病原細(xì)菌的分離培養(yǎng)

1、病原細(xì)菌的分離培養(yǎng)【實(shí)訓(xùn)目標(biāo)】學(xué)會劃線分離培養(yǎng)的基本要領(lǐng)和方法，了解厭氧菌培養(yǎng)的原理及其方法，熟悉細(xì)菌的分離培養(yǎng)技術(shù)?！局饕獌x器設(shè)備與場地】設(shè)備材料：普通瓊脂平板、斜面、麥康凱平板、接種環(huán)、酒精燈、記號筆、培養(yǎng)箱。場地：傳染病實(shí)驗室【訓(xùn)練內(nèi)容與步驟】（1）需氧菌的分離培養(yǎng)方法 分離培養(yǎng)  其目的是將被檢查的材料作適當(dāng)?shù)南♂?，以便能得到單個菌落。有利于菌落性狀的觀察和對可疑菌作出初步鑒定。其操作方法如下：右手持接種棒，使用前須酒精燈火焰滅菌，滅菌時先將接種環(huán)直立火焰中待燒紅后，再橫向持棒燒金屬柄部分，通過火焰 34 次；用接種環(huán)無菌取樣或取斜面培養(yǎng)物或取液體材料和肉湯培養(yǎng)物一接種環(huán)；接

2、種培養(yǎng)平板時以左手掌托平皿，拇指、食指及中指將平皿蓋揭開成 30º左右的角度（角度越小越好，以免空氣中的細(xì)菌進(jìn)入平皿中將培養(yǎng)基污染）；將所取材料涂布于平板培養(yǎng)基邊緣，然后將多余的細(xì)菌在火焰上燒灼，待接種環(huán)冷卻后再與所涂細(xì)菌輕輕接觸開始劃線，其方法如圖10-1所示；劃線時應(yīng)防止劃破培養(yǎng)基，以 45º為宜，在劃線時不要重疊，以免形成菌苔。 圖1-1細(xì)菌的劃線分離方法純培養(yǎng)菌的獲得與移植法  將劃線分離培養(yǎng)3724hr的平板從培養(yǎng)箱取出，挑取單個菌落，經(jīng)染色鏡檢，證明不含雜菌，此時用接種環(huán)挑取單個菌落，移植于斜面中培養(yǎng)，所得到的培養(yǎng)物，即為純培養(yǎng)物，再作其他各項系列化試

3、驗和致病性試驗等。具體操作方法如下： 兩試管斜面移植時，左手斜持菌種管和被接種瓊脂斜面管，使管口互相并齊，管底部放在拇指和食指之間，松動兩管棉塞，以便接種時容易拔出。右手持接種棒，在火焰上滅菌后，用右手小指和無名指并齊同時拔出兩管棉塞，將管口進(jìn)行火焰滅菌，使其靠近火焰，將接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先在無菌生長的瓊脂上接觸使冷卻，再挑取少許細(xì)菌后拉出接種環(huán)立即伸人另一管斜面培養(yǎng)基上，勿碰及斜面和管壁，直達(dá)斜面底部，從斜面底部開始劃曲線，向上至斜面頂端為止，管口通過火焰滅菌，將棉塞塞好(圖10-2)。接種完畢，接種環(huán)通過火焰滅菌后放下接種棒，最后在斜面管壁上注明菌名、日期，置 37溫箱中培養(yǎng)。圖 1-2

4、細(xì)菌斜面移植從平板培養(yǎng)基上選取可疑菌落移植到瓊脂斜面上作純培養(yǎng)時，則用右手執(zhí)接種棒，將接種環(huán)火焰滅菌。左手打開平皿蓋，挑取可疑菌落，然后左手蓋上平皿蓋后立即取斜面管，按上述方法進(jìn)行接種，培養(yǎng)。 肉湯增菌培養(yǎng)  為了提高由病料中分離培養(yǎng)細(xì)菌的機(jī)會，在用平板培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)的同時，多用普通肉湯做增菌培養(yǎng)，病料中即使細(xì)菌很少，這樣做也多能檢查出。另外用肉湯培養(yǎng)細(xì)菌，以觀察其在液體培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)，也是鑒別細(xì)菌的依據(jù)之一。其操作方法與斜面純培養(yǎng)相同；無菌取病料少許接種增菌培養(yǎng)基或普通肉湯管內(nèi)于37下培養(yǎng)24hr。 穿刺接種 半固體培養(yǎng)基用穿刺法接種，方法基本上與純培養(yǎng)接種相同，不同的是用接

5、種針挑取菌落，垂直刺入培養(yǎng)基內(nèi)。要從培養(yǎng)基表面的中部一直刺入管底然后按原方向垂直退出，若進(jìn)行H2S產(chǎn)生試驗時，將接種針沿管壁穿刺向下即使產(chǎn)生少量H2S，從培養(yǎng)基中也易識別。 （2）厭氧菌的分離培養(yǎng)方法焦性沒食子酸法  利用焦性沒食子酸在堿性溶液內(nèi)能大量吸氧的原理進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。每100cm3 空間用焦性沒食子酸 1g， 10氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液 10ML。其具體方法主要有以下幾種： 單個平皿法:按常規(guī)在血瓊脂平板上劃線接種。將固體石蠟置于一容器中加熱融化。取方形玻板一塊, 中央置紗布或重疊濾紙一小塊, 上面放焦性沒食子酸 0.5g ，加10 氫氧化鈉溶液 0.5ML 后迅速將平皿底倒

6、置于其上，周圍立即用融化石蠟封閉。置 37 溫箱培養(yǎng) 23d ，取出觀察。 試管培養(yǎng)法:取約 100cm3 容積的大試管一支，在管底放焦性沒食子酸 10g 及玻璃珠數(shù)個。將已接種的培養(yǎng)管放入大試管中，加入 20氫氧化鈉溶液 1m1 ，立即將管口用橡皮塞塞緊，必要時周圍封以石蠟，37培養(yǎng)23d觀察之。 干燥器（玻罐）法:計算好容器的體積，根據(jù)其體積稱取焦性沒食子酸（置于平皿內(nèi)）和配制氫氧化鈉溶液。將氫氧化鈉溶液倒入干燥器底部，把盛有焦性沒食子酸的平皿輕輕漂浮于液面上。放好隔板，將接種好的平板或試管置于隔板上，把干燥器蓋蓋上密封（可預(yù)先在罐口抹一薄層凡士林）。輕輕搖動干燥器，使焦性沒食子酸和氫氧化

7、鈉溶液混合，置 37溫箱培養(yǎng)23d，取出觀察。 肝塊（皰肉）肉湯  肝塊（或肉渣）內(nèi)含有谷胱甘肽，可發(fā)生氧化還原反應(yīng)，降低環(huán)境中的氧化勢能；同時還含有不飽和脂肪酸，能吸收環(huán)境中的氧，又因液面上加有液體石蠟隔絕外界空氣從而造成一個適合于一般厭氧菌生長的局部環(huán)境。試驗前先將培養(yǎng)基煮沸 10min ，速放冷水中冷卻，以排除其中空氣，接種時將試管傾斜，使液面露出間隙即可取樣接種，完畢將試管直立置溫箱中培養(yǎng)，移植時可用 1ML 吸管取 0.5ML 培養(yǎng)物至另一管，或用接種環(huán)取多量培養(yǎng)物于另一管。 共棲培養(yǎng)法 將厭氧菌與需氧菌共同培養(yǎng)在一個平板內(nèi)，利用需氧菌生長將氧氣消耗后，厭氧菌才能生長。其方

8、法是將培養(yǎng)平板的一半接種吸收氧氣能力強(qiáng)的需氧菌（如枯草芽胞桿菌），另一半接種厭氧菌，接種好后將平板倒扣在一塊玻璃板上，并用石蠟密封，置 37溫箱中培養(yǎng) 23d 后，即可觀察到需氧菌和厭氧菌生長。 高層瓊脂法（搖振培養(yǎng)法） 加熱融化試管高層瓊脂，冷至 45左右接種厭氧菌，輕輕搖振混勻后立刻置冷水中使其直立凝固。置溫箱中培養(yǎng)，厭氧菌在近管底處生長。（3）細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長特性觀察固體培養(yǎng)基上的生長特性 細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上生長繁殖，可形成菌落。觀察菌落時，主要看以下內(nèi)容：大小:不同細(xì)菌，其菌落大小變化很大。常用其直徑來表示，單位是mm或 um。小菌落如針尖大小，必要時需用放大鏡或低倍鏡觀察，大菌落

9、直徑可達(dá)56mm，甚至更大。形狀:主要有圓形、露滴狀、乳頭狀或油煎蛋狀、云霧狀、放射狀或蛛網(wǎng)狀、同心圓狀、扣狀、扁平和針尖狀等。邊緣特征:有整齊、波浪狀、鋸齒狀、卷發(fā)狀等。表面性狀:有光滑、粗糙、皺褶、顆粒狀、同心圓狀、放射狀等，如圖1-3所示。濕潤度:有干燥和濕潤兩種。隆起度:有隆起、輕度隆起、中央隆起、云霧狀等。色澤及透明度:色澤有白、乳白、黃、橙、紅及無色等；透明度有透明、半透明、不透明等。質(zhì)地:有堅硬、柔軟和黏稠等。溶血性:分為-溶血、-溶血及-溶血(即不出現(xiàn)溶血環(huán))三種；而按溶血環(huán)直徑的大小又可分為強(qiáng)溶血性和弱溶血性兩類。液體培養(yǎng)基上的生長特性渾濁度:有強(qiáng)度渾濁、輕微渾濁、透明三種情

10、況。底層情況:包括有沉淀和無沉淀兩種，有沉淀又可分為顆粒狀和絮狀兩種。表面性狀:分為形成菌膜、菌環(huán)和無變化三種情況。產(chǎn)生氣體和氣味:很多細(xì)菌在生長繁殖的過程中能分解一些有機(jī)物產(chǎn)生氣體，可通過觀察是否產(chǎn)生氣泡或收集產(chǎn)生的氣體來判斷；另一些細(xì)菌在發(fā)酵有機(jī)物時能產(chǎn)生特殊氣味，如魚腥味、醇香味等。色澤:細(xì)菌在生長繁殖的過程中能使培養(yǎng)基變色，如綠色、紅色、黑色等。半固體培養(yǎng)基上的生長特性 有運(yùn)動性的細(xì)菌會沿穿刺線向周圍擴(kuò)散生長，形成倒松樹狀(炭疽桿菌)、試管刷狀(豬丹毒桿菌)；無運(yùn)動性的細(xì)菌則只沿穿刺線呈線狀生長。圖1-3菌落的形狀、邊緣和表面構(gòu)造1.圓形，邊緣整齊，表面光滑 2.圓形，邊緣整齊，表面有同心圓 3.圓形，葉狀邊緣，表面有放射狀皺褶4.圓形，鋸齒狀邊緣，表面不光滑 5.不規(guī)則形，波浪狀邊緣，表面有不規(guī)則皺紋6.圓形，邊緣殘缺不全，表面呈顆粒狀7.毛狀8.根狀【注意事項】（1）細(xì)菌的分離培養(yǎng)必須嚴(yán)格無菌操作。（2）滅菌接種環(huán)或接種針在挑取菌落之前應(yīng)先在培養(yǎng)基上