分子標記種類及概述

1、分子標記概述遺傳標記主要有四種類型: 形態(tài)標記（morphological marker）、細胞標記（cytological markers）、生化標記（Biochemical marker）和分子標記（molecular marker）。分子標記是其中非常重要的一種，他是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映。早在1923年，Sax等就提出利用微效基因與主基因的緊密連鎖，對微效基因進行選擇的設想。但由于形態(tài)標記數(shù)目有限，而且許多標記對育種家來說是不利性狀，因而難以廣泛應用。細胞標記主要依靠染色體核型和帶型，數(shù)目有限。同工酶標記在過去的二、三十年中

2、得到了廣泛的發(fā)展與應用。作為基因表達的產物，其結構上的多樣性在一定的程度上能反映生物DNA組成上的差異和生物遺傳多樣性。但由于其為基因表達加工后的產物，僅是DNA全部多態(tài)性的一部分，而且其特異性易受環(huán)境條件和發(fā)育時期的影響；此外同工酶標記的數(shù)量有限，不能滿足育種需要。近年來，分子生物學的發(fā)展為植物遺傳標記提供了一種基于DNA變異的新技術手段，即分子標記技術。與其它標記方法相比，分子標記具有無比的優(yōu)越性。它直接以DNA形式出現(xiàn)，在植物體的各個組織、各發(fā)育時期均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境的限制，不存在表達與否的問題；數(shù)量極多，基因組變異極其豐富，分子標記的數(shù)量幾乎是無限的；多態(tài)性高，利用大量引物、探

3、針可完成覆蓋基因組的分析；表現(xiàn)為中性，即不影響目標性狀的表達，與不良性狀無必然的連鎖；許多標記為共顯性，對隱性的性狀的選擇十分便利，能夠鑒別出純合的基因型與雜合的基因型，提供完整的遺傳信息。隨著分子生物學技術的發(fā)展，現(xiàn)在DNA分子標記技術已有數(shù)十種，廣泛應用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關系鑒別、基因庫構建、基因克隆等方面。分子標記的概念有廣義和狹義之分。廣義的分子標記是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質。蛋白質標記包括種子貯藏蛋白和同工酶（指由一個以上基因位點編碼的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位點的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式）。狹義分子標記是指能反映生物個

4、體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段。理想的分子標記必須達以下幾個要求：(1) 具有高的多態(tài)性；(2) 共顯性遺傳，即利用分子標記可鑒別二倍體中雜合和純合基因型；(3) 能明確辨別等位基因；(4) 遍布整個基因組；(5) 除特殊位點的標記外，要求分子標記均勻分布于整個基因組；(6) 選擇中性(即無基因多效性)；(7) 檢測手段簡單、快速(如實驗程序易自動化)；(8) 開發(fā)成本和使用成本盡量低廉；(9) 在實驗室內和實驗室間重復性好(便于數(shù)據交換)。但是，目前發(fā)現(xiàn)的任何一種分子標記均不能滿足以所有要求。分子標記種類利用分子標記技術分析生物個體之間DNA序列差別并用于作圖的研究始于1980

5、年。經過十幾年的發(fā)展，現(xiàn)在的DNA標記技術已有幾十種，主要有一下幾大類。一、基于分子雜交的分子標記這類標記利用限制性內切酶酶切及凝膠電泳分離不同生物體的DNA分子，然后用特異探針進行雜交，通過放射性自顯影或非同位素顯色技術揭示DNA的多態(tài)性。（一）限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）限制性片段長度多態(tài)性是出現(xiàn)最早和應用最廣泛的DNA標記技術之一。1974年Grodzicker等創(chuàng)立了該技術，它是一種以DNADNA雜交為基礎的第一代遺傳標記。RFLP標記非常穩(wěn)定，它是一種共顯性標記，在分離群體中可區(qū)分純合體與雜合體，提

6、供標記位點完整的遺傳信息。多種農作物的RFLP分子遺傳圖譜已經建成。但其分析所需DNA量較大，步驟較多，周期長，制備探針及檢測中要用到放射性同位素，盡管可用非放射性同位素標記方法代替，但成本高、成功率低，且實驗檢測步驟較多，依然影響其使用、推廣。自RFLP問世以來，已經在基因定位及分型、遺傳連鎖圖譜的構建、疾病的基因診斷等研究中仍得到了廣泛的應用。RFLP基本原理：利用特定的限制性內切酶識別并切割不同生物個體的基因組DNA，得到大小不等的DNA片段，所產生的DNA數(shù)目和各個片段的長度反映了DNA分子上不同酶切位點的分布情況。通過凝膠電泳分析這些片段，就形成不同帶，然后與克隆DNA探針進行Sou

7、thern雜交和放射顯影，即獲得反映個體特異性的RFLP圖譜。它所代表的是基因組DNA在限制性內切酶消化后產生片段在長度上差異。由于不同個體的等位基因之間堿基的替換、重排、缺失等變化導致限制內切酶識別和酶切發(fā)生改變從而造成基因型間限制性片段長度的差異。圖7-2 RFLP圖譜（二）小衛(wèi)星DNA（Minisatellite DNA）小衛(wèi)星DNA（Minisatellite DNA）又稱數(shù)目可變串聯(lián)重復序列（Variable Number of Tandem Repeat，VNTR）是一種重復DNA小序列，為10到幾百核苷酸，拷貝數(shù)1010000不等。多態(tài)性由于重復單位之間的不平衡交換，從而產生不同

8、等位基因，可通過雜交檢測出。其缺點是多態(tài)性分布集中，數(shù)量有限，而且在基因組上分布不均勻，合成探針困難，實驗操作繁瑣、檢測時間長、成本高，因此應用并不廣泛。VNTR基本原理與RFLP大致相同，只是對限制性內切酶和DNA探針有特殊要求：(1)限制性內切酶的酶切位點必須不在重復序列中，以保證小衛(wèi)星或微衛(wèi)星序列的完整性。(2)內切酶在基因組的其他部位有較多酶切位點，則可使衛(wèi)星序列所在片段含有較少無關序列，通過電泳可充分顯示不同長度重復序列片段的多態(tài)性。(3)分子雜交所用DNA探針核昔酸序列必須是小衛(wèi)星序列或微衛(wèi)星序列，通過分子雜交和放射自顯影后，就可一次性檢測到眾多小衛(wèi)星或微衛(wèi)星位點，得到個體特異性的

9、DNA指紋圖譜。二、基于PCR技術的分子標記（一）、隨機引物的PCR標記(1) 隨機擴增多態(tài)性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）隨機擴增片段長度多態(tài)性DNA，是由Williams和Welsh（1990）同時發(fā)展起來的一項新的遺傳標記技術。RAPD以PCR為基礎而又不同于經典的PCR，一般采用10個核苷酸的DNA序列為引物，擴增時退火溫度降至35左右。與其它標記相比，RAPD具有以下優(yōu)點：a）技術簡單，檢測速度快；b）成本較低；c）不依賴于種屬的特異性和基因組的結構，合成的一套引物可用于不同生物基因組的分析；d）操作簡單，可實現(xiàn)自動化，短期內可利

10、用大量引物完成覆蓋基因組的分析；e）不需制備探針、雜交等程序，成本較低；f）DNA用量少（10ngDNA即可完成一次分析），允許快速、簡單地分離基因組DNA。同時RAPD也存在一些缺點：a）RAPD標記是一個顯性標記，不能鑒別雜合子和純合子；b）存在共遷移問題，凝膠電泳只能分開不同長度DNA片段，而不能分開那些分子量相同但堿基序列組成不同的DNA片段；c）RAPD技術中影響因素很多，所以實驗的穩(wěn)定性和重復性差?；驹恚核抢秒S機引物（一般為810bp）通過PCR反應非定點擴增DNA片段，然后用凝膠電泳分析擴增產物DNA片段的多態(tài)性。擴增片段多態(tài)性便反映了基因組相應區(qū)域的DNA多態(tài)性。RAP

11、D所使用的引物各不相同，但對任一特定引物，它在基因組DNA序列上有其特定的結合位點，一旦基因組在這些區(qū)域發(fā)生DAN片段插人、缺失或堿基突變，就可能導致這些特定結合位點的分布發(fā)生變化，從而導致擴增產物數(shù)量和大小發(fā)生改變，表現(xiàn)出多態(tài)性。就單一引物而言，其只能檢測基因組特定區(qū)域DNA多態(tài)性，但利用一系列引物則可使檢測區(qū)域擴大到整個基因組，因此，RAPD可用于對整個基因組DNA進行多態(tài)性檢測，也可用于構建基因組指紋圖譜。RAPD已在遺傳圖譜構建、種質資源分析、基因標記等方面得到了廣泛的應用。圖7-4 RAPD圖譜（2）任意引物PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Cha

12、in Reaction， APPCR)在APPCR分析中，所使用的引物較長(1050 bp) ， PCR反應分為兩個階段，首先寡核昔酸引物在低嚴謹條件下與模板DNA退火，此時發(fā)生了一些合成，以便穩(wěn)定模板與引物之間相互作用。然后進行高嚴謹退火條件的循環(huán)，兩個位點間那些序列在低嚴謹度退火條件下發(fā)生的引物延伸可繼續(xù)在高嚴謹條件下擴增。采用變性聚丙烯酞胺凝膠電泳分析PCR產物，最終反應結果與RAPD類似。只要設計的引物在低嚴謹退火條件下能減少引物產生人為產物，應用成對組合的引物可以產生新的APPC R譜帶，但引物配對組合使用時，得到的圖譜與單引物單獨使用時產生的圖譜之和很不相同，這樣，50個引物能產生

13、1250種不同指紋圖譜。APPCR方法不需預知序列資料，而且檢測的基因組樣本是任意的，還能夠用于檢測近等基因系(或同類系)中的多態(tài)性。APPCR的缺點是每個新的多態(tài)性都必須經純化才能進一步使用。另外，此方法在雜合體中僅可辨別長度多態(tài)性。（3）DNA擴增指紋印跡(DNA Amplification Fingerprinting，DAF)DAF是一種改進的RAPD分析技術，與RAPD技術不同的是，DAF分析中所使用的引物濃度更高，長度更短(一般為5一8 bp)，因此它所提供的譜帶信息比RAPD大得多，如當使用5個核昔酸的引物時，引物和模板的組合大約可擴增出10一100個DNA片段。PCR擴增產物是

14、在凝膠上進行分離，通過銀染即可產生非常復雜帶型。（二）、特異引物的PCR標記特異引物的PCR標記所用引物是針對已知序列的 DNA 區(qū)段而設計的，具有特定核苷酸序列（通常為 1824 bp），可在常規(guī)PCR復性溫度下進行擴增，對基因組 DNA 的特定區(qū)域進行多態(tài)性分析。（1）序列標志位點(Sequence Tagged Sites，STS)STS是對以特定對引物序進行PCR特異擴增的一類分子標記的統(tǒng)稱。通過設計特定的引物，使其與基因組DNA序列中特定結合位點結合，從而可用來擴增基因組中特定區(qū)域，分析其多態(tài)性。利用特異PCR技術的最大優(yōu)點是它產生信息非常可靠，而不像RFLP和RAPD那樣存在某種模

15、糊性。（2）簡單重復序列(Simple Sequence Repeat，SSR)簡單重復序(SSR)也稱微衛(wèi)星DNA，也可稱為SSRP(Simple Sequence Repeat Polymorphisms)，STMS (Sequence-tagged microsatellites)。其串聯(lián)重復的核心序列為1一6 bp，其中最常見是雙核昔酸重復，即(CA) n和(TG) n每個微衛(wèi)星DNA的核心序列結構相同，重復單位數(shù)目10一60個，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。SSR標記的基本原理：根據微衛(wèi)星序列兩端互補序列設計引物，通過PCR反應擴增微衛(wèi)星片段，由于核心序列串聯(lián)重復數(shù)目不同，因

16、而能夠用PCR的方法擴增出不同長度的PCR產物，將擴增產物進行凝膠電泳，根據分離片段的大小決定基因型并計算等位基因頻率。SSR具有以下一些優(yōu)點：(l)一般檢測到的是一個單一的多等位基因位點；(2)微衛(wèi)星呈共顯性遺傳，故可鑒別雜合子和純合子；(3)所需DNA量少。顯然，在采用SSR技術分析微衛(wèi)星DNA多態(tài)性時必須知道重復序列兩端的DNA序列的信息。如不能直接從DNA數(shù)據庫查尋則首先必須對其進行測序。（3）序列特異性擴增區(qū)(Sequencecharacterized Amplified Region，SCAR)SCAR標記是在RAPD技術基礎上發(fā)展起來的。SCAR標記是將目標 RAPD 片段進行克

17、隆并對其末端測序，根據 RAPD 片段兩端序列設計特異引物，對基因 DNA 片段再進行PCR特異擴增，把與原RAPD片段相對應的單一位點鑒別出來。SCAR標記是共顯性遺傳，待檢 DNA 間的差異可直接通過有無擴增產物來顯示。SCAR標記方便、快捷、可靠，可以快速檢測大量個體，結果穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高。（4）單引物擴增反應(Single Primer Amplificatipn Reawtion，SPAR)SPAR技術是與RAPD技術相似的一種標記技術，SPAR也只用一個引物，但所用的引物是在SSR的基礎上設計的。這些引物能與SSR之間的間隔序列進行特異性結合，然后通過P(：R技術擴增SSR之間的

18、DNA序列，凝膠電泳分離擴增產物，分析其多態(tài)性。另外，還有一種與SPAR技術非常相似的標記技術，即ISTR ( Inverse Sequencetagged Repeat)技術，ISTR所用的引物是在反向重復序列基礎上設計的，PCR擴增的是反向重復序列之間的DIVA序列。（5）DNA單鏈構象多態(tài)性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP)SSCP是指等長的單鏈DNA因核昔酸序列的差異而產生構象變異，在非變性聚丙烯酞胺中的表現(xiàn)為電泳遷移率的差別。單鏈DNA構象分析對DNA序列的改變非常敏感，常常一個堿基差別都能顯示出來。在SSCP分析中，利用PC

19、R技術定點擴增基因組DNA中某一目的片段，將擴增產物進行變性處理，雙鏈DNA分開成單鏈，再用非變性聚丙烯酞胺凝膠電泳分離，根據條帶位置變化來判斷目的片段中是否存在突變。SSCP結果判定是通過多個樣品之間對比，觀察條帶之間位置改變，從而顯示出不同生物個體的DNA特異性，達到指紋分析目的。為了進一步提高SSCP的檢出率，可將SSCP分析與其它突變檢測方法相結合。其中與雜交雙鏈分析(Heterocluplex analysis，Het)法結合可以大大提高檢出率。Het法是用探針與要檢測的單鏈DNA或RNA進行雜交，含有一對堿基對錯配的雜交鏈可以和完全互補的雜交鏈在非變性PAG凝膠上通過電泳被分離開。

20、對同一靶序列分別進行SSCP和Het分析可以使點突變的檢出率接近100%，而且實驗簡便。（6）雙脫氧化指紋法(Dideoxy Fingerprints，ddF )ddF是將雙脫氧末端終止測序法與SSCP結合起來的分析技術，對由雙脫氧末端終止的長短不一的單鏈DNA進行SSCP分析。如果目的片段存在一個突變，則所有大于某一大小對應于突主變位置的雙脫氧終止片段無野生型系統(tǒng)，對于每一個突有多次機會檢測其遷移率改變，提高了檢測突變的效率。ddF方法克服了SSCP分析時因DNA長度影響SSCP顯示的困難，通過一種雙脫氧核昔酸生產特異性的單鏈DNA，使其中長度合適的DNA片段顯示SSCP改變。（7）DAMD

21、 (directed amplification of minisatellite region DNA)直接用小衛(wèi)星的核心序列作引物進行擴增。（8）Inter-Alu PCR like genomic profiling與SPAR技術相近，也只用一個引物，但所用的引物是在Alu序列（為中等重復序列）的基礎上設計的，擴增的是Alu序列之間的DNA序列。 （9）ISTR (inverse sequence-tagged repeat)這種技術與SPAR技術也相近，也所用的引物是在copia序列反向重復序列的基礎上設計的，擴增的是copia序列之間的DNA序列。（10）IFLP (intron f

22、ragment length polymorphism) 檢測的對象是內含子的長度差異。（11）RAMPO (random amplified microsatellite polymorphism)RAMPO的英文全名與RAMP的英文全名相近，但實驗方法卻不同。RAMPO的基本步驟是：先用一個單一的隨機引物（即RAPD引物）對基因組DNA擴增，用電泳將擴增片段分開，然后，把凝膠轉移到尼龍膜上，使之與一個帶有放射性標記（或其它標記）的與SSR互補的寡核苷酸探針（如CA8和ga8）雜交，放射自顯影后可得到新的多態(tài)性類型。（12）RFLP-PCR先找到RFLP標記后，對RFLP探針進行測序，再合成

23、適當?shù)腜CR引物，這樣可發(fā)現(xiàn)新的STS標記。這也可稱為RFLP-PCR。 (13) SRAP 技術 簡單序列重復(Inter-simple sequence repeat)(sequence-specific amplification polymorphism)相關序列擴增多態(tài)性(Sequencerelated amplifiedpolymorphism，SRAP)是一種新型的基于PCR的標記系統(tǒng)，是由美國加州大學蔬菜系Li與Quiros博士于2001年在蕓薹屬作物開發(fā)出來。該標記通過獨特的雙引物設計對基因的ORFs(Open reading frames)的特定區(qū)域進行擴增，上游引物長17

24、bp，對外顯子區(qū)域進行特異擴增。下游引物長18bp，對內含子區(qū)域、啟動子區(qū)域進行特異擴增。因不同個體以及物種的內含子、啟動子與間隔區(qū)長度不同而產生多態(tài)性。該標記具有簡便、高效、產率高、高共顯性、重復性好、易測序、便于克隆目標片段的特點。目前已成功地應用于作物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構建、重要性狀的標記以及相關基因的克隆等方面. 三、 基于限制性酶切和PCR技術的DNA標記（一）擴增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP )AFLP是1993年荷蘭科學家Zbaeau和Vos發(fā)展起來的一種檢測DN A多態(tài)性的新方法。AFLP 是 R

25、FLP 與PCR相結合的產物，其基本原理是先利用限制性內切酶水解基因組 DNA 產生不同大小的 DNA 片段，再使雙鏈人工接頭的酶切片段相邊接，作為擴增反應的模板 DNA，然后以人工接頭的互補鏈為引物進行預擴增，最后在接頭互補鏈的基礎上添加 13個選擇性核苷酸作引物對模板 DNA 基因再進行選擇性擴增，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測獲得的DNA擴增片段，根據擴增片段長度的不同檢測出多態(tài)性。引物由三部分組成：與人工接頭互補的核心堿基序列、限制性內切酶識別序列、引物3端的選擇堿基序列（110 bp）。接頭與接頭相鄰的酶切片段的幾個堿基序列為結合位點。該技術的獨特之處在于所用的專用引物可在知道 DN

26、A 信息的前提下就可對酶切片段進行PCR 擴增。為使酶切濃度大小分布均勻，一般采用兩個限制性內切酶，一個酶為多切點，另一個酶切點數(shù)較少，因而 AFLP 分析產生的主要是由兩個酶共同酶切的片段。AFLP 結合了 RFLP 和 RAPD兩種技術的優(yōu)點，具有分辨率高、穩(wěn)定性好、效率高的優(yōu)點。但它的技術費用昂貴，對 DNA 的純度和內切酶的質量要求很高。盡管 AFLP 技術誕生時間較短，但可稱之為分子標記技術的又一次重大突破，被認為是目前一種十分理想、有效的分子標記。圖7-5 AFLP的銀染檢測結果（二）酶切擴增多態(tài)性序列(Cleaved Amplified Polymorphism Sequence

27、s，CAPS )CAPS技術又稱為PCRRFLP，它實質上是PCR技術與RFLP技術結合的一種方法。CAPS的基本原理是利用己知位點的DNA序列資源設計出一套特異性的PCR引物(1927bp），然后用這些引物擴增該位點上的某一DNA片段，接著用一種專一性的限制性內切酶切割所得擴增產物，凝膠電泳分離酶切片段，染色并進行RFLP分析。GAPS標記揭示的是特異PGR片段的限制性長度變異的信息。CAPS是一類共顯性分子標記，其優(yōu)點是避免了RFLP分析中膜轉印這一步驟，又能保持RFLP分析的精確度。另外，由于很多限制性內切酶均可與擴增DNA酶切，所以檢測到多態(tài)性機會較大。四、 基于DNA芯片技術的分子標

28、記技術核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)SNP標記是美國學者Lander E于1996年提出的第三代DNA遺傳標記。SNP是指同一位點的不同等位基因之間僅有個別核苷酸的差異或只有小的插入、缺失等。從分子水平上對單個核苷酸的差異進行檢測，SNP 標記可幫助區(qū)分兩個個體遺傳物質的差異。人類基因組大約每 1000 bp SNP 出現(xiàn)一次，已有2000多個標記定位于人類染色體，對人類基因組學研究具有重要意義。檢測 SNP 的最佳方法是 DNA 芯片技術。SNP 被稱為第三代 DNA 分子標記技術，隨著 DNA 芯片技術的發(fā)展，其有望成為最重要最有效的分子標記技。分子標記的應用領域一、基因組作圖和基因定位研究長期以來，各種生物的遺傳圖譜幾乎都是根據諸如形態(tài)、生理和生化等常規(guī)標記來構建的，所建成的遺傳圖譜僅限少數(shù)種類的生物，而且圖譜分辨率大多很低，圖距大，飽和度低，因而應用價值有限。分子標記用于遺傳圖譜構建是遺傳學領域的重大進展之一。隨著新的標記技術的發(fā)展，生物遺傳圖譜名單上