急性一氧化碳中毒大鼠小腦組織一氧化氮及一氧化氮合酶活性的變化

1、    急性一氧化碳中毒大鼠小腦組織一氧化氮及 一氧化氮合酶活性的變化        【摘要】目的：研究急性一氧化碳(CO）中毒大鼠小腦組織中一氧化氮(NO）、一氧化氮合酶(NOS）活性的變化，以探討NO、NOS與急性CO中毒腦損傷的關(guān)系。方法：實(shí)驗(yàn)用Wistar大鼠26只，隨機(jī)分為兩組：正常對(duì)照組(C組)，CO染毒組(CO組)。采用改良的Griess法、分光光度法分別測(cè)定小腦組織中NO、NOS活性。結(jié)果：CO中毒后小腦組織中NO明顯增高(P<0.05)，NO

2、S活性明顯降低(P<0.01)。結(jié)論：急性CO中毒腦組織損傷與小腦組織中NOS活性受抑制、NO含量增高有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】急性一氧化碳中毒一氧化氮一氧化氮合酶小腦 Changes in levels of  nitric oxide and activities of nitric oxide synthase in cerebellum after carbon monoxide poisoning in ratWang Yan，Liu Yu（Department of Emergency Medicine，F(xiàn)irst HospitalAffiliatedChina Medica

3、l University，Shenyang，110001）【Abstract】Objective：Carbon monoxide（CO） continues to be a common cause of poisoning mortality and morbidity worldwideThe purpose of this study was to evaluate levels of nitric oxide（NO） and nitric oxide synthase（NOS） in the rat brain after exposure to carbon monoxideMeth

4、ods：Twenty-six male Wistar rats were randomly divided into 2 groups：Group 1，control group；Group 2，CO exposureNO levels were measured by Griess method，and NOS activity was measured by spectrophotometryNO，NOS levels were compared between the 2 groupsResults were analyzed using ttestResults：In the rat

5、cerebellum，that of NO increased and that of NOS decreased after CO exposureConclusion：Activity of NOS was inhibited in the ratcerebellum afterCO exposureThe production of NO increased in the ratcerebellum after CO exposureThe demonstrated changes in levels of NO and NOS may play an important role in

6、 the neurologic damage resulting from CO poisoning【Key words】CO poisoningNitricoxideNitricoxidesynthasecerebellum近年來(lái)對(duì)一氧化氮(nitric oxide，NO）的研究發(fā)現(xiàn)，NO作為非經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞功能調(diào)節(jié)因子 ，具有舒張血管、抑制血管平滑肌增殖等重要的生理功能。但NO過(guò)量產(chǎn)生和釋放時(shí)具有神經(jīng)毒性1。催化NO生物合成的酶稱(chēng)為一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS）。CO中毒致腦損傷的機(jī)制至今未明2。CO中毒致腦損傷的機(jī)制與NO的關(guān)系尚不清楚，急性CO中

7、毒對(duì)大鼠腦組織中NO、NOS活性的影響國(guó)內(nèi)外尚未有研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用動(dòng)物模型，分別測(cè)定CO染毒大鼠小腦組織中NO、NOS活性，以探討CO中毒對(duì)NO及NOS活性的影響。1材料和方法1.1儀器和試劑CO氣，純度為99.99%，由北京氦普北分氣體工業(yè)有限公司提供。CO快速檢測(cè)管，由北京市朝陽(yáng)區(qū)北苑檢測(cè)分析儀器廠提供。DU-640型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)為美國(guó)Beckman公司產(chǎn)品。NO試劑盒及NOS試劑盒由北京東亞免疫技術(shù)研究所提供。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2動(dòng)物和分組健康雄性Wistar大鼠26只，體重280320g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。隨機(jī)分成2組，C組和CO組，每組13只。1.3C

8、O中毒模型建立參照IshiropoulosH3的方法。把鼠放入自制染毒瓶中，充入CO氣，以CO快速檢測(cè)管測(cè)定染毒瓶中CO濃度，使CO濃度維持在35004000ppm，使鼠靜式吸入CO氣4060min致大鼠昏迷。1.4動(dòng)物處理C組不染毒，隨機(jī)分入C組后即進(jìn)行處理；CO組大鼠在染毒后10min處理。處理方法：10%水合氯醛按300mgkg對(duì)大鼠行腹腔注射麻醉，斷頭處死，解剖取腦，分離出小腦在深低溫(70）冰箱中保存。1.5NOS活性、NO測(cè)定在有氧和輔助因子的情況下，NOS催化L-精氨酸生成L-胍氨酸和NO，由于氧和血紅蛋白可與NO迅速而不可逆地生成高鐵血紅蛋白(MG），因而，通過(guò)分光光度法(雙波

9、長(zhǎng)法)檢測(cè)形成的MG，可反映由NOS催化生成的NO量，從而間接測(cè)定NOS的活性。小腦組織樣品按20%(重量體積)比例加入pH7.2的磷酸鉀緩沖液，離心，取上清加入L-Arg，NADPH(還原型輔酶)等，立即計(jì)時(shí)，用DU-640型分光光度計(jì)在401nm和421nm波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定每一樣本的OD值，每隔30s記錄一次至3min。用Lowery法測(cè)定上清液中的蛋白含量。最后據(jù)公式計(jì)算出每克蛋白每分鐘產(chǎn)生NO量，即NOS活性，單位為nmol.min-1.gprot-1。應(yīng)用改良的Griess法4。通過(guò)測(cè)定NO代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽(NO2）和硝酸鹽(NO3)的濃度作為衡量NO含量的指標(biāo)。具體操作參照NO試劑盒說(shuō)

10、明書(shū)。用lowery法測(cè)定上清液中蛋白含量，NO含量的單位是(nmol.gprot-1)。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各項(xiàng)指標(biāo)均以平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差(<"0 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/20100318171139613" 12 14>±s)表示，結(jié)果分析用t檢驗(yàn)。以P0.05表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異，P0.01表示有非常顯著差異。2結(jié)果小腦中：CO組較C組NO明顯增高(P0.05)，CO組較C組NOS活性明顯降低(P0.01)。見(jiàn)表1。表1各組NO及NOS活性的變化組別NO（nmol.gprot-1）

11、NOS（nmol.min1.gprot-1）C1.02±0.23(13)5.85±0.60(13)CO1.36±0.34?（13)3.76±0.62?(10)     注：?代表與C組比差異顯著(P0.05)，?代表與C組比差異顯著(P0.01) 3討論我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在小腦中CO染毒后NO增高，NOS活性在CO染毒后降低。NOS活性下降有以下幾種可能：CO在腦組織中與NOS的輔助因子鐵原卟啉IX結(jié)合，使之失去傳遞電子的作用，抑制了NOS的活性5。CO中毒引起腦缺氧，大量神經(jīng)元受損，NOS神經(jīng)元減少，從而使NOS

12、合成減少，NOS活性下降。NOS活性的下降與快速升高的NO有關(guān)，因?yàn)镹O可使NOS中的巰基亞硝基化，導(dǎo)致NOS失活。CO中毒后小腦內(nèi)NO的升高可能與以下幾種因素有關(guān)：CO中毒致腦缺氧時(shí)，谷氨酸釋放增加，使NMDA受體依賴(lài)的Ca2通道過(guò)度激活，大量Ca2內(nèi)流并與鈣調(diào)蛋白(CaM)結(jié)合，因此受到Ca2-CaM直接調(diào)節(jié)的NOS被大量激活，導(dǎo)致合成過(guò)量的NO6。據(jù)報(bào)道，昏迷與腦的低灌流有關(guān)，與對(duì)照組相比，CO致鼠昏迷后的血流量降至50%，并認(rèn)為腦組織中的NO濃度的增高是對(duì)血壓降低的一種反應(yīng)。據(jù)報(bào)道7，低氧可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞分泌一些細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(TNF）、白細(xì)胞介素8（IL8)等，它

13、們可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生iNOS。所以CO中毒后小腦中NO的升高可能為低氧誘導(dǎo)的一些細(xì)胞因子誘導(dǎo)了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生iNOS，使NO含量升高8。但NO與NOS活性變化的不一致尚有待于進(jìn)一步探討。在大腦組織中NO與NOS活性均降低，變化與小腦組織不同，已另文發(fā)表。作者單位：王燕（110001 沈陽(yáng)，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科）劉郁（110001 沈陽(yáng)，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科）參考文獻(xiàn)1，白欣立一氧化氮在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用醫(yī)學(xué)綜述，1996，2：6552，何鳳生一氧化碳中毒研究動(dòng)態(tài)工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病，1984，10：2593，H Ischiropoulos，MF Beers，

14、ST Ohnishi， et alNitric oxide production and perivascular tyrosine nitration in brain after carbon monoxide poisoning in the ratJClin Invest，1996，97：22604，Green LC，Wagner DA，Glogowski J，et alAnalysis of nitrate，and 15N nitrite in biological fluidsAnal Biochem，1982，126：1315，Nathan CNitric oxide as a secretory product of mammalian cellsFASEBJ，1992，6：30516，F(xiàn)ujisawa H，Dawson D，Browe SE，et alPharmacological madification of glutamate neurotoxicity in vivoBrain Res，1993，629：737，Karakum M，Shreeiwas R，Chen J，et alHypoxia induction of in