肺炎鏈球菌表面蛋白在細(xì)菌體外粘附中的介導(dǎo)作用

1、    肺炎鏈球菌表面蛋白在細(xì)菌 體外粘附中的介導(dǎo)作用        【 摘要 】目的在體外研究肺炎鏈球菌表面蛋白對(duì)細(xì)菌粘附于宿主細(xì)胞的介導(dǎo)作用。 方法用FITC熒光標(biāo)記肺炎鏈球菌(S、S)，用蛋白質(zhì)合成抑制劑，RNA合成抑制劑和神經(jīng)氨酸酶分別處理肺炎鏈球菌和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后，在體外觀察這些因素對(duì)細(xì)菌與巨噬細(xì)胞粘附率的影響；另外觀察細(xì)菌細(xì)胞壁提取物對(duì)上述粘附率的影響。 結(jié)果證實(shí)了粘附過(guò)程存在劑量依賴和時(shí)間依賴的關(guān)系，是特異的粘附過(guò)程。用多因素分別處理肺炎鏈球菌和巨

2、噬細(xì)胞后，其粘附率的改變與肺炎鏈球菌合成RNA和蛋白質(zhì)有關(guān)，需要肺炎鏈球菌識(shí)別巨噬細(xì)胞表面糖蛋白結(jié)構(gòu)的受體。肺炎鏈球菌可溶性細(xì)胞壁成分能與完整肺炎鏈球菌同樣有對(duì)巨噬細(xì)胞的粘附，去蛋白細(xì)胞壁成分則無(wú)此作用。 結(jié)論提示細(xì)菌表面蛋白介導(dǎo)了這一粘附過(guò)程?！?主題詞 】鏈球菌，肺炎巨噬細(xì)胞細(xì)菌粘附細(xì)胞壁膜糖蛋白類 The mediatory effects of pneumococcal surface proteins on the adherence of bacteria to host cell in vitroHuang Bin, Yin Yibing, Kang Gefei.Departme

3、nt of Clinical Biochemistry,Faculty of Laboratory Medicine,Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400046【 Abstract 】ObjectiveThe Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae is a major pathogen of pneumonia,sepsis and meningitis. To gain access to tissue within the human host, Strep

4、tococcus pnumoniae must initially attach to the surface of host cell. The recent research reported that the cell wall could mediate Streptococcus pneumoniae attachment to human endothelial cells. Although the factors of pneumococcal adhesions are still currently unknown,the surface proteins of S. pn

5、eumoniae are thought to be the potential candidates. MethodsIn this study,S. pneumoniae(S,S) were labelled by FITC, then the bacteria and mice macrophages were pretreated with the RNA,protein synthetic inhibitors and purified pneumococcal cell wall components,respectively. The effects on the adheren

6、ce between the bacteria and macrophages were studied. ResultsConclusionsThese results suggest that pneumococcal cell wall proteins mediate the interaction. 【 Subject words 】Streptococcus pneumoniaeMacrophagesBacterial adhersionCell wall protein肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)是一種能引起肺炎、腦膜炎和菌血癥等疾病的重要的病原

7、菌1。目前，對(duì)S.pn粘附和致病的機(jī)理還不十分清楚。傳統(tǒng)認(rèn)為S.pn的毒力因子主要是抗吞噬作用的莢膜，最近的研究表明莢膜對(duì)于S.pn早期粘附到宿主細(xì)胞并無(wú)影響，細(xì)胞壁(cellwall,CW)介導(dǎo)S.pn對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，但不清楚是CW中何種成分發(fā)揮作用2。某些細(xì)菌細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)能介導(dǎo)細(xì)菌粘附3，但S.pn表面蛋白質(zhì)是否作為毒力因子介導(dǎo)了粘附過(guò)程尚未見(jiàn)報(bào)道。并且，目前S.pn的莢膜多糖疫苗的免疫保護(hù)作用有局限性，特別是對(duì)兩歲以內(nèi)的幼兒保護(hù)作用較差4。因此，研究S.pn與宿主細(xì)胞的粘附機(jī)制有重要意義。巨噬細(xì)胞是S.pn感染后宿主防御系統(tǒng)的第一道防線，我們通過(guò)在體外研究S.pn與小鼠巨噬細(xì)胞

8、(macrophages)粘附的機(jī)理，探討了參與粘附的病原菌和宿主方面的因素，為進(jìn)一步研究S.pn的致病機(jī)理和抗菌藥物提供參考。材料與方法1. 實(shí)驗(yàn)菌株及熒光標(biāo)記：肺炎鏈球菌S、S標(biāo)準(zhǔn)菌株由中國(guó)醫(yī)科院提供，主要遺傳特性經(jīng)鑒定合格。將S.pn在C+Y半合成培養(yǎng)基中37恒溫水浴靜止培養(yǎng)5，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中、后期取菌液約3ml (A 620= 0.5)離心，PBS洗滌細(xì)菌3次后重新懸浮使?jié)舛冗_(dá)到108 CFU/ml，然后與溶解于0.05mol/L Na2 CO3 和 0.1mol/L NaCl緩沖液中的FITC(1mg/ml)混合，4標(biāo)記1小時(shí)后用PBS洗滌細(xì)菌3次，重新用PBS懸浮使S.pn濃度達(dá)到1

9、08CFU/ml2。2. 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng):取雄性812周齡BALB/c小鼠，腹腔注射1甲基纖維素1ml，72小時(shí)后用RPMI 1640沖洗腹腔收獲巨噬細(xì)胞。收獲的細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后，用含10FCS和青霉素、鏈霉素各100U/ml的RPMI 1640配成5×105/ml，接種于直徑為4cm的小培養(yǎng)皿，37 5CO2條件下培養(yǎng)90分鐘，去除未貼壁細(xì)胞6。3. 肺炎鏈球菌對(duì)巨噬細(xì)胞的粘附實(shí)驗(yàn): 將貼壁生長(zhǎng)的巨噬細(xì)胞(5×105/ml)用PBS洗滌后，加入有血清無(wú)抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基，再加入FITC標(biāo)記的S.pn菌液(5×107CFU/ml)，加入

10、S.pn與巨噬細(xì)胞數(shù)之比為201?；旌虾笈囵B(yǎng)皿放37 5CO2孵箱孵育6小時(shí)，取出后用PBS洗至少5次，去掉未粘附細(xì)菌。在熒光顯微鏡下觀察粘附細(xì)菌，用IF DM-510激發(fā)濾光片，在明視場(chǎng)下計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞數(shù)，暗視場(chǎng)下計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞上粘附的S.pn數(shù)，粘附以100個(gè)巨噬細(xì)胞中粘附的S.pn數(shù)表示。每個(gè)實(shí)驗(yàn)做兩次，每個(gè)標(biāo)本平行3孔，最后結(jié)果以±s表示2。4. 肺炎鏈球菌細(xì)胞壁的提取:將在C+Y半合成培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中、后期的S.pn(A620=0.5)約10ml離心，無(wú)菌PBS洗滌細(xì)菌3次后加入0.5ml含 25g/ml 變?nèi)芫氐脑|(zhì)緩沖液 (含20%蔗糖、 0.0025mol/L

11、 MgSO475. 各種處理因素對(duì)肺炎鏈球菌粘附巨噬細(xì)胞的影響:在進(jìn)行粘附實(shí)驗(yàn)前分別用氯霉素(蛋白質(zhì)合成抑制劑)、慶大霉素(蛋白質(zhì)合成抑制劑)、利福平(RNA合成抑制劑)、萘定酮酸(DNA合成抑制劑)處理S.pn，37 15分鐘，胰酶(蛋白水解酶)處理S.pn，37 10分鐘，神經(jīng)氨酸酶(水解糖蛋白、糖脂上的唾液酸)、CW提取物及去蛋白CW提取物處理巨噬細(xì)胞，37 30分鐘，過(guò)碘酸(糖基氧化劑)、胰酶處理巨噬細(xì)胞，37 10分鐘。再用同樣的方法做粘附實(shí)驗(yàn)，觀察這些因素對(duì)S.pn粘附巨噬細(xì)胞的影響。結(jié)果1. 肺炎鏈球菌對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的粘附動(dòng)力學(xué):結(jié)果表明(見(jiàn)1、2)，S.pn粘附小鼠巨噬細(xì)胞的過(guò)

12、程存在時(shí)間依賴和劑量依賴的關(guān)系，提示粘附作用的發(fā)生是特異的。通過(guò)雙倒數(shù)作法我們求出S粘附巨噬細(xì)胞的H50(粘附為50%最大粘附時(shí)所需的時(shí)間)為1.9小時(shí)，最大粘附Amax為40個(gè)S.pn/100個(gè)巨噬細(xì)胞，S粘附巨噬細(xì)胞的H50為1.5小時(shí)，Amax為200個(gè)S.pn/100個(gè)巨噬細(xì)胞。S粘附巨噬細(xì)胞的A50(粘附為50%最大粘附時(shí)相應(yīng)的S.pn濃度)為3.2×105CFU/ml，S的A50為5×105CFU/ml，結(jié)果表明S更易粘附于巨噬細(xì)胞。1肺炎鏈球菌粘附巨噬細(xì)胞的時(shí)間進(jìn)程曲線Fig 1. Time course for adherence of S.pneumoni

13、ae to macrophages Macrophages were incubated with 5×107 CFU of S.pneumoniae per ml.Adherence is expressed as the number of attached bacteria per 100 macrophages.A:S,B:S2肺炎鏈球菌粘附巨噬細(xì)胞的劑量依賴曲線Fig 2. Dose-response curve for adherence of S.pneumoniae to macrophagesMacrophages were incubated with incre

14、asing concentrations of S.pneumoniae for 6h.Adherence is expressed as the number of attached pneumococci per 100 macrophages.A.S ,B: 2. 各種處理因素對(duì)肺炎鏈球菌粘附小鼠巨噬細(xì)胞的影響(見(jiàn)表1)：結(jié)果表明，用氯霉素、慶大霉素、利福平、胰酶分別處理S.pn后，S.pn對(duì)巨噬細(xì)胞的粘附都降低，提示粘附過(guò)程需要S.pn合成蛋白質(zhì)和RNA，S.pn細(xì)胞表面蛋白質(zhì)介導(dǎo)了粘附過(guò)程。用萘定酮酸處理S.pn后，并不降低粘附，表明粘附過(guò)程可能與DNA合成無(wú)關(guān)。表2結(jié)果表明，用神經(jīng)

15、氨酸酶、過(guò)碘酸、胰酶分別處理巨噬細(xì)胞后粘附都大大降低，用神經(jīng)氨酸酶和胰酶共同處理巨噬細(xì)胞后粘附降低尤為明顯，提示S.pn粘附于巨噬細(xì)胞需要識(shí)別巨噬細(xì)胞表面糖蛋白性質(zhì)的結(jié)構(gòu)。表1各種因素分別處理S后對(duì)粘附的影響Table 1. Effect of different pretreatments of S on S adherence of macrophagesPretreatmentAdherence()P valueControl165.7±10.4Chloramphenicol(30.0g/ml)141.7± 8.7<0.05Gentamicin(40.0g/ml

16、) 133.5± 6.3<0.05Rifampin(32.0g/ml)138.3±10.8<0.05Nalidixic acid(20.0g/ml)161.3± 8.6>0.05Trypsin(0.025) 92.6± 6.5<0.01表2各種因素分別處理巨噬細(xì)胞后對(duì)粘附的影響Table 2. Effect of different pretreatments of macrophages on S adherence of macrophagesPretreatmentAdherence()P valueControl165.7

17、±10.4Neuraminidase(1U/ml)23.5±4.1<0.01Periodic acid(4.0mmol/L)47.8±3.6<0.01Trypsin(0.025)34.2±4.8<0.01Neuraminidase & trypsin10.4±2.5<0.013. 肺炎鏈球菌細(xì)胞壁提取物在粘附中的作用:從3中可以看出，S.pn CW提取物降低了完整S.pn對(duì)巨噬細(xì)胞的粘附，這種作用與CW提取物的量存在劑量依賴關(guān)系。通過(guò)雙對(duì)數(shù)作法求出I50值(抑制率為50最大抑制率時(shí)相應(yīng)的CW提取物濃度)為22.3

18、8g/ml。去蛋白質(zhì)CW作用于巨噬細(xì)胞30分鐘后，完整S.pn對(duì)巨噬細(xì)胞的粘附為160.5±8.3，與對(duì)照(未用CW處理巨噬細(xì)胞)的粘附結(jié)果165.7±10.4相比，P>0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，未提示去蛋白CW提取物對(duì)完整S.pn粘附巨噬細(xì)胞有影響(3)。 討論我們通過(guò)一系列粘附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，S.pn粘附于小鼠巨噬細(xì)胞這個(gè)過(guò)程存在劑量依賴和時(shí)間依賴的關(guān)系，且是特異的，是宿主細(xì)胞和S.pn共同參與的過(guò)程。這個(gè)過(guò)程與S.pn合成RNA和蛋白質(zhì)有關(guān)，可能與合成DNA無(wú)關(guān)，并且需要巨噬細(xì)胞表面糖蛋白性質(zhì)的結(jié)構(gòu)參與。Geelen2曾報(bào)道，無(wú)莢膜的S.pn并不降低對(duì)宿主細(xì)胞的粘附，有

19、無(wú)莢膜對(duì)粘附并無(wú)影響。因此我們的這個(gè)結(jié)果對(duì)于揭示S.pn的早期粘附機(jī)制具有重要意義。已有資料表明，在炎癥激活的宿主細(xì)胞表面，S.pn的受體為PAF受體，所含糖基結(jié)構(gòu)為GlcNAc8，而在靜息期宿主細(xì)胞表面受體為糖脂或糖蛋白，糖基結(jié)構(gòu)為GalNAc1-3Gal、GalNAc 1-4Gal、GlcNAc 1-3Gal9。3肺炎鏈球菌細(xì)胞壁對(duì)完整細(xì)菌粘附巨噬細(xì)胞的影響曲線Fig 3. Inhibition of adherence of S.pneumoniae to macrophages by pneumococcal cell wall(CW)Macrophages were incubate

20、d with increasing concentrations of CW for 30 min prior to addition of intact pneummococci(5×107 CFU/ml).Results were normalized to adherence of S.pneumoniae to control macrophages unincubated with CW,which was set at 100% 我們用變?nèi)芫刈饔肧.pn，37 1小時(shí)后，可得到CW提取物。在處理過(guò)程中，S.pn細(xì)胞表面自溶酶同時(shí)發(fā)揮作用，自溶酶識(shí)別S.pn細(xì)胞壁多糖磷酸

21、膽堿殘基，通過(guò)水解丙氨酸和N-乙酰胞壁酸之間的共價(jià)連接將肽聚糖水解為肽鏈和聚糖骨架10，而變?nèi)芫仄茐腟.pn CW肽聚糖骨架上N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的-1,4糖苷鍵分子連接，因此使S.pn CW肽聚糖骨架水解而保留CW上的蛋白質(zhì)。將用這種方法得到的S.pn CW提取物(含蛋白質(zhì)、聚糖骨架片段、脂多糖等)先與巨噬細(xì)胞作用30分鐘后，再加入完整S.pn觀察其對(duì)巨噬細(xì)胞的粘附，發(fā)現(xiàn)S.pn CW提取物與完整S.pn對(duì)巨噬細(xì)胞具有同樣的粘附作用，而去蛋白CW成分則無(wú)此作用，提示S.pn粘附于巨噬細(xì)胞需要S.pn CW表面蛋白質(zhì)的介導(dǎo)，它通過(guò)識(shí)別小鼠巨噬細(xì)胞表面糖蛋白結(jié)構(gòu)的受體，在S.pn

22、 CW和巨噬細(xì)胞之間形成架橋，從而通過(guò)直接或間接的作用(直接作為粘附素或調(diào)節(jié)粘附素的表達(dá)或介導(dǎo)LTA與宿主細(xì)胞受體連接)介導(dǎo)S.pn粘附于小鼠巨噬細(xì)胞。這為進(jìn)一步研究S.pn的致病機(jī)理，鑒定S.pn CW表面參與粘附的特異蛋白質(zhì)及其生物學(xué)性質(zhì)、功能，以及發(fā)展新一代抗菌藥物奠定了一定基礎(chǔ)。作者單位：400046 重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系參考文獻(xiàn)1Burman LA,Norrby R,Trollfors. Invasive pneumococcal infections: incidence,prepdisposing factors, and prognosis. Rev Infect Dis,1

23、985,7133-142.2Geelen S,Bhallacharyya C,Tuomanen E, et al.The cell wall mediates pneumococcal attachment to and cytopathology in human endothelial cells. Infect Immun,1993,61(4)1538-1543.3Westerlund B, Korhonen TK. Bacterial protein binding to the mammalian extracellular matrix. Mol Microbiol,1993,9687-694.4Alonso De Velasco E,Verheul AFM,Verhoef J,et al. Streptococcus pneumoniae virulence factors, pathogenesis, and vaccines. Rev Microbiol, 1995,59(4)591-603.5Lacks S, Hotchkizz RD. A study