的機(jī)理。磷光發(fā)射 電子由基態(tài)單重態(tài)激發(fā)至第一激發(fā)三重態(tài)的幾率很小，因?yàn)檫@是禁阻躍遷。但是，由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，有可能以系間竄躍方式轉(zhuǎn)至第一激發(fā)三重態(tài)，再經(jīng)過(guò)振動(dòng)馳豫，轉(zhuǎn)至其最低振動(dòng)能級(jí)，由此激發(fā)態(tài)躍回至基態(tài)時(shí)，便發(fā)射磷光，這個(gè)躍遷過(guò)程（T1S0）也是自旋禁阻的，其發(fā)光速率較慢，約為10-4-10s。因此，這種躍遷所發(fā)射的光，在光照停止后，仍可持續(xù)一段時(shí)間。外轉(zhuǎn)移 指激發(fā)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用及能量轉(zhuǎn)移，使熒光或磷光強(qiáng)度減弱甚至消失。這一現(xiàn)象

6、稱為“熄滅”或“猝滅”。熒光與磷光的根本區(qū)別：熒光是由激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能層至基態(tài)各振動(dòng)能層間躍遷產(chǎn)生的；而磷光是由激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能層至基態(tài)各振動(dòng)能層間躍遷產(chǎn)生的。激發(fā)光譜曲線和熒光、磷光光譜曲線熒光和磷光均為光致發(fā)光，因此必須選擇合適的激發(fā)光波長(zhǎng)，可根據(jù)它們的激發(fā)光譜曲線來(lái)確定。繪制激發(fā)光譜曲線時(shí)，固定測(cè)量波長(zhǎng)為熒光（或磷光）最大發(fā)射波長(zhǎng)，然后改變激發(fā)波長(zhǎng)，根據(jù)所測(cè)得的熒光（磷光）強(qiáng)度與激發(fā)光波長(zhǎng)的關(guān)系，即可繪制 激發(fā)光譜曲線。 應(yīng)該指出，激發(fā)光譜曲線與其吸收曲線可能相同，但激發(fā)光譜曲線是熒光強(qiáng)度與波長(zhǎng)的關(guān)系曲線，吸收曲線則是吸光度與波長(zhǎng)的關(guān)系曲線，兩者在性質(zhì)上是不同的。當(dāng)然，在激發(fā)光

7、譜曲線的最大波長(zhǎng)處，處于激發(fā)態(tài)的分子數(shù)目是最多的，這可說(shuō)明所吸收的光能量也是最多的，自然能產(chǎn)生最強(qiáng)的熒光。 如果 固定激發(fā)光波長(zhǎng)為其最大激發(fā)波長(zhǎng)，然后測(cè)定不同的波長(zhǎng)時(shí)所發(fā)射的熒光或磷光強(qiáng)度，即可繪制熒光或磷光光譜曲線。 在熒光和磷光的產(chǎn)生過(guò)程中，由于存在各種形式的無(wú)輻射躍遷，損失能量，所以它們的最大發(fā)射波長(zhǎng)都向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，以磷光波長(zhǎng)的移動(dòng)最多，而且它的強(qiáng)度也相對(duì)較弱。熒光發(fā)射光譜的普遍特性：（1）Stokes位移 在溶液中，分子熒光的發(fā)射相對(duì)于吸收位移到較長(zhǎng)的波長(zhǎng)，稱為Stokes位移。這是由于受激分子通過(guò)振動(dòng)弛豫而失去轉(zhuǎn)動(dòng)能，也由于溶液中溶劑分子與受激分子的碰撞，也會(huì)有能量的損失。因此，在

8、激發(fā)和發(fā)射之間產(chǎn)生了能量損失。（2）熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān) 因?yàn)榉肿游樟瞬煌芰康墓庾涌梢杂苫鶓B(tài)激發(fā)到幾個(gè)不同的電子激發(fā)態(tài)，而具有幾個(gè)吸收帶。由于較高激發(fā)態(tài)通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換及轉(zhuǎn)動(dòng)弛豫回到第一電子激發(fā)態(tài)的幾率較高，遠(yuǎn)大于由高能激發(fā)態(tài)直接發(fā)射光子的速度，故在熒光發(fā)射時(shí)，不論用哪一個(gè)波長(zhǎng)的光輻射激發(fā)，電子都從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能層返回到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能層，所以熒光發(fā)射光譜與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)。（3）鏡像規(guī)則 通常熒光發(fā)射光譜和它的吸收光譜呈鏡像對(duì)稱關(guān)系。 吸收光譜是物質(zhì)分子由基態(tài)激發(fā)至第一電子激發(fā)態(tài)的各振動(dòng)能層形成的。其形狀決定于第一電子激發(fā)態(tài)中各 振動(dòng)能層的分布情況。 熒光光譜是激發(fā)分子從第

9、一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能層回到基態(tài)中各不同能層形成的。所以熒光光譜的形狀決定于基態(tài)中各振動(dòng)能層的分布情況?；鶓B(tài)中振動(dòng)能層的分布和第一電子激發(fā)態(tài)中振動(dòng)能層的分布情況是類似的。 因此熒光光譜的形狀和吸收光譜的形狀極為相似。 由基態(tài)最低振動(dòng)能層躍遷到 第一電子激發(fā)態(tài)各個(gè)振動(dòng)能層的吸收過(guò)程中，振動(dòng)能層越高，兩個(gè)能層之間的能量差越大，即激發(fā)所需的能量越高，所以吸收峰的波長(zhǎng)越短。反之，由 第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能層降落到基態(tài)各個(gè)振動(dòng)能層的熒光發(fā)射過(guò)程中，基態(tài)振動(dòng)能層越高，兩個(gè)能層之間的能量差越小，熒光峰的波長(zhǎng)越長(zhǎng)。 另外，也可以從位能曲線解釋鏡像規(guī)則。由于光吸收在大約10-15的短時(shí)間內(nèi)發(fā)生，原子核沒(méi)有

10、發(fā)生明顯的位移，即電子與核之間的位移沒(méi)有發(fā)生變化。假如在吸收過(guò)程中，基態(tài)的零振動(dòng)能層與激發(fā)態(tài)的第二振動(dòng)能層之間的躍遷幾率最大，那么，在熒光發(fā)射過(guò)程中，其相反躍遷的幾率也應(yīng)該最大。也就是說(shuō)，吸收和發(fā)射的能量都最大。（三）熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個(gè)條件： 分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)，才能吸收激發(fā)光； 吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，必須具有 一定的熒光量子產(chǎn)率。1. 量子產(chǎn)率 熒光量子產(chǎn)率也叫熒光效率或量子效率，它表示物質(zhì)發(fā)射熒光的能力，通常用下式表示 j = 發(fā)射熒光分子數(shù) / 激發(fā)分子總數(shù) 或 j = 發(fā)射熒光量子數(shù) / 吸收光量子數(shù) 在產(chǎn)生熒光的過(guò)程中

11、，涉及到許多輻射和無(wú)輻射躍遷過(guò)程，如熒光發(fā)射、內(nèi)轉(zhuǎn)移，系間竄躍和外轉(zhuǎn)移等。很明顯，熒光的量子產(chǎn)率，將與上述每一個(gè)過(guò)程的速率常數(shù)有關(guān)。 若用數(shù)學(xué)式來(lái)表達(dá)這些關(guān)系，得到 j= kf /（kf+åki） 中kf為熒光發(fā)射過(guò)程的速率常數(shù)，åki為其它有關(guān)過(guò)程的速率常數(shù)的總和。 凡是能使kf 值升高而使其它ki值降低的因素，都可增強(qiáng)熒光。 實(shí)際上，對(duì)于高熒光分子，例如熒光素，其量子產(chǎn)率在某些情況下接近1，說(shuō)明åkI很小，可以忽略不計(jì)。一般來(lái)說(shuō)，kf主要取決于化學(xué)結(jié)構(gòu)，而åki則主要取決于化學(xué)環(huán)境，同時(shí)也與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。 磷光的量子產(chǎn)率與此類似。2. 熒光與有機(jī)化合

12、物的結(jié)構(gòu)（1）躍遷類型 實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)于大多數(shù)熒光物質(zhì)，首先經(jīng)歷p®p*或n（非鍵電子軌道）®p*激發(fā)，然后經(jīng)過(guò)振動(dòng)弛豫或其他無(wú)輻射躍遷，再發(fā)生p*®p或p*®n躍遷而得到熒光。在這兩種躍遷類型中，p*®p躍遷常能發(fā)出較強(qiáng)的熒光（較大的量子產(chǎn)率）。這是由于p®p*躍遷具有較大的摩爾吸光系數(shù)（一般比n®p*大100-1000倍），其次，p®p*躍遷的壽命約為10-710-9s，比n®p*躍遷的壽命10-510-7s要短。在各種躍遷過(guò)程的競(jìng)爭(zhēng)中，它是有利于發(fā)射熒光的。此外，在p*®p躍遷過(guò)程中，通過(guò)系

13、間竄躍至三重態(tài)的速率常數(shù)也較小（S1®T!能級(jí)差較大），這也有利于熒光的發(fā)射，總之，p®p*躍遷是產(chǎn)生熒光的主要躍遷類型。（2）共軛效應(yīng) 實(shí)驗(yàn)證明，容易實(shí)現(xiàn)p®p*激發(fā) 的芳香族化合物容易發(fā)生熒光，能發(fā)生熒光的脂肪族和脂環(huán)族化合物極少（僅少數(shù)高度共軛體系化合物除外）。此外，增加體系的共軛度，熒光效率一般也將增大。例如，在多烯結(jié)構(gòu)中，ph（CH=CH）3 ph和ph（CH=CH）2 ph在苯中的熒光效率分別為和。共軛效應(yīng)使熒光增強(qiáng)的原因 ： 主要是由于增大熒光物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)，有利于產(chǎn)生更多的激發(fā)態(tài)分子，從而有利于熒光的發(fā)生。(3) 剛性平面結(jié)構(gòu) 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)具

14、有剛性平面結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子具有強(qiáng)烈的熒光。因?yàn)檫@種結(jié)構(gòu)可以減少分子的振動(dòng)，使分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子的相互作用減少，也就減少了碰撞去活的可能性。（4）取代基效應(yīng) 芳香族化合物苯環(huán)上的不同取代基對(duì)該化合物的熒光強(qiáng)度和熒光光譜有很大的影響。 給電子基團(tuán)，如-OH、-OR、-CN、-NH2 、 -NR2等，使熒光增強(qiáng)。因?yàn)楫a(chǎn)生了p-p共軛作用，增強(qiáng)了p電子共軛程度，使最低激發(fā)單重態(tài)與基態(tài)之間的躍遷幾率增大。 吸電子基團(tuán)，如-COOH、-NO、-C =O、鹵素等，會(huì)減弱甚至?xí)鐭晒狻?鹵素取代基隨原子序數(shù)的增加而熒光降低。這可能是由所謂“重原子效應(yīng)”使系間跨越速率增加所致。在重原子中，能級(jí)之間的交叉現(xiàn)

15、象比較嚴(yán)重，因此容易發(fā)生自旋軌道的相互作用，增加了由單重態(tài)轉(zhuǎn)化為三重態(tài)的速率。 取代基的空間障礙對(duì)熒光也有影響。立體異構(gòu)現(xiàn)象對(duì)熒光強(qiáng)度有顯著的影響。3. 金屬螯合物的熒光 除過(guò)渡元素的順磁性原子會(huì)發(fā)生線狀熒光光譜外，大多數(shù)無(wú)機(jī)鹽類金屬離子，在溶液中只能發(fā)生無(wú)輻射躍遷，因而不產(chǎn)生熒光。但是，在某些情況下，金屬螯合物卻能產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光，并可用于痕量金屬元素分析。（1）螯合物中配位體的發(fā)光 不少有機(jī)化合物雖然具有共軛雙鍵，但由于不是剛性結(jié)構(gòu)，分子處于非同一平面，因而不發(fā)生熒光。若這些化合物和金屬離子形成螯合物，隨著分子的剛性增強(qiáng)，平面結(jié)構(gòu)的增大，常會(huì)發(fā)生熒光。如8-羥基喹啉本身有很弱的熒光，但其金屬

16、螯合物具有很強(qiáng)的熒光。（2）螯合物中金屬離子的特征熒光 這類發(fā)光過(guò)程通常是螯合物首先通過(guò)配位體的p®p*躍遷激發(fā)，接著配位體把能量轉(zhuǎn)給金屬離子，導(dǎo)致d®d*躍遷和f®f*躍遷，最終發(fā)射的是d®d*躍遷和f®f*躍遷光譜。（四）溶液的熒光（或磷光）強(qiáng)度1. 熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系 熒光強(qiáng)度If正比于吸收的光量Ia與熒光量子產(chǎn)率j 。 If = j Ia 式中j為熒光量子效率，又根據(jù)Beer定律 Ia = I0 - It = I0(1- e -e l C) I0和It分別是入射光強(qiáng)度和透射光強(qiáng)度。代入上式得 If = j I0(1- 10 -e

17、l c) = j I0(1- e e l c)整理得： If =2.3 j I0 elc 當(dāng)入射光強(qiáng)度I0 和l一定時(shí)，上式為： If = K c 即熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成之正比，但這種線性關(guān)系只有在極稀的溶液中，當(dāng)elc£時(shí)才成立。對(duì)于較濃溶液，由于猝滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強(qiáng)度和濃度不呈線性關(guān)系。（2）影響熒光強(qiáng)度的因素 溶劑對(duì)熒光強(qiáng)度的影響 。 溶劑的影響可分為一般溶劑效應(yīng)和特殊溶劑效應(yīng)。一般溶劑效應(yīng)指的是溶劑的折射率和介電常數(shù)的影響。特殊溶劑效應(yīng)指的是熒光體和溶劑分子間的特殊化學(xué)作用，如氫鍵的生成和化合作用。 一般溶劑效應(yīng)是普遍的，而特殊溶劑效應(yīng)則決定于溶劑和熒光體的

18、化學(xué)結(jié)構(gòu)。特殊溶劑效應(yīng)所引起熒光光譜的移動(dòng)值，往往大于一般溶劑效應(yīng)所引起的影響。由于溶質(zhì)分子與溶劑分子間的作用，使同一種熒光物質(zhì)在不同的溶劑中的熒光光譜可能會(huì)有顯著不同。有的情況，增大溶劑的極性，將使n®p*躍遷的能量增大， p®p*躍遷的能量減小，而導(dǎo)致熒光增強(qiáng)，熒光峰紅移。但也有相反的情況，例如，苯胺奈磺酸類化合物在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲醇中，隨著醇的極性增大，熒光強(qiáng)度減小，熒光峰藍(lán)移。因此熒光光譜的位置和強(qiáng)度與溶劑極性之間的關(guān)系，應(yīng)根據(jù)熒光物質(zhì)與溶劑的不同而異。 如果溶劑和熒光物質(zhì)形成了化合物，或溶劑使熒光物質(zhì)的電力狀態(tài)改變，則熒光峰位和強(qiáng)度都會(huì)發(fā)生較大的變化。

19、溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響 溫度上升使熒光強(qiáng)度下降。其中一個(gè)原因是分子的內(nèi)部能量轉(zhuǎn)化作用。當(dāng)激發(fā)分子接受額外熱能時(shí)，有可能使激發(fā)能轉(zhuǎn)換為基態(tài)的振動(dòng)能量，隨后迅速振動(dòng)弛豫而喪失振動(dòng)能量。另一個(gè)原因是碰撞頻率增加，使外轉(zhuǎn)換的去活幾率增加。 溶液pH值對(duì)熒光強(qiáng)度的影響 帶有酸性或堿性官能團(tuán)的大多數(shù)芳香族化合物的熒光與溶液的pH有關(guān)。不同的pH值，化合物所處狀態(tài)不同，不同的化合物或化合物的分子與其離子在電子構(gòu)型上有所不同，因此，它們的熒光強(qiáng)度和熒光光譜就有一定的差別。 對(duì)于金屬離子與有機(jī)試劑形成的發(fā)光鏊合物，一方面pH會(huì)影響鏊合物的形成，另一方面還會(huì)影響鏊合物的組成，因而影響它們的熒光性質(zhì)。 內(nèi)濾光作用和自

20、吸收現(xiàn)象 溶液中若存在能吸收激發(fā)或熒光物質(zhì)所發(fā)射光能的物質(zhì)，就會(huì)使熒光減弱，這種現(xiàn)象稱為“內(nèi)濾光作用”。 內(nèi)濾光作用的另一種情況是熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射光的短波長(zhǎng)的一端與該物質(zhì)的吸收光譜的長(zhǎng)波長(zhǎng)一端有重疊。在溶液濃度較大時(shí)，一部分熒光發(fā)射被自身吸收，產(chǎn)生“自吸收”現(xiàn)象而降低了溶液的熒光強(qiáng)度。（3）溶液熒光猝滅 熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象稱為熒光猝滅。能引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為猝滅劑。導(dǎo)致熒光猝滅的主要類型： 碰撞猝滅 碰撞猝滅是指處于激發(fā)單重態(tài)的熒光分子與猝滅劑分子相碰撞，使激發(fā)單重態(tài)的熒光分子以無(wú)輻射躍遷的方式回到基態(tài)，產(chǎn)生猝滅作用。 靜態(tài)猝滅（組成化

21、合物的猝滅） 由于部分熒光物質(zhì)分子與猝滅劑分子生成非熒光的配合物而產(chǎn)生的。此過(guò)程往往還會(huì)引起溶液吸收光譜的改變。 轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅 分子由于系間的跨越躍遷，由單重態(tài)躍遷到三重態(tài)。轉(zhuǎn)入三重態(tài)的分子在常溫下不發(fā)光，它們?cè)谂c其它分子的碰撞中消耗能量而使熒光猝滅。溶液中的溶解氧對(duì)有機(jī)化合物的熒光產(chǎn)生猝滅效應(yīng)是由于三重態(tài)基態(tài)的氧分子和單重激發(fā)態(tài)的熒光物質(zhì)分子碰撞，形成了單重激發(fā)態(tài)的氧分子和三重態(tài)的熒光物質(zhì)分子，使熒光猝滅。 發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的猝滅 某些猝滅劑分子與熒光物質(zhì)分子相互作用時(shí)，發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，因而引起熒光猝滅。 熒光物質(zhì)的自猝滅 在濃度較高的熒光物質(zhì)溶液中，單重激發(fā)態(tài)的分子在發(fā)生熒光之前和

22、未激發(fā)的熒光物質(zhì)分子碰撞而引起的自猝滅。有些熒光物質(zhì)分子在溶液濃度較高時(shí)會(huì)形成二聚體或多聚體，使它們的吸收光譜發(fā)生變化，也引起溶液熒光強(qiáng)度的降低或消失。二、熒光分析儀 用于測(cè)量熒光的儀器由激發(fā)光源、樣品池、用于選擇激發(fā)光波長(zhǎng)和熒光波長(zhǎng)的單色器以及檢測(cè)器四部分組成。（熒光分析儀器基本部件示意圖見(jiàn)教材） 由光源發(fā)射的光經(jīng)第一單色器得到所需的激發(fā)光波長(zhǎng)，通過(guò)樣品池后，一部分光能被熒光物質(zhì)所吸收，熒光物質(zhì)被激發(fā)后，發(fā)射熒光。為了消除入射光和散射光的影響，第一節(jié) 分子熒光和磷光分析熒光的測(cè)量通常在與激發(fā)光成直角的方向上進(jìn)行。為消除可能共存的其它光線的干擾，如由激發(fā)所產(chǎn)生的反射光、Raman光以及為將溶液

23、中雜質(zhì)濾去，以獲得所需的熒光，在樣品池和檢測(cè)器之間設(shè)置了第二單色器。熒光作用于檢測(cè)器上，得到響應(yīng)的電信號(hào)。（1）激發(fā)光源 在紫外-可見(jiàn)區(qū)范圍，通常的光源是氙燈和高壓汞燈。（2）樣品池 熒光用的樣品池須用低熒光的材料制成，通常用石英，形狀以方形和長(zhǎng)方形為宜。（3）單色器 光柵（4）檢測(cè)器 由光電管和光電倍曾管作檢測(cè)器，并與激發(fā)光成直角。三、分子熒光分析法及其應(yīng)用1.熒光分析方法的特點(diǎn)靈敏度高 （2）選擇性強(qiáng)（3）試樣量少和方法簡(jiǎn)單 （4）提供比較多的物理參數(shù) 熒光分析法的弱點(diǎn)是它的應(yīng)用范圍小。因?yàn)楸旧砟馨l(fā)熒光的物質(zhì)相對(duì)較少，用加入某種試劑的方法將非熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)化為熒光物質(zhì)進(jìn)行分析，其數(shù)量也不多；另

24、一方面，由于熒光分析的靈敏度高，測(cè)定對(duì)環(huán)境因素敏感，干擾因素較多。2. 定量分析方法（1）校準(zhǔn)曲線法 （2）比較法3. 應(yīng)用（1）元素的熒光測(cè)定 （2）有機(jī)化合物的熒光測(cè)定。四、磷光分析法 分子磷光與分子熒光光譜的主要差別是磷光是第一激發(fā)單重態(tài)的最低能層，經(jīng)系間跨越躍遷到第一激發(fā)三重態(tài)，并經(jīng)振動(dòng)弛豫至最低振動(dòng)能層，然后躍遷回到基態(tài)發(fā)生的。與熒光相比，磷光具有如下三個(gè)特點(diǎn)：（1）磷光輻射的波長(zhǎng)比熒光長(zhǎng) 分子的T1態(tài)能量比S1態(tài)低。（2）磷光的壽命比熒光長(zhǎng) 由于熒光是S1 ® S0躍遷產(chǎn)生的，這種躍遷是自旋許可的躍遷，因而S1態(tài)的輻射壽命通常在10-7 10-9s，磷光是T1 ®

25、; S0躍遷產(chǎn)生的，這種躍遷屬自旋禁阻的躍遷，其速率常數(shù)要小，因而輻射壽命要長(zhǎng)，大約為10-4 10s，（3）磷光的壽命和輻射強(qiáng)度對(duì)于重原子和順磁性離子敏感。1. 低溫磷光 由于激發(fā)三重態(tài)的壽命長(zhǎng)，使激發(fā)態(tài)分子發(fā)生 T1® S0這種分子內(nèi)部的內(nèi)轉(zhuǎn)化非輻射去活化過(guò)程以及激發(fā)態(tài)分子與周圍的溶劑分子間發(fā)生碰撞和能量轉(zhuǎn)移過(guò)程，或發(fā)生某些光化學(xué)反應(yīng)的幾率增大，這些都將使磷光強(qiáng)度減弱，甚至完全消失。為減少這些去活化過(guò)程的影響，通常應(yīng)在低溫下測(cè)量磷光。 低溫磷光分析中，液氮是最常用的合適的冷卻劑。因此要求所使用的溶劑，在液氮溫度（77K）下應(yīng)具有足夠的粘度并能形成透明的剛性玻璃體，對(duì)所分析的試樣應(yīng)

26、具有良好的溶解特性。試樣的剛性可減少熒光的碰撞猝滅。溶劑應(yīng)易于提純，以除去芳香族和雜環(huán)化合物等雜質(zhì)。溶劑應(yīng)在所研究的光譜區(qū)域內(nèi)沒(méi)有很強(qiáng)的吸收和發(fā)射。最常用的溶劑是EPA，它由乙醇、異戊烷和二乙醚按體積比為2：5：5混合而成。使用含有重原子的混合溶劑IEPA（由EPA：碘甲烷=10：1組成），有利于系間跨越躍遷，可以增加磷光效應(yīng)。 含重原子的溶劑，由于重原子的高核電荷引起或增強(qiáng)了溶質(zhì)分子的自旋-軌函耦合作用，從而增大了 S0® T1吸收躍遷和S1®T1系間跨越躍遷的幾率，有利于磷光的發(fā)生和增大磷光的量子產(chǎn)率。這種作用稱為外部重原子效應(yīng)。當(dāng)分子中引入重原子取代基，例如，當(dāng)芳烴分

27、子中引入雜原子或重原子取代基時(shí)，也會(huì)發(fā)生內(nèi)部重原子效應(yīng)，導(dǎo)致磷光量子效率的提高。2.室溫磷光 由于低溫磷光需要低溫實(shí)驗(yàn)裝置，溶劑選擇的限制等因素，從而發(fā)展了多種室溫磷光法（RTP）。（1）固體基質(zhì)室溫磷光法（SS-RTP） 此法基于測(cè)量室溫下吸附于固體基質(zhì)上的有機(jī)化合物所發(fā)射的磷光。所用的載體種類較多，有纖維素載體（如濾紙、玻璃纖維）、無(wú)機(jī)載體（如硅膠、氧化鋁）以及有機(jī)載體（如乙酸鈉、聚合物、纖維素膜）等。理想的載體是既能將分析物質(zhì)牢固地束縛在表面或基質(zhì)中以增加其剛性，并能減小三重態(tài)的碰撞猝滅等非輻射去活化過(guò)程，而本身又不產(chǎn)生磷光背景。（2）膠束增穩(wěn)的溶液室溫磷光法（MS-RTP） 當(dāng)溶液中表

28、面活性劑的濃度達(dá)到臨界膠束濃度后，便相互聚集形成膠束。由于這種膠束的多相性，改變了磷光團(tuán)的微環(huán)境和定向的約束力，從而強(qiáng)烈影響了磷光團(tuán)的物理性質(zhì)，減小了內(nèi)轉(zhuǎn)化和碰撞能量損失等非輻射去活化過(guò)程的趨勢(shì)，明顯增加了三重態(tài)的穩(wěn)定性，從而可以實(shí)現(xiàn)在溶液中測(cè)量室溫磷光。利用膠束穩(wěn)定的因素，結(jié)合重原子效應(yīng)，并對(duì)溶液除氧，是MS-RTP 的三個(gè)要素。（3）敏化溶液室溫磷光法（SS-RTP） 該法在沒(méi)有表面活性劑存在的情況下獲得溶液的室溫磷光。分析物質(zhì)被激發(fā)后并不發(fā)射熒光，而是經(jīng)過(guò)系間跨越過(guò)程衰減變至最低激發(fā)三重態(tài)。當(dāng)有某種合適的能量受體存在時(shí)，發(fā)生了由分析物質(zhì)到受體的三重態(tài)能量轉(zhuǎn)移，最后通過(guò)測(cè)量受體所發(fā)射的室溫

29、磷光強(qiáng)度而間接測(cè)定該分析物質(zhì)。在這種方法中，分析物質(zhì)本身并不發(fā)磷光，而是引發(fā)受體發(fā)磷光。3. 磷光分析儀 在熒光分光光度計(jì)上配上磷光配件后，即可用于磷光測(cè)定。如將樣品放在盛有液氮的石英杜瓦瓶?jī)?nèi)，即可用于低溫磷光測(cè)定。4. 應(yīng)用 磷光分析主要用于測(cè)定有機(jī)化合物，如石油產(chǎn)品、多環(huán)芳烴、農(nóng)藥、藥物等方面。（教材列出了一些有機(jī)化合物的磷光分析實(shí)例）某些物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí)，由于吸收了反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的化學(xué)能，而使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，受激分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，便發(fā)出一定波長(zhǎng)的光。這種吸收化學(xué)能使分子發(fā)光的過(guò)程稱為化學(xué)發(fā)光。利用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)而建立起來(lái)的分析方法稱為化學(xué)發(fā)光分析法。化學(xué)發(fā)光也發(fā)生于生命體系

30、，這種發(fā)光稱為生物發(fā)光。一、化學(xué)發(fā)光分析的基本原理 化學(xué)發(fā)光是吸收化學(xué)反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生的化學(xué)能，而使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)所發(fā)射的光。任何一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)都應(yīng)包括化學(xué)激發(fā)和發(fā)光兩個(gè)步驟，必須滿足如下條件：（1）化學(xué)反應(yīng)必須提供足夠的激發(fā)能，激發(fā)能主要來(lái)源于反應(yīng)焓。（2）要有有利的化學(xué)反應(yīng)歷程，使化學(xué)反應(yīng)的能量至少能被一種物質(zhì)所接受并生成激發(fā)態(tài)。（3）激發(fā)態(tài)能釋放光子或能夠轉(zhuǎn)移它的能量給另一個(gè)分子，而使該分子激發(fā)，然后以輻射光子的形式回到基態(tài)。 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)效率jcl，又稱化學(xué)發(fā)光的總量子產(chǎn)率。它決定于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學(xué)激發(fā)效率jce和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)射效率jem。定義為： jcl =發(fā)射光子的分子數(shù) / 參加反應(yīng)的分子數(shù) = jce·jem 化學(xué)反應(yīng)的發(fā)光效率、光輻射的能量大小以及光譜范圍，完全由參加反應(yīng)物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)所決定。每個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)都有其特征的化學(xué)發(fā)光光譜及不同的化學(xué)發(fā)光效率。 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度Icl以單位時(shí)間內(nèi)發(fā)射的光子數(shù)表示。它與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的速率有關(guān)，而反應(yīng)速率又與反應(yīng)分子濃度有關(guān)。即 Icl （t）= jcl · dc/dt式中 Icl（t）表示t時(shí)刻的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，是與分析物有關(guān)的化學(xué)發(fā)光效率dc/dt是分析物參加反應(yīng)的速率。二、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)類型1.