生物藥物分析與檢驗(yàn)酶分析法

1、酶酶 分分 析析 法法教學(xué)目的和要求教學(xué)目的和要求 l熟悉：熟悉： 1酶活力的測(cè)定方法酶活力的測(cè)定方法 2酶法分析的測(cè)定方法酶法分析的測(cè)定方法l了解：酶分析法的原理了解：酶分析法的原理概概 述述l1.酶的概念酶的概念是生物體內(nèi)產(chǎn)生并具有催化活是生物體內(nèi)產(chǎn)生并具有催化活性的性的一類蛋白質(zhì)一類蛋白質(zhì)，由于表現(xiàn)出特異的催化，由于表現(xiàn)出特異的催化功能，因此酶被稱為生物催化劑。功能，因此酶被稱為生物催化劑。l2.酶的應(yīng)用酶的應(yīng)用：在體外進(jìn)行催化反應(yīng)：在體外進(jìn)行催化反應(yīng)l用以制造某些產(chǎn)品用以制造某些產(chǎn)品l用以去除某些物質(zhì)用以去除某些物質(zhì)l用以識(shí)別某種化合物用以識(shí)別某種化合物 屬于屬于“酶分析法酶分析法”l

2、用以測(cè)定某種物質(zhì)用以測(cè)定某種物質(zhì)l酶是由酶是由活細(xì)胞活細(xì)胞產(chǎn)生的具有產(chǎn)生的具有催化作用催化作用的特殊物質(zhì)，的特殊物質(zhì)，又稱又稱生物催化劑生物催化劑。l除極個(gè)別除極個(gè)別RNARNA為催化自身反應(yīng)的酶外，其余所為催化自身反應(yīng)的酶外，其余所有的酶都是有的酶都是蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)。l生物體內(nèi)生物體內(nèi)一切生化反應(yīng)一切生化反應(yīng)都需要酶的催化才能進(jìn)都需要酶的催化才能進(jìn)行！行！l性能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過人造催化劑。性能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過人造催化劑。l產(chǎn)物（產(chǎn)物（productproduct，P P）l底物（底物（substratesubstrate，S S ）酶酶 的的 概概 念念酶是特殊的催化劑酶是特殊的催化劑 (1) (1) 生物大

3、分子生物大分子 (2) (2) 催化條件溫和催化條件溫和 (3) (3) 強(qiáng)酸、堿或高溫下失活強(qiáng)酸、堿或高溫下失活 (3) (3) 高選擇性高選擇性 (4) (4) 高催化效率高催化效率機(jī)理：降低反應(yīng)活化能，提高反應(yīng)速度，不改機(jī)理：降低反應(yīng)活化能，提高反應(yīng)速度，不改 變平衡點(diǎn)。變平衡點(diǎn)。只起催化作用，本身不消耗。只起催化作用，本身不消耗。酶酶 的的 特特 點(diǎn)點(diǎn) 概概 括括 如如 下下 ：概概 述述l3.酶分析法包括兩種類型酶分析法包括兩種類型：l一是以酶作為一是以酶作為分析對(duì)象分析對(duì)象，這類分析方法稱，這類分析方法稱為為“酶活力測(cè)定酶活力測(cè)定”。l二是以酶作為二是以酶作為分析手段分析手段，用以

4、測(cè)定樣品中，用以測(cè)定樣品中用一般化學(xué)方法難于檢測(cè)的物質(zhì)，通常將用一般化學(xué)方法難于檢測(cè)的物質(zhì)，通常將這類分析方法稱為這類分析方法稱為“酶法分析酶法分析”；4.兩類酶分析法的區(qū)別兩類酶分析法的區(qū)別l相同：從原理到方法相同：從原理到方法l不同：不同： 酶活力測(cè)定法中酶活力測(cè)定法中，是以酶為分析是以酶為分析對(duì)象對(duì)象。使用的使用的底物底物應(yīng)該應(yīng)該過量過量。l酶法分析中酶法分析中，是以酶為分析是以酶為分析工具工具或分析或分析試試劑劑, ,被檢化合物（如：被檢化合物（如：底物底物）是反應(yīng)的限是反應(yīng)的限制因素制因素酶法分析的優(yōu)點(diǎn)酶法分析的優(yōu)點(diǎn)1 用于復(fù)雜組分中結(jié)構(gòu)或物理化學(xué)性質(zhì)比較相近的同類物質(zhì)的分離鑒定和分

5、析。2 特異性強(qiáng)、干擾少、操作簡(jiǎn)單、樣品和試劑用量少，測(cè)定快速精確，靈敏度高等特點(diǎn)。3 通過了解酶對(duì)底物的特異性，可以預(yù)料可能發(fā)生的干擾反應(yīng)并設(shè)法糾正。4 可用偶聯(lián)反應(yīng)。5 無污染或污染很少的分析方法。n共同點(diǎn)：原理和方法相同，以酶的專一高效催化某化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過測(cè)定酶反應(yīng)的速率或生成物濃度來檢測(cè)相應(yīng)物質(zhì)的含量。第一節(jié)第一節(jié) 酶活力測(cè)定法酶活力測(cè)定法l 一、基本概念一、基本概念 l 二、酶促反應(yīng)的條件二、酶促反應(yīng)的條件l 三、酶活力的測(cè)定方法三、酶活力的測(cè)定方法l 四、測(cè)定過程中應(yīng)注意的問題四、測(cè)定過程中應(yīng)注意的問題 一、基本概念一、基本概念l1.酶活力酶活力：指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。

6、：指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。l2.酶活力的測(cè)定：酶活力的測(cè)定：是測(cè)定一個(gè)被酶所催化是測(cè)定一個(gè)被酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的速度。的化學(xué)反應(yīng)的速度。l3.酶活力測(cè)定的目的：酶活力測(cè)定的目的：通過酶反應(yīng)速度的通過酶反應(yīng)速度的測(cè)定，求得酶的濃度或含量測(cè)定，求得酶的濃度或含量酶活力酶活力(enzyme activity)(enzyme activity)的測(cè)定的測(cè)定 l酶活力是指酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力，l酶活力的大小可以用在一定條件下所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率來表示，酶催化的反應(yīng)速率愈大，酶的活力愈高；反應(yīng)速率愈小，酶的活力就愈低。兩者呈線性關(guān)系。l所以測(cè)定酶的活力就是測(cè)定酶促反應(yīng)的速測(cè)定酶的活力就是

7、測(cè)定酶促反應(yīng)的速率率。 l酶催化的反應(yīng)速率反應(yīng)速率可用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。l在實(shí)際酶活測(cè)定中一般以測(cè)定產(chǎn)物的增加量為準(zhǔn)。lV = p / t p = v t P 0 X 時(shí)時(shí) 間間 TV V0 0V VX X產(chǎn)產(chǎn)物物濃濃度度引起酶促反應(yīng)速率降低的原因引起酶促反應(yīng)速率降低的原因l(1)底物濃度的降低；l(2)產(chǎn)物濃度增加加速了逆反應(yīng)的進(jìn)行；l(3)產(chǎn)物對(duì)酶的抑制或激活作用l(4)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)引起酶本身部分分子失活等。l因此測(cè)定酶活力，應(yīng)測(cè)定酶促反應(yīng)的初速率，反應(yīng)初速率與酶量呈線性關(guān)系，因此可以用初速率來測(cè)定制劑中酶的含量。 檢驗(yàn)酶反應(yīng)和測(cè)定系統(tǒng)是否適宜的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)酶反應(yīng)和

8、測(cè)定系統(tǒng)是否適宜的標(biāo)準(zhǔn)l測(cè)得的測(cè)得的反應(yīng)速度反應(yīng)速度必須和必須和酶濃度酶濃度間有間有線線性的比例關(guān)系性的比例關(guān)系一、基本概念一、基本概念l4.酶反應(yīng)的速度：酶反應(yīng)的速度：用單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)底物用單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)物的增加來表示，酶反應(yīng)的速的減少或產(chǎn)物的增加來表示，酶反應(yīng)的速度愈快所表示的酶活力愈高。度愈快所表示的酶活力愈高。l5.測(cè)定酶活力的方法測(cè)定酶活力的方法：可用物理法、化學(xué)：可用物理法、化學(xué)法或酶分析法等方法。法或酶分析法等方法。一、基本概念一、基本概念l6.常用的酶分析法常用的酶分析法l第一，終點(diǎn)法第一，終點(diǎn)法l第二，取樣測(cè)定法第二，取樣測(cè)定法l第三，連續(xù)測(cè)定法第三，連續(xù)測(cè)定法

9、一、基本概念一、基本概念l7.酶的活性單位（國(guó)際單位酶的活性單位（國(guó)際單位U）：在：在25及最及最適條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一個(gè)微摩爾適條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一個(gè)微摩爾(mol)底底物的酶量定為一個(gè)活性單位。物的酶量定為一個(gè)活性單位。l8.酶的比活性：酶的比活性：為一毫克為一毫克(mg)酶的活性單位數(shù)酶的活性單位數(shù)目。目。 國(guó)際酶活力單位國(guó)際酶活力單位l1961年,國(guó)際生物化學(xué)協(xié)會(huì)酶學(xué)委員會(huì)提出采用統(tǒng)一的“國(guó)際單位”(U)來表示酶活力，規(guī)定規(guī)定為：在最適反應(yīng)條件(溫度25)下，每分鐘內(nèi)催化1微摩爾(umo1)底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量,定為一個(gè)酶活力單位，即l 1 U = 1 umol1 U = 1

10、umolminmin。 酶的比活力酶的比活力(specific activity)(specific activity)l比活力比活力: :每mg蛋白質(zhì)所含的酶活力單位數(shù)表示，l比活力=活力Umg蛋白=總活力U/總蛋白mgl有時(shí)用每g酶制劑或每m1酶制劑含有多少個(gè)活力單位來表示(Ug或Uml)。l比活力大小的含義：比活力大小的含義：可用來比較每單位質(zhì)量蛋白質(zhì)的催化能力。比活力愈大，表示酶的純度愈高?；盍挝换盍挝? ( ) )與比活力與比活力lU U速度單位速度單位11l酶產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)中常使用比活力酶產(chǎn)品中酶活力稱酶產(chǎn)品中酶活力稱比活力比活力。l u/mgu/mg酶蛋白酶蛋白 u/mlu/m

11、l酶蛋白酶蛋白l國(guó)際單位（國(guó)際單位（IUIU）：在實(shí)驗(yàn)規(guī)定的條件下（）：在實(shí)驗(yàn)規(guī)定的條件下（2525，最適最適pHpH、最適底物濃度時(shí)），、最適底物濃度時(shí)），1ul1ul標(biāo)本，以每標(biāo)本，以每分鐘能催化分鐘能催化1 1微摩爾底物的酶量為微摩爾底物的酶量為1 1個(gè)國(guó)際單位。個(gè)國(guó)際單位。酶促反應(yīng)速度的測(cè)定方法酶促反應(yīng)速度的測(cè)定方法 P 0 X 時(shí)時(shí) 間間 TV V0 0V VX X產(chǎn)產(chǎn)物物濃濃度度提問：提問：為什么反應(yīng)速度會(huì)隨為什么反應(yīng)速度會(huì)隨時(shí)間減?。繒r(shí)間減?。看鸢福捍鸢福?.S降低；降低； 2.酶受到產(chǎn)物抑制酶受到產(chǎn)物抑制提問：提問：用哪一個(gè)速度來表示用哪一個(gè)速度來表示該酶促反應(yīng)的速度特征呢？該

12、酶促反應(yīng)的速度特征呢？反應(yīng)反應(yīng)初初速度表示酶活力。速度表示酶活力。提問：提問：僅用反應(yīng)初速度大小對(duì)比酶活力行嗎？?jī)H用反應(yīng)初速度大小對(duì)比酶活力行嗎？答案答案：不行，不行，還與酶的加入量及條件有關(guān)。還與酶的加入量及條件有關(guān)。酶活力測(cè)定實(shí)例酶活力測(cè)定實(shí)例l首先首先 確定反應(yīng)條件確定反應(yīng)條件 20、pH=7，底物濃度，底物濃度 6g/l（過（過量），加入量），加入2mg固體脂肪酶固體脂肪酶l第二第二 確定活力單位確定活力單位 如每小時(shí)催化如每小時(shí)催化1 1克底物克底物 1u= 1g/hl第三第三 測(cè)算反應(yīng)初速度測(cè)算反應(yīng)初速度 作產(chǎn)物甘油隨時(shí)間增加的曲線，作產(chǎn)物甘油隨時(shí)間增加的曲線，量出反應(yīng)初速度值量出

13、反應(yīng)初速度值 ，換算為脂肪的消耗速度，換算為脂肪的消耗速度 如如 8g/hl第四第四 換算活力換算活力 8g/h 1g/h=8ul第五第五 計(jì)算比活計(jì)算比活 8u/2mg酶蛋白酶蛋白=4u/mg酶蛋白酶蛋白脂肪酶脂肪酶二、酶促反應(yīng)的條件二、酶促反應(yīng)的條件l基本要求基本要求：l反應(yīng)系統(tǒng)中除了反應(yīng)系統(tǒng)中除了待測(cè)酶的濃度待測(cè)酶的濃度是影響速度是影響速度的的惟一因素惟一因素外，其他因素都處于最適于酶外，其他因素都處于最適于酶發(fā)揮催化作用的水平。發(fā)揮催化作用的水平。 確定反應(yīng)條件時(shí)應(yīng)考慮確定反應(yīng)條件時(shí)應(yīng)考慮： （1）底物底物 選用的底物在物理化學(xué)性質(zhì)上選用的底物在物理化學(xué)性質(zhì)上和產(chǎn)物不同和產(chǎn)物不同。 一

14、般選用底物的濃度一般選用底物的濃度S=100 Km 一般選擇一般選擇Km小的作測(cè)定的底物。小的作測(cè)定的底物。 l（2）pH值值 注意選擇適宜的反應(yīng)注意選擇適宜的反應(yīng)pH值，值，并將反應(yīng)維持在這一并將反應(yīng)維持在這一pH值。值。l例：丙酮酸例：丙酮酸 乳酸乳酸乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶pHpH對(duì)酶反應(yīng)的影響對(duì)酶反應(yīng)的影響 pHpH影響酶活力的原因影響酶活力的原因 l(1) 過酸或過堿可以使酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，引起酶構(gòu)象的改變，酶活性喪失。l(2) 當(dāng)pH改變不很劇烈時(shí)，酶雖未變性，但活力受到影響。l影響了底物的解離狀態(tài)；l影響酶分子活性部位上有關(guān)基團(tuán)的解離；l影響到中間絡(luò)合物ES的解離狀態(tài)，不利于催化生成

15、產(chǎn)物。二、酶促反應(yīng)的條件二、酶促反應(yīng)的條件 （3）溫度溫度 實(shí)驗(yàn)中溫度變動(dòng)應(yīng)控制在實(shí)驗(yàn)中溫度變動(dòng)應(yīng)控制在0.1以內(nèi)。酶反應(yīng)的溫度通常選用以內(nèi)。酶反應(yīng)的溫度通常選用25、30、37。 （4）輔助因子輔助因子 為了提高酶在反應(yīng)系統(tǒng)中為了提高酶在反應(yīng)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，有些也需要某些相應(yīng)的物質(zhì)。的穩(wěn)定性，有些也需要某些相應(yīng)的物質(zhì)。 最適溫度最適溫度 機(jī)理：機(jī)理：溫度導(dǎo)溫度導(dǎo)致酶蛋致酶蛋白變性白變性溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響l在最適溫度之前，一般溫度越高，反應(yīng)速度就越快。l酶的固體狀態(tài)比在溶液中對(duì)溫度的耐受力要高。通常酶制劑以固體保存為佳。（5）空白和對(duì)照空白

16、和對(duì)照 空白空白 指雜質(zhì)反應(yīng)和自發(fā)反應(yīng)引起的變化量，指雜質(zhì)反應(yīng)和自發(fā)反應(yīng)引起的變化量，提提供未知因素的影響供未知因素的影響 對(duì)照對(duì)照作為比較或標(biāo)定的作為比較或標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)。三、酶活力的測(cè)定方法三、酶活力的測(cè)定方法l按取樣及檢測(cè)的方式按取樣及檢測(cè)的方式l（一）取樣測(cè)定法（一）取樣測(cè)定法l（二）連續(xù)測(cè)定法（二）連續(xù)測(cè)定法（一）取樣測(cè)定法（一）取樣測(cè)定法l1.取樣測(cè)定法：取樣測(cè)定法：求得單位時(shí)間內(nèi)酶促求得單位時(shí)間內(nèi)酶促反應(yīng)變化量的方法。反應(yīng)變化量的方法。 l2.常用的檢測(cè)方法常用的檢測(cè)方法：紫外：紫外-可見分光可見分光光度法、熒光分析法等。光度法、熒光分析法等。取樣測(cè)定法取樣測(cè)定法 在酶反應(yīng)開始后

17、不同的時(shí)間，從反應(yīng)系統(tǒng)在酶反應(yīng)開始后不同的時(shí)間，從反應(yīng)系統(tǒng)中取出一定量的反應(yīng)液，并用適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ腥〕鲆欢康姆磻?yīng)液，并用適當(dāng)?shù)姆椒ǎㄌ砑用傅淖冃詣┗蚴姑甘Щ睿┩Ｖ蛊浞矗ㄌ砑用傅淖冃詣┗蚴姑甘Щ睿┩Ｖ蛊浞磻?yīng)后，再根據(jù)產(chǎn)物和底物在化學(xué)性質(zhì)上的應(yīng)后，再根據(jù)產(chǎn)物和底物在化學(xué)性質(zhì)上的差別，選用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法進(jìn)行定量分析，差別，選用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法進(jìn)行定量分析，求得單位時(shí)間內(nèi)酶促反應(yīng)變化量的方法。求得單位時(shí)間內(nèi)酶促反應(yīng)變化量的方法。取樣測(cè)定法取樣測(cè)定法取樣測(cè)定法一直沿襲至今是因?yàn)椋喝訙y(cè)定法一直沿襲至今是因?yàn)椋簂不需要特殊儀器不需要特殊儀器l幾乎所有酶反應(yīng)都可根據(jù)產(chǎn)物或底幾乎所有酶反應(yīng)都可根據(jù)產(chǎn)物或底物的化

18、學(xué)性質(zhì)找出具體的測(cè)定方法物的化學(xué)性質(zhì)找出具體的測(cè)定方法l由于色源底物和熒光源底物的發(fā)展，由于色源底物和熒光源底物的發(fā)展，可在原來的底物分子上接上相應(yīng)的可在原來的底物分子上接上相應(yīng)的有色基團(tuán)、發(fā)色基團(tuán)或熒光基團(tuán)。有色基團(tuán)、發(fā)色基團(tuán)或熒光基團(tuán)。l3、終止酶反應(yīng)：、終止酶反應(yīng)：添加酶的變性劑添加酶的變性劑l三氯醋酸：紫外光區(qū)有吸收三氯醋酸：紫外光區(qū)有吸收l高氯酸：對(duì)酸和氧化劑敏感的對(duì)象不適用高氯酸：對(duì)酸和氧化劑敏感的對(duì)象不適用l4、特點(diǎn)：、特點(diǎn)：l不需要特殊儀器不需要特殊儀器l容易找到具體測(cè)定方法容易找到具體測(cè)定方法l色源底物和熒光源底物發(fā)展快色源底物和熒光源底物發(fā)展快 （二）連續(xù)測(cè)定法（二）連續(xù)測(cè)

19、定法l1.連續(xù)測(cè)定法連續(xù)測(cè)定法：基于底物和產(chǎn)物在：基于底物和產(chǎn)物在物理化物理化學(xué)性質(zhì)上的不同學(xué)性質(zhì)上的不同，在反應(yīng)過程中對(duì)反應(yīng)系，在反應(yīng)過程中對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行直接連續(xù)檢測(cè)的方法。統(tǒng)進(jìn)行直接連續(xù)檢測(cè)的方法。l2.常用的檢測(cè)方法常用的檢測(cè)方法連續(xù)測(cè)定法連續(xù)測(cè)定法l基于底物和產(chǎn)物在物理化學(xué)性質(zhì)基于底物和產(chǎn)物在物理化學(xué)性質(zhì)上的不同，在反應(yīng)過程中對(duì)反應(yīng)上的不同，在反應(yīng)過程中對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)的方法。系統(tǒng)進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)的方法。 連續(xù)測(cè)定法的準(zhǔn)確性和測(cè)定效率連續(xù)測(cè)定法的準(zhǔn)確性和測(cè)定效率比較好比較好酶活不能反映酶的使用效果 只能用于產(chǎn)品質(zhì)量的控制測(cè)定過程中應(yīng)注意的問題測(cè)定過程中應(yīng)注意的問題l產(chǎn)物的測(cè)定l反應(yīng)速

20、度的測(cè)定l測(cè)定要達(dá)到的要求酶反應(yīng)進(jìn)程曲線酶反應(yīng)進(jìn)程曲線01 12 23 34 45 56 60 05 5101015152020t/minc/mg/mLc/mg/mL5040302010酶量酶量酶濃度曲線的關(guān)系酶濃度曲線的關(guān)系0 00.10.10.20.20.30.30.40.40.50.50.60.60 0101020203030404050506060酶量酶量反應(yīng)速率反應(yīng)速率t=15t=10t=5t/min酶分析法的檢測(cè)方法酶分析法的檢測(cè)方法l最常用的方法介紹如下：最常用的方法介紹如下：l(1) (1) 紫外紫外- -可見分光光度法可見分光光度法l(2) (2) 熒光分析法熒光分析法l(3

21、) (3) 旋光度法旋光度法l(4) (4) 酶偶聯(lián)測(cè)定法酶偶聯(lián)測(cè)定法l(5) (5) 其他檢測(cè)法其他檢測(cè)法酶分析法的檢測(cè)方法酶分析法的檢測(cè)方法一、紫外一、紫外- -可見分光光度法可見分光光度法 NADNAD+ + ( (煙酰胺煙酰胺- -腺嘌呤二核苷酸，又稱為輔腺嘌呤二核苷酸，又稱為輔酶酶I) I) 和和NADPNADP+ +( (煙酰胺煙酰胺- -腺嘌呤磷酸二核苷酸腺嘌呤磷酸二核苷酸, ,又稱為輔酶又稱為輔酶II )II )是維生素?zé)燉０返难苌?，是維生素?zé)燉０返难苌?，OCH2OPOPOCH2OHOHO OO-O-N+CONH2OOHOH(OPO3H2)NNNH2NNNNH2ORNH2O

22、RNC+C還原還原氧化氧化NAD+NADH在在338.5nm338.5nm與與340.5nm340.5nm之之間有一個(gè)最大吸收峰間有一個(gè)最大吸收峰300-400nm300-400nm無吸收無吸收丙酮酸丙酮酸+NADH+H+NADH+H+ +LDH乳酸乳酸+NAD+NAD+ +例例 1、例例 2、天冬氨酸天冬氨酸+ +a-草酰酮戊二酸草酰酮戊二酸谷氨酸谷氨酸+ +草酰乙酸草酰乙酸GOT草酰乙酸草酰乙酸+NADH+H+NADH+H蘋果酸蘋果酸+NAD+NAD+ +MDH酶偶聯(lián)測(cè)定法酶偶聯(lián)測(cè)定法：是應(yīng)用過量、高度專一的：是應(yīng)用過量、高度專一的“偶聯(lián)工具酶偶聯(lián)工具酶”使被測(cè)酶反應(yīng)能連續(xù)進(jìn)行到某一可使被

23、測(cè)酶反應(yīng)能連續(xù)進(jìn)行到某一可直接、連續(xù)、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確測(cè)定階段的方法。直接、連續(xù)、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確測(cè)定階段的方法。被測(cè)反應(yīng)被測(cè)反應(yīng)G+ATPG-6-P+ADPHKG-6-P+NADPNADPH+6-P-GCOOHG6PDH偶聯(lián)指示反應(yīng)偶聯(lián)指示反應(yīng)被測(cè)反應(yīng)被測(cè)反應(yīng)AMP+ATP2ADP肌激酶肌激酶輔助反應(yīng)輔助反應(yīng)ADP+PEPATP+Pyr丙酮酸激酶丙酮酸激酶指示反應(yīng)指示反應(yīng)Pyr+NADH+H+L+NAD+乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶二、熒光分析法二、熒光分析法三三 華勃氏呼吸儀檢壓法華勃氏呼吸儀檢壓法四、放射性同位素測(cè)定法四、放射性同位素測(cè)定法華勃氏微量呼吸儀（瓦氏呼吸儀）華勃氏微量呼吸儀（瓦氏呼吸儀） 五五

24、電化學(xué)法（電化學(xué)法（electrochemicalelectrochemical）lpHpH測(cè)定法：測(cè)定法：用高靈敏度的pH計(jì)，跟蹤反應(yīng)過程中H+變化的情況，用pH的變化來測(cè)定酶的反應(yīng)速率。l離子選擇電極法：離子選擇電極法：測(cè)定某些酶的酶活力，用氧電極可以測(cè)定一些耗氧的酶反應(yīng)，如葡糖氧化酶的活力就可用這個(gè)方法很方便地測(cè)定。 第二節(jié)第二節(jié) 酶法分析酶法分析l 一、終點(diǎn)測(cè)定法一、終點(diǎn)測(cè)定法 l 二、反應(yīng)速度法二、反應(yīng)速度法 一、原理一、原理是在以待測(cè)物質(zhì)為底物的酶反應(yīng)中，如果是在以待測(cè)物質(zhì)為底物的酶反應(yīng)中，如果能使底物能夠接近完全地轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，而能使底物能夠接近完全地轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，而且底物或產(chǎn)物又具

25、有某種特征性質(zhì)，通過且底物或產(chǎn)物又具有某種特征性質(zhì)，通過直接測(cè)定轉(zhuǎn)化前后底物的減少量，產(chǎn)物的直接測(cè)定轉(zhuǎn)化前后底物的減少量，產(chǎn)物的增加量或輔酶的變化就可以定量待測(cè)物增加量或輔酶的變化就可以定量待測(cè)物平衡法平衡法 l用于復(fù)雜組分中結(jié)構(gòu)或物理化學(xué)性質(zhì)比較用于復(fù)雜組分中結(jié)構(gòu)或物理化學(xué)性質(zhì)比較 相近的同類物質(zhì)的相近的同類物質(zhì)的分離鑒定和分析分離鑒定和分析。l特異性強(qiáng)、干擾少、操作簡(jiǎn)單、樣品和試特異性強(qiáng)、干擾少、操作簡(jiǎn)單、樣品和試 劑用量少，測(cè)定快速精確，靈敏度高等特劑用量少，測(cè)定快速精確，靈敏度高等特 點(diǎn)。點(diǎn)。l通過了解酶對(duì)底物的特異性，可以預(yù)料可能通過了解酶對(duì)底物的特異性，可以預(yù)料可能 發(fā)生的干擾反應(yīng)

26、并設(shè)法糾正。發(fā)生的干擾反應(yīng)并設(shè)法糾正。l可用偶聯(lián)反應(yīng)。可用偶聯(lián)反應(yīng)。l無污染或污染很少的分析方法。無污染或污染很少的分析方法。優(yōu)優(yōu) 點(diǎn)點(diǎn) ：一、終點(diǎn)測(cè)定法一、終點(diǎn)測(cè)定法l1.原理原理：先借助酶反應(yīng)（單獨(dú)的反應(yīng)或幾種酶：先借助酶反應(yīng)（單獨(dú)的反應(yīng)或幾種酶構(gòu)成的偶數(shù)酶反應(yīng)）使被測(cè)物質(zhì)定量地進(jìn)行轉(zhuǎn)構(gòu)成的偶數(shù)酶反應(yīng)）使被測(cè)物質(zhì)定量地進(jìn)行轉(zhuǎn)變，然后在轉(zhuǎn)化完成后，變，然后在轉(zhuǎn)化完成后，測(cè)定底物、產(chǎn)物或輔測(cè)定底物、產(chǎn)物或輔酶物質(zhì)（第二底物）等的變化量酶物質(zhì)（第二底物）等的變化量。l2.一般采用的測(cè)定方法：一般采用的測(cè)定方法：l光吸收、熒光之類的分光光度法光吸收、熒光之類的分光光度法l測(cè)定氣體產(chǎn)生與吸收的測(cè)壓量

27、氣法（華勃氏測(cè)定氣體產(chǎn)生與吸收的測(cè)壓量氣法（華勃氏呼吸儀檢壓法）呼吸儀檢壓法）l檢知檢知pH值變化的滴定法值變化的滴定法l同位素跟蹤測(cè)定法同位素跟蹤測(cè)定法（一）終點(diǎn)法條件（一）終點(diǎn)法條件 l 1酶的底物特異性（專一性）酶的底物特異性（專一性）：具有高度的：具有高度的底物專一性，有一些酶是呈族特異性；底物專一性，有一些酶是呈族特異性； l 2反應(yīng)的平衡反應(yīng)的平衡 ：l酶反應(yīng)若平衡十分偏向進(jìn)行方向，則可方便地酶反應(yīng)若平衡十分偏向進(jìn)行方向，則可方便地用終點(diǎn)測(cè)定法檢測(cè)；用終點(diǎn)測(cè)定法檢測(cè)；l但若反應(yīng)的平衡并不十分偏向進(jìn)行方向，或者但若反應(yīng)的平衡并不十分偏向進(jìn)行方向，或者偏向逆方向，此時(shí)由于反應(yīng)不能完全，

28、因而反偏向逆方向，此時(shí)由于反應(yīng)不能完全，因而反應(yīng)就不能正確定量，解決這一問題，通?？刹蓱?yīng)就不能正確定量，解決這一問題，通?？刹扇∫恍┐胧?。取一些措施。 反應(yīng)的平衡反應(yīng)的平衡谷氨酸谷氨酸+ +NAD+H2Oa-酮戊二酸酮戊二酸+NADH+NH+谷氨酸脫氫酶谷氨酸脫氫酶NADH+丙酮酸丙酮酸乳酸乳酸+ NAD+乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶l 3反應(yīng)液中的酶量反應(yīng)液中的酶量 ：要使酶反應(yīng)在短時(shí)間內(nèi)：要使酶反應(yīng)在短時(shí)間內(nèi)完成，只有使用對(duì)底物親和性很大的酶（即完成，只有使用對(duì)底物親和性很大的酶（即Km要小），酶用量（即要小），酶用量（即Vmax）必須大才能達(dá)到此）必須大才能達(dá)到此點(diǎn)。工作中，在點(diǎn)。工作中，在10

29、min內(nèi)反應(yīng)完成內(nèi)反應(yīng)完成99%，則常，則常數(shù)數(shù)K以以1.0min-1為宜。為宜。l 4反應(yīng)產(chǎn)物抑制：反應(yīng)產(chǎn)物抑制：如果產(chǎn)物對(duì)反應(yīng)本身有抑如果產(chǎn)物對(duì)反應(yīng)本身有抑制作用，則會(huì)妨礙反應(yīng)進(jìn)行，在這種情況下可制作用，則會(huì)妨礙反應(yīng)進(jìn)行，在這種情況下可將該產(chǎn)物除去或者和再生系統(tǒng)偶聯(lián)等辦法解決。將該產(chǎn)物除去或者和再生系統(tǒng)偶聯(lián)等辦法解決。 反應(yīng)產(chǎn)物抑制反應(yīng)產(chǎn)物抑制S+ATPP+ADP丙酮酸丙酮酸丙酮酸激酶丙酮酸激酶磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸S激酶激酶（二）終點(diǎn)法種類（二）終點(diǎn)法種類l1單酶反應(yīng)定量法：?jiǎn)蚊阜磻?yīng)定量法：（1）底物減少量的測(cè)定底物減少量的測(cè)定：在以待測(cè)物質(zhì)為：在以待測(cè)物質(zhì)為底物的酶反應(yīng)中，如

30、果底物能接近完全地底物的酶反應(yīng)中，如果底物能接近完全地轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，且又具有某種特征性質(zhì)（例轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，且又具有某種特征性質(zhì)（例如特征的吸收譜帶）時(shí)，則就可能簡(jiǎn)便地如特征的吸收譜帶）時(shí)，則就可能簡(jiǎn)便地通過直接測(cè)定底物的減少量，而定量待測(cè)通過直接測(cè)定底物的減少量，而定量待測(cè)物。物。 （二）終點(diǎn)法種類（二）終點(diǎn)法種類（2）產(chǎn)物增加量的測(cè)定產(chǎn)物增加量的測(cè)定：在以被測(cè)物為底：在以被測(cè)物為底物的酶的反應(yīng)中，如果底物基本上都能轉(zhuǎn)物的酶的反應(yīng)中，如果底物基本上都能轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，而產(chǎn)物又具有可以專一地進(jìn)行變?yōu)楫a(chǎn)物，而產(chǎn)物又具有可以專一地進(jìn)行定量測(cè)定的性質(zhì)，那么根據(jù)產(chǎn)物增加就能定量測(cè)定的性質(zhì)，那么根據(jù)產(chǎn)物增加就能檢

31、知底物的量。檢知底物的量。（3）輔酶變化量的測(cè)定輔酶變化量的測(cè)定：以：以NAD或或NADP為輔酶的脫氫酶反應(yīng)，通過測(cè)定為輔酶的脫氫酶反應(yīng)，通過測(cè)定340nm吸收度的變化，就能對(duì)作為相應(yīng)脫氫酶底吸收度的變化，就能對(duì)作為相應(yīng)脫氫酶底物的物質(zhì)進(jìn)行定量分析。物的物質(zhì)進(jìn)行定量分析。 1. 羥基丙酮酸的定量測(cè)定羥基丙酮酸的定量測(cè)定羥基丙酮酸羥基丙酮酸+NADH+H+NADH+HDD甘油酸甘油酸+NAD+NAD+ +L-L-谷氨酸谷氨酸+NAD+NAD+ +H+H2 2O O甘油酸甘油酸脫氫酶脫氫酶2. L-2. L-谷氨酸谷氨酸的定量測(cè)定的定量測(cè)定a-酮戊二酸酮戊二酸+NADH+NH+NADH+NH4 4

32、+ +谷氨酸脫氫酶谷氨酸脫氫酶l2和指示酶反應(yīng)偶聯(lián)的定量法和指示酶反應(yīng)偶聯(lián)的定量法（1）以脫氫酶為指示劑以脫氫酶為指示劑：用來作為偶聯(lián)指：用來作為偶聯(lián)指示劑的酶中應(yīng)用得最廣泛的是以示劑的酶中應(yīng)用得最廣泛的是以NAD或或NADP為輔酶的脫氫酶類為輔酶的脫氫酶類 （2）以脫氫酶以外的酶作指示劑以脫氫酶以外的酶作指示劑：參與某：參與某些色素氧化還原的酶中有的可用作指示劑，些色素氧化還原的酶中有的可用作指示劑，反應(yīng)的進(jìn)行可由吸收度的變化來測(cè)定。反應(yīng)的進(jìn)行可由吸收度的變化來測(cè)定。 2 2、和指示酶反應(yīng)偶聯(lián)的定量法、和指示酶反應(yīng)偶聯(lián)的定量法以脫氫酶為指示劑以脫氫酶為指示劑1-1-磷酸磷酸- -葡萄糖葡萄糖

33、6-6-磷酸磷酸- -葡萄糖葡萄糖磷酸葡萄糖變位酶磷酸葡萄糖變位酶1 1，6-6-二磷酸葡萄糖二磷酸葡萄糖6-6-磷酸磷酸- -葡萄糖葡萄糖+NADP+NADP6-6-磷酸磷酸- -葡萄糖醛酸葡萄糖醛酸+NADPH+H+NADPH+H+ +6-6-磷酸磷酸- -葡萄糖脫氫酶葡萄糖脫氫酶D-2-D-2-磷酸甘油酸磷酸甘油酸磷酸烯醇丙酮酸磷酸烯醇丙酮酸烯醇化酶烯醇化酶磷酸烯醇丙酮酸磷酸烯醇丙酮酸+ADP+ADP丙酮酸激酶丙酮酸激酶丙酮酸丙酮酸+ATP+ATP丙酮酸丙酮酸+NADH+H+NADH+H+ +乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶乳酸乳酸+NAD+NAD+ +以脫氫酶以外的酶為指示劑以脫氫酶以外的酶為指示

34、劑D-D-葡萄糖的定量測(cè)定葡萄糖的定量測(cè)定葡萄糖葡萄糖葡萄糖醛酸葡萄糖醛酸+H+H2 2O O2 2H H2 2O O2 2 +4-+4-氨基安替比林酚氨基安替比林酚醌亞膠色素醌亞膠色素+4H+4H2 2O O葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶過氧化物酶過氧化物酶二、反應(yīng)速度法二、反應(yīng)速度法反應(yīng)速度法反應(yīng)速度法是在一定條件下（一定是在一定條件下（一定pHpH值和值和溫度），測(cè)定反應(yīng)的初速度，而反應(yīng)的初溫度），測(cè)定反應(yīng)的初速度，而反應(yīng)的初速度與被測(cè)物質(zhì)的濃度成正比關(guān)系，因此速度與被測(cè)物質(zhì)的濃度成正比關(guān)系，因此可根據(jù)初速度計(jì)算被測(cè)物質(zhì)的量，也可利可根據(jù)初速度計(jì)算被測(cè)物質(zhì)的量，也可利用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照法計(jì)算被測(cè)物質(zhì)的量。用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照法計(jì)算被測(cè)物質(zhì)的量。特特 點(diǎn)點(diǎn) ：測(cè)定速度快測(cè)定速度快試劑用量少試劑用量少成本低成本低對(duì)濁度和色素的干擾不敏感對(duì)濁度和色素的干擾不敏感不需要考慮反應(yīng)是否進(jìn)行完全不需要考慮反應(yīng)是否進(jìn)