青島農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞工程教學(xué)計(jì)劃

1、緒論細(xì)胞工程(cell engineering)是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法，借助工程學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法或技術(shù)，在細(xì)胞水平上研究改造生物遺傳特性和生物學(xué)特性，以獲得特定的細(xì)胞、細(xì)胞產(chǎn)品或新生物體的有關(guān)理論和技術(shù)方法的學(xué)科。又稱細(xì)胞技術(shù)，是生物技術(shù)的主要內(nèi)容之一。生物技術(shù)是以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，利用生物體系和工程學(xué)原理生產(chǎn)生物制品和創(chuàng)造新物種的一門(mén)綜合技術(shù)。細(xì)胞工程的研究?jī)?nèi)容：細(xì)胞工程基本技術(shù)；細(xì)胞、組織、器官培養(yǎng)；原生質(zhì)體培養(yǎng)；細(xì)胞融合及培養(yǎng) 生物技術(shù)主要包括：細(xì)胞工程、基因工程、發(fā)酵工程、酶工程、蛋白質(zhì)工程和生物化工程。細(xì)胞學(xué)說(shuō)的提出：施旺，施萊登（1838年）1902年，H aberlandt提

2、出了細(xì)胞全能性學(xué)說(shuō)細(xì)胞工程分類（填空）:植物細(xì)胞工程和動(dòng)物細(xì)胞工程1.細(xì)胞工程的應(yīng)用：（一）、脫毒和快速繁殖 許多植物，特別是無(wú)性繁殖植物，帶有病毒，并直接傳給子代，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和質(zhì)量。一般莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)不帶病毒。所以，利用莖尖培養(yǎng)再生的植株，可能不帶病毒，再進(jìn)行大量繁殖生產(chǎn)脫毒苗。脫毒苗用于生產(chǎn)可明顯提高產(chǎn)量、質(zhì)量和商品價(jià)值。甘薯、馬鈴薯、草莓、果樹(shù)、花卉等。（二）、細(xì)胞工程育種 1. 利用培養(yǎng)變異，篩選優(yōu)良突變體 植物離體培養(yǎng)，能夠明顯提高突變率，并且會(huì)有各種各樣的生理和形態(tài)突變，如株高、花色、植株形態(tài)、生育期、耐性等等?？梢詮闹羞x擇優(yōu)良突變體，培育新品種。2、利用遠(yuǎn)緣雜交幼胚培養(yǎng)，

3、獲得雜種植株，克服其雜交不親和性。有些植物遠(yuǎn)緣雜交，能正常受精，但受精胚往往敗育。此種情況下，可以將幼胚在敗育前進(jìn)行離體培養(yǎng)，以獲得緣遠(yuǎn)雜種植株。3.利用細(xì)胞融合技術(shù)，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性。野生種往往有許多優(yōu)良性狀，但大部分野生種與栽培種雜交不親和，嚴(yán)重影響了野生種優(yōu)良遺傳基因的應(yīng)用。利用細(xì)胞融合，可以克服這種雜交不親和性，獲得體細(xì)胞雜種，使野生種的利用成為可能。（三）、離體種質(zhì)保存隨著地球不斷開(kāi)發(fā)、生態(tài)環(huán)境破壞，種質(zhì)資源日趨枯竭，大量有用基因損失。利用組織培養(yǎng)法，超低溫保存（-196）或試管保存，為保存和搶救瀕臨滅絕的生物帶來(lái)希望。（四）、細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生物質(zhì)，如藥物

4、、色素、食品添加劑、酶、農(nóng)藥等2. 細(xì)胞工程主要研究?jī)?nèi)容（1）動(dòng)植物細(xì)胞與組織培養(yǎng) 主要包括細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和器官培養(yǎng)。（2）細(xì)胞融合（3）染色體工程：按人們的需要來(lái)添加、削減或替換染色體的一種技術(shù)。主要用于新品種的培育。（4）胚胎工程：主要是對(duì)動(dòng)物的胚胎進(jìn)行某種人為的工程技術(shù)操作獲得人們所需要的成體動(dòng)物，包括胚胎分割、胚胎融合、卵核稱植、體外受精、胚胎培養(yǎng)、胚胎移植、性別鑒定、胚胎冷凍技術(shù)等。（5）細(xì)胞遺傳工程：主要包括克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)。第一章實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備及其基本操作技術(shù)第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)最基本應(yīng)該有三室：準(zhǔn)備室、無(wú)菌操作室和培養(yǎng)室第二節(jié) 培養(yǎng)基及其配制1. 培養(yǎng)基的成分及作用

5、2，一般培養(yǎng)基中的五類物質(zhì)各有什么作用？1）無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分，包括大量元素N，P，K，Ga，Mg，S和微量元素Fe, B, Mn, Cu, Co, Zn, Mo等; 2）有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分，常用有機(jī)成分：糖類（蔗糖），維生素，肌醇，腺嘌呤，氨基酸。主要采用的是蔗糖，提供處于異養(yǎng)狀態(tài)的植物組織所需要的碳元素；3）維生素，主要使用的有B1, B6和B5,補(bǔ)充離體狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)生維生素的不足，提高細(xì)胞的活力；4）激素，包括生長(zhǎng)素、分裂素、脫落酸、赤霉素和乙烯。激素：生長(zhǎng)素（根），細(xì)胞分裂素（芽），赤霉素（細(xì)胞伸長(zhǎng)）；5）其他添加物質(zhì)，例如瓊脂作為培養(yǎng)基固化劑、山梨醇作為滲透壓調(diào)節(jié)劑、活性炭作為吸附劑等。4、蔗糖

6、在培養(yǎng)基中有何作用？作為碳源為植物提供能源，為有機(jī)化合物的合成提供碳架，細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)滲透壓，對(duì)形態(tài)的發(fā)生的特殊作用等。11、培養(yǎng)基內(nèi)加入活性炭的目的是什么？應(yīng)注意什么問(wèn)題？活性碳可以吸附非極性物質(zhì)和色素等大分子物質(zhì)，包括瓊脂中所含的雜質(zhì)、培養(yǎng)物分泌的酚和醌類物質(zhì)、蔗糖在高在壓消毒時(shí)產(chǎn)生的5-羥甲糖醛、激素等。2.植物激素5、生長(zhǎng)素類物質(zhì)大致可分為哪幾類，目前植物組織培養(yǎng)中主要使用了哪些生長(zhǎng)素，生長(zhǎng)素在離體培養(yǎng)中有何作用？1.吲哚類，2.奈酸類，3.苯氧羧酸類。植物組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)素一方面用于誘導(dǎo)愈傷組織的形成和生根，另一方面是與一定量的細(xì)胞分裂素配合共同誘導(dǎo)不定芽的分化、側(cè)芽的萌發(fā)與生長(zhǎng)以及某些植

7、物胚狀體的誘導(dǎo)。6、在植物組織培養(yǎng)中，細(xì)胞分裂素有何作用？在植物組織培養(yǎng)中細(xì)胞分裂素的主要功能是促進(jìn)細(xì)胞的分裂和分化，打破頂端優(yōu)勢(shì)，誘導(dǎo)芽分化與增殖，促進(jìn)組織和器官的不定芽發(fā)育。3.幾種常用培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基種類：MS,B5,N6,White(P26)（1）高鹽平衡培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基、LS培養(yǎng)基、BL培養(yǎng)基、BM培養(yǎng)基和ER培養(yǎng)基。特點(diǎn)：無(wú)機(jī)鹽濃度較高，元素間的比例適當(dāng)，離子平衡性好，具有較強(qiáng)的緩沖性；營(yíng)養(yǎng)豐富；微量元素種類全，濃度高。（2）高硝態(tài)氮培養(yǎng)基：B5培養(yǎng)基，N6培養(yǎng)基及SH培養(yǎng)基等。特點(diǎn)：硝酸鉀的含量高，氨態(tài)氮的含量低，含有較高的鹽酸硫胺素。（3）中鹽培養(yǎng)基：H培養(yǎng)基、Nitsch培

8、養(yǎng)基、Miller培養(yǎng)基和Blaydes培養(yǎng)基。特點(diǎn)：大量元素?zé)o機(jī)鹽約為MS的一般，微量元素種類減少而含量增高，維生素種類比MS多。（4）低鹽培養(yǎng)基：White培養(yǎng)基、WS培養(yǎng)基、HE培養(yǎng)基、改良Nitsch培養(yǎng)基及HB培養(yǎng)基等。特點(diǎn)：無(wú)機(jī)鹽含量低，有機(jī)成分含量相對(duì)也很低。4. 培養(yǎng)基的配制1、 生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素母液如何制備？生長(zhǎng)素類(NAA、IBA等)先用12毫升95%酒精將其溶解,然后緩緩加入蒸餾水定容。細(xì)胞分裂素類(6BA、KT等)先用少量(0.51當(dāng)量濃度鹽酸),然后緩緩加入蒸餾水定容,倒入瓶?jī)?nèi),存于冰箱。如發(fā)現(xiàn)貯存后又產(chǎn)生沉淀,可加溫使之溶解后再用。赤霉素需過(guò)濾滅菌。2、 簡(jiǎn)述固體

9、培養(yǎng)基的制備過(guò)程。將燒杯放入適量的水（終體積的3/4左右），按大量元素、微量元素、鐵鹽及有機(jī)成分的順序，依次吸取各母液的需要量。2. 按所需濃度加激素，或其它成分，如AgNO3等。3.  加蔗糖，一般30g/L。4. 定容5、 pH值測(cè)定（5.8） 。6.  加瓊脂，一般6-8g/L，溶化 （電爐、微波爐等）。7.  分注、封口（鋁鉑紙、牛皮紙、塑料紙等）。8.   滅菌 121，20分。第三節(jié) 無(wú)菌操作技術(shù)維持實(shí)驗(yàn)室環(huán)境相對(duì)無(wú)菌應(yīng)采取哪些措施？答：其滅菌方法是通過(guò)氣體熏蒸和紫外線照射或其他方法

10、。氣體熏蒸：熏蒸劑常用甲醛加高錳酸鉀，可用每100ml甲醛加5g高錳酸鉀為一個(gè)使用單位，具體的做法是在每20m2的范圍內(nèi)放置1個(gè)單位劑量。注意：為避免其氣體對(duì)人體的危害并達(dá)到較好的消毒效果，一般熏蒸期間應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室封閉35d。以后在使用過(guò)程中，接種室還應(yīng)定期熏蒸。紫外線照射：用紫外線燈照射0.5h，以保證接種室的無(wú)菌環(huán)境。其他：實(shí)驗(yàn)室每次使用前還可噴灑75%的酒精、過(guò)氧乙酸或2%的新潔而滅溶液進(jìn)行接種室消毒。其他操作室的環(huán)境控制可根據(jù)情況選用紫外燈定期照射或其他方法污染的起因包括四個(gè)方面，1）植物材料表面滅菌不徹底或存在有內(nèi)生菌；2）滅菌設(shè)備和無(wú)菌操作設(shè)備的異常；3）無(wú)菌操作技術(shù)不規(guī)范；4）培養(yǎng)

11、條件不潔凈 第四節(jié) 外植體的選擇與處理外植體：從植物體上分離下來(lái)的用于離體培養(yǎng)的材料。三種來(lái)源：1.生長(zhǎng)在自然環(huán)境下的植物 2.在溫室控制環(huán)境條件下生長(zhǎng)的植物 3.無(wú)菌環(huán)境下培養(yǎng)的植物（最優(yōu)）。1. 外植體的選擇1、選擇優(yōu)良的基因型 實(shí)驗(yàn)首先應(yīng)明確目的。例如，蔬菜、作物等的脫毒快繁，是為了脫去病毒，提高產(chǎn)量和質(zhì)量，就應(yīng)選擇當(dāng)?shù)卦耘啻_認(rèn)的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種作為脫毒材料，并且品種一定要可靠。花卉、觀賞植物的快繁，也應(yīng)選擇有價(jià)值的植物。2、取材從生長(zhǎng)旺盛、健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的植株上取材。母株代謝旺盛期切取的外植體再生能力強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)容易成功。 3、外植體大小選擇 一般0.5-1cm為宜。因外植體不同而不同。如利

12、用莖尖培養(yǎng)，脫毒快繁，外植體宜小，莖尖大小對(duì)脫毒效果非常明顯。再如幼胚培養(yǎng)，胚齡也非常重要。4、 選擇外植體的時(shí)期 外植體的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)往往與該物種的生長(zhǎng)節(jié)律（生物鐘）有關(guān)。因此，最好在植物生長(zhǎng)的最適宜時(shí)期取材培養(yǎng)，會(huì)得到較好效果。（春天生長(zhǎng)旺盛的植株，在春天培養(yǎng)會(huì)取得較好效果）二、外植體的處理1.取材母株的預(yù)處理 人工管理，促使母株生長(zhǎng)旺盛、代謝活躍，從其上取材培養(yǎng)，容易成功。2.外植體休眠的處理 有些植物的種子、幼胚或芽，存在休眠。為了打破休眠，可利用低溫處理，或赤霉素等化學(xué)物質(zhì)處理。因植物不同處理溫度和時(shí)間有所不同。3、 外植體的滅菌 大田或溫室植物材料，都帶有大量的細(xì)菌和真菌，這是組織培養(yǎng)

13、的一大障礙，所以材料必須進(jìn)行殺菌消毒（表面殺菌）。外植體消毒方法：取材后 將老的組織去掉 自來(lái)水沖洗 洗衣粉水洗（簡(jiǎn)單殺菌） 自來(lái)水沖洗 （超凈工作臺(tái)）70%酒精處理 消毒劑處理 滅菌蒸餾水沖洗3-5遍。消毒劑種類有很多，如次氯酸鈉（效果應(yīng)該比較好，無(wú)毒、無(wú)污染，見(jiàn)光氧化，影響殺菌效果）、升汞（效果應(yīng)該比較好）、漂白粉、高錳酸鉀、雙氧水、福爾馬林等。一般多用0.1%升汞。殺毒時(shí)間：一般酒精10秒，升汞5-12分鐘。升汞處理方法：升汞+NaS 絮狀沉淀（至絮狀沉淀不再產(chǎn)生為止） + FeSO4 (中和過(guò)多的NaS)。第五節(jié) 培養(yǎng)條件植物離體培養(yǎng)的環(huán)境條件及其對(duì)培養(yǎng)的影響：溫度大多數(shù)在20-30之

14、間，通?？刂圃?5±2的恒溫條件下培養(yǎng)；一般光照12-16h,光強(qiáng)1000-5000lux。；因此需要通風(fēng)。一般培養(yǎng)容器使用棉塞、鋁箔、專用蓋等封口，容器內(nèi)外空氣是流通的。；濕度過(guò)高過(guò)低都不利于培養(yǎng)物生長(zhǎng)。室內(nèi)相對(duì)濕度70-80。3、離體培養(yǎng)過(guò)程中人工光照的設(shè)置有何規(guī)律？在培養(yǎng)初期、對(duì)于大多數(shù)培養(yǎng)類型來(lái)講只需要散射光或弱光照或黑暗條件下。當(dāng)外植體細(xì)胞啟動(dòng)分裂后或進(jìn)入分化培養(yǎng)階段，則需要根據(jù)植物類型增強(qiáng)光照第二章 細(xì)胞全能性第一節(jié) 培養(yǎng)細(xì)胞展現(xiàn)生命特征屬性1，植物細(xì)胞全能性的概念及其意義：植物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)理論是植物細(xì)胞的全能性理論，即每每個(gè)植物的體細(xì)胞或性細(xì)胞都具有該植物的全套遺基因

15、，并在條件合適的情況下能夠發(fā)揮該物種的各種功能和具有發(fā)育成為一個(gè)正常和完整的獨(dú)立個(gè)體的能力。根據(jù)這一理論，組織培養(yǎng)技術(shù)通過(guò)創(chuàng)造各種合適的培養(yǎng)條件，促使細(xì)胞或組織發(fā)揮某一功能（例如合成藥物）或生長(zhǎng)發(fā)育成完整的個(gè)體以達(dá)到特定的某種目的（例如快速繁殖植物種苗）。2.生命特征屬性：新陳代謝、應(yīng)激性、自我復(fù)制細(xì)胞脫分化（cell dedifferentiation ）：（定義）培養(yǎng)條件下使一個(gè)已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無(wú)分化狀態(tài)或分生細(xì)胞狀態(tài)的過(guò)程就是細(xì)胞脫分化。靜止細(xì)胞啟動(dòng)分裂是分化細(xì)胞成功脫分化的重要標(biāo)志。蛋白體的出現(xiàn)和細(xì)胞質(zhì)密度增加被認(rèn)為是細(xì)胞開(kāi)始脫分化的標(biāo)志。細(xì)胞分化（Differentiation

16、）：（定義）是指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過(guò)程。極性（polarity）：（定義）是指植物的器官、組織、甚至單個(gè)細(xì)胞在不同的軸向上存在的某種形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理生化上的梯度差異。玻璃化：植物組織培養(yǎng)中分化出半透明的畸形試管植株（玻璃化苗）的現(xiàn)象，稱為玻璃化現(xiàn)象。褐變：外植體在脫分化和再分化過(guò)程中，分泌褐色物質(zhì)使培養(yǎng)基和外植體本身變褐的現(xiàn)象。分化細(xì)胞的脫分化需要兩個(gè)條件：創(chuàng)傷和外源激素。簡(jiǎn)述植物細(xì)胞脫分化的過(guò)程啟動(dòng)階段：蛋白體的出現(xiàn)和細(xì)胞質(zhì)增生；演變階段：細(xì)胞核移向中央、質(zhì)體轉(zhuǎn)化成原質(zhì)體；脫分化終結(jié)期：回復(fù)到分生細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞開(kāi)始分裂影響植物細(xì)胞脫分化和再分化的因子：主要

17、包括內(nèi)因和外因兩個(gè)方面。內(nèi)因主要指植物的遺傳特性和生理狀態(tài)。外因主要包括植物細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)條件（無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)、植物激素、天然提取物等）和環(huán)境條件（滲透壓、酸堿度、溫度、濕度、光照等）8、愈傷組織: 在離體培養(yǎng)過(guò)程中形成的具有分生能力的一團(tuán)不規(guī)則細(xì)胞，多在外植體切面上產(chǎn)生。實(shí)質(zhì)上是一團(tuán)無(wú)序生長(zhǎng)的細(xì)胞，這些細(xì)胞大多處于隨機(jī)分裂的狀態(tài)。3. 細(xì)胞分化和組織分化4. 器官分化和植株形成器官發(fā)生方式：1）先芽后根：先分化芽，芽形成后，在芽的基部長(zhǎng)出根進(jìn)而形成完整植株。2）先根后芽：先分化根，再在根上產(chǎn)生不定芽進(jìn)而形成完整植株。3）在愈傷組織的不同部位形成芽和根，再通過(guò)維管組織的聯(lián)系形成完整植株。36、培

18、養(yǎng)條件下，植物細(xì)胞經(jīng)過(guò)再分化形成完整個(gè)體有哪兩種途徑？試比較這兩種途徑。器官發(fā)生途徑胚胎發(fā)生途徑實(shí)現(xiàn)方式愈傷組織誘導(dǎo)形態(tài)發(fā)生和胚狀體發(fā)育兩種途徑體細(xì)胞胚發(fā)生途徑植株類型雙子葉植物，如茄科、菊科、十字花科及豆科的一部分種等多數(shù)集中于禾本科、傘形科、蕓香科、葫蘆科、豆科的一部分種尤其是豆科牧草和裸子植物中的松科注意事項(xiàng)愈傷組織誘導(dǎo)形態(tài)發(fā)生是與適量激素和合適培養(yǎng)基密切相關(guān)的培養(yǎng)過(guò)程中需通過(guò)超低溫保存技術(shù)保存胚性瘀傷組織或定期重新建立胚性懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，且應(yīng)盡可能縮短每個(gè)環(huán)節(jié)的所需時(shí)間，是保持分化的有效措施第三章 植物組織器官培養(yǎng)第一節(jié) 植物組織培養(yǎng)及器官形成1. 植物組織培養(yǎng)的意義植物組織培養(yǎng)：指在無(wú)

19、菌條件下，將離體的植物器官（如根尖、莖尖、葉、花、未成熟的果實(shí)、種子等）、組織（如胚乳、皮層等）、細(xì)胞（體細(xì)胞、生殖細(xì)胞等）、胚胎（成熟和未成熟的胚）、原生質(zhì)體等培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織或完整植株的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。繼代培養(yǎng)：外植體在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間后，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)枯竭、水分散失，并且積累一些代謝產(chǎn)物，需將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)到新的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，這種轉(zhuǎn)移稱為繼代培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)。擬分生組織：是指培養(yǎng)物中出現(xiàn)的類似分生組織的細(xì)胞群，它是脫分化后的培養(yǎng)物發(fā)生一系列細(xì)胞分裂而產(chǎn)生的一團(tuán)小型、薄壁、液泡小的細(xì)胞組織。也叫做生長(zhǎng)中心或分生組織結(jié)節(jié)。植物組織培養(yǎng)的基本步驟：（1）培養(yǎng)材

20、料的采集l（2）培養(yǎng)材料的消毒處理（3）制備外植體（4）接種和培養(yǎng)（5）生根培養(yǎng)l（6）煉苗和移栽l植物快速繁殖技術(shù)在園藝和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的用途，主要有以下幾個(gè)方面：（1）克服高度雜合物種因有性繁殖而引起的后代嚴(yán)重分離。（2）名優(yōu)植物或?yàn)l危植物的快速繁殖。（3）無(wú)病毒苗木生產(chǎn)。（4）單獨(dú)繁殖雌株或雄株。（5）種質(zhì)資源保存。適合進(jìn)行組培快繁的植物有哪些？ 1）,通過(guò)脫毒后繁殖成為不帶病毒（virus free）的植株,由此而使生產(chǎn)力得到大幅度的提高,例如馬鈴薯,香蕉;2）,有性繁殖時(shí)變異幅度大的品系,可以從這些群體中選擇優(yōu)良的個(gè)體,進(jìn)行無(wú)性繁殖,生產(chǎn)出整齊劃一的大量種苗;果樹(shù),蘭花;3）,雌

21、雄異株植物的繁殖,通過(guò)快速繁殖技術(shù)繁殖具有更高栽培價(jià)值的雌性植株或雄性植株,如蘆筍； 4）,需要用目的產(chǎn)品作為種苗材料進(jìn)行種植的物種;如大蒜,甘蔗等； 5）,稀有、瀕危植物種； 6）,自然繁殖率低的新品種，包括新引進(jìn)的品種;離體培養(yǎng)條件下，莖、芽和根的再生方式大致有幾種?在組織培養(yǎng)中，通過(guò)莖芽和根而再生植株的方式大致有3種：1.先芽后根：多數(shù)植物；2.先根后芽：顛茄；3.在不同部位分別形成芽和根，最后通過(guò)微管組織聯(lián)系形成再生植株。簡(jiǎn)述器官發(fā)生的過(guò)程1.愈傷組織誘導(dǎo)，2.“生長(zhǎng)中心”形成，3. 器官原基和器官形成影響器官發(fā)生的因素有哪些？（1）外植體：母體植株的遺傳基礎(chǔ)與生理狀態(tài)，（2）激素(激

22、素調(diào)控理論)，（3）培養(yǎng)基種類和培養(yǎng)方法（物理因素，化學(xué)因素），（4）環(huán)境條件（溫度，光照）第二節(jié) 體細(xì)胞胚胎發(fā)生1. 體細(xì)胞胚胎發(fā)生的途徑及類型2. 體細(xì)胞胚胎發(fā)生的機(jī)制3. 影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生的因素8、影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素有哪些？（1）、外源激素：生長(zhǎng)素特別是2，4-D；（2）培養(yǎng)基：低無(wú)機(jī)鹽濃度和較高的硝態(tài)氮濃度；（3）基因型；（4）組織起源，距活體胚胎發(fā)育較近的組織和成熟及未成熟的胚胎在離體條件下更有利于細(xì)胞胚的誘導(dǎo)。體細(xì)胞胚或胚狀體（定義）：離體培養(yǎng)下沒(méi)有經(jīng)過(guò)受精過(guò)程，但經(jīng)過(guò)了胚胎發(fā)育過(guò)程所形成的胚的類似物（不管培養(yǎng)的細(xì)胞是體細(xì)胞還是生殖細(xì)胞），統(tǒng)稱為體細(xì)胞胚或胚狀體。體細(xì)胞胚胎發(fā)

23、生: 指體細(xì)胞在未經(jīng)性細(xì)胞融合的情況下，模擬有性胚胎發(fā)生的各個(gè)階段而發(fā)育出新個(gè)體的形態(tài)發(fā)生過(guò)程。胚性發(fā)育：幼胚接種到培養(yǎng)基上以后，仍然按照在活體內(nèi)的發(fā)育方式發(fā)育，最后形成成熟胚(有時(shí)甚至可能類似種子)，然后再按種子萌發(fā)途徑出苗形成完整植株離體胚培養(yǎng)：胚培養(yǎng)就是采用人工的方法將胚從種子中分離出來(lái)，在人工培養(yǎng)的條件下，使其他發(fā)育成正常植株。九體細(xì)胞胚的形成途徑：（簡(jiǎn)答）1. 體細(xì)胞胚從外植體上直接發(fā)生：誘導(dǎo)階段;胚胎發(fā)育階段2. 間接發(fā)生：A.經(jīng)過(guò)愈傷組織的體細(xì)胞胚的形成：誘導(dǎo)愈傷組織的形成誘導(dǎo)愈傷組織胚性化體細(xì)胞胚的形成 B.經(jīng)過(guò)懸浮細(xì)胞的體細(xì)胞胚的形成：誘導(dǎo)愈傷組織的形成誘導(dǎo)愈傷組織胚性化懸浮

24、培養(yǎng)的胚性細(xì)胞團(tuán)體細(xì)胞胚的形成。l影響胚狀體發(fā)生和發(fā)育的因素l（1）供體植物的基因型（2）外植體的來(lái)源和培養(yǎng)物的生理狀況（3）與胚狀體發(fā)生相關(guān)的基因表達(dá)（4）培養(yǎng)基中外源激素（5）培養(yǎng)基的氮源（6）天然提取物和活性碳對(duì)胚狀體形成的作用胚狀體的發(fā)育大約要經(jīng)過(guò)哪幾個(gè)時(shí)期?體細(xì)胞胚的大多首先起源于一個(gè)胚性細(xì)胞，胚性細(xì)胞經(jīng)過(guò)一次分裂形成二細(xì)胞原胚，最后經(jīng)過(guò)球性胚、魚(yú)雷形胚、心形胚和子葉形胚形成胚狀體。14、離體培養(yǎng)條件下，胚狀體產(chǎn)生有幾種方式?（1）直接途徑：即不經(jīng)過(guò)愈傷組織階段，從外植體直接產(chǎn)生體細(xì)胞胚； （2）間接方式：外植體首先誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，再在愈傷組織上產(chǎn)生體細(xì)胞胚。第三節(jié) 幼胚培養(yǎng)1.

25、幼胚培養(yǎng)的意義離體胚胎培養(yǎng)可以克服種、屬間受精障礙，克服雜交后胚的衰亡，保證種內(nèi)或種間雜交的成功，或用于無(wú)性繁殖困難的植物的培養(yǎng)。胚培養(yǎng)還可以打破種子休眠，縮短育種周期，克服種子生活力低下和自然不育等，對(duì)于植物界物種進(jìn)化具有極其重要的意義。2. 幼胚培養(yǎng)時(shí)胚的發(fā)育方式有哪幾種？各有什么特點(diǎn)？答：幼胚培養(yǎng)常見(jiàn)的生長(zhǎng)方式有3種：胚性發(fā)育 特點(diǎn)：形成成熟胚。一般一個(gè)幼胚將來(lái)就是一個(gè)植株。早熟萌發(fā) 特點(diǎn)：可出現(xiàn)叢生胚現(xiàn)象。愈傷組織 特點(diǎn)：大多為胚性愈傷組織，易分化成植株。胚性愈傷組織是很好的遺傳受體和分離原生質(zhì)體的來(lái)源根據(jù)在培養(yǎng)中所取的外植體的部位不同，植物胚胎培養(yǎng)包括：胚培養(yǎng)，胚乳培養(yǎng)，胚珠培養(yǎng)，子

26、房培養(yǎng)。3. 幼胚培養(yǎng)方法l關(guān)鍵技術(shù)是幼胚剝離：需借助解剖鏡，且注意保濕，和操作迅速。幼胚培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)：取材時(shí)期：多為球形胚至魚(yú)雷形胚階段。體細(xì)胞胚與合子胚有何異同？界定：1）體細(xì)胞胚是離體培養(yǎng)的產(chǎn)物，只限于離體培養(yǎng)范圍使用，以區(qū)別于無(wú)融合生殖胚2）體細(xì)胞胚起源于非合子細(xì)胞，以區(qū)別于合子胚。3）體細(xì)胞經(jīng)過(guò)了胚胎發(fā)育過(guò)程，以區(qū)別于離體培養(yǎng)中器官發(fā)生形成個(gè)體的途徑。合子胚體細(xì)胞胚生殖類型有性無(wú)性細(xì)胞來(lái)源性細(xì)胞體細(xì)胞均經(jīng)過(guò)最初的胚性細(xì)胞不均等分裂以及以后的球形期、心形期、魚(yú)雷期等主要發(fā)育時(shí)期形態(tài)結(jié)構(gòu)胚柄有、明顯無(wú)真正胚柄子葉規(guī)范不規(guī)范胚體積大小生理生化特征貯藏物高低含水量低高休眠有無(wú)第四節(jié) 花藥、

27、花粉培養(yǎng)花藥培養(yǎng)（定義）：把發(fā)育到一定階段的花藥接種在人工培養(yǎng)基上，使其發(fā)育和分化成為植株的過(guò)程?；ǚ叟囵B(yǎng)（定義）：又叫小孢子培養(yǎng)，是從花藥中分離除花粉粒，使之成為分散的或游離的狀態(tài)，通過(guò)培養(yǎng)使花粉粒脫分化，進(jìn)而發(fā)育成完整植株的過(guò)程。花粉培養(yǎng)屬于細(xì)胞培養(yǎng)的范疇。花粉培養(yǎng)取材時(shí)期：四分體小孢子時(shí)期；花藥培養(yǎng)取材時(shí)期：?jiǎn)魏送砥?，雙核早期。六花藥培養(yǎng)的基本程序：外植體選擇外植體預(yù)處理外植體消毒剝?nèi)』ㄋ幗臃N誘導(dǎo)培養(yǎng)分化培養(yǎng)。1. 花藥、花粉培養(yǎng)的意義單倍體在植物遺傳育種中的應(yīng)用（1）控制雜種分離，縮短育種周期2）提高常規(guī)育種的選擇效率（3）單倍體是誘變育種的良好材料2. 花藥、花粉培養(yǎng)再生途徑誘導(dǎo)單倍

28、體的途徑（1）孤雌生殖（2）孤雄生殖（3）無(wú)融合生殖（4）體細(xì)胞減數(shù)分裂3. 影響花藥、花粉培養(yǎng)的因素4. 花藥培養(yǎng)方法花藥培養(yǎng)的程序大致如下：（1） 從植株上取花粉單核期的花蕾或幼穗；l（2） 在保濕條件下低溫預(yù)處理；（3） 對(duì)花藥進(jìn)行表面消毒；（4） 接種到培養(yǎng)基上，在適宜溫度下進(jìn)行培養(yǎng)；（5） 將花粉胚或花粉愈傷組織轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基中，進(jìn)行植株再生培養(yǎng)；（6） 花粉植株的染色體加倍（在試管苗階段或移栽成活后）；（7） 花粉植株移栽。5. 游離花粉粒培養(yǎng)方法七花粉分離方法：1）機(jī)械分離法：將花藥置于盛有少量液體培養(yǎng)基或與培養(yǎng)基等滲的蔗糖溶液的培養(yǎng)皿中，用平頭的玻璃棒或注射器內(nèi)管輕輕擠壓花藥，

29、使其散出花粉。（2）花藥漂浮培養(yǎng)自然釋放法：將經(jīng)過(guò)一定時(shí)間低溫處理的花藥，接種于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)數(shù)天后，花藥開(kāi)裂，釋放出花粉粒。（3）磁拌法:將花藥接種于含有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，然后放入一根磁棒，置于磁力攪拌器上，低速轉(zhuǎn)至花藥呈透明狀。通過(guò)離體培養(yǎng)獲得單倍體的途徑有哪些？助細(xì)胞或胚囊的無(wú)配子生殖產(chǎn)生單倍體；卵細(xì)胞、助細(xì)胞和反足細(xì)胞發(fā)育成單倍體；非正常發(fā)育的大孢子四分體產(chǎn)生單倍體；通過(guò)子房或花藥培養(yǎng)得到單倍體花藥培養(yǎng)中再生植株的形成途徑與再生植株倍性有何關(guān)系？答：花藥通過(guò)兩種途徑再生：一是由花藥誘導(dǎo)形成的胚狀體途徑；二是花藥愈傷組織途徑。通過(guò)胚狀體途徑產(chǎn)生的花粉植株幾乎全是單倍體，而經(jīng)愈傷組

30、織產(chǎn)生的花粉植株中有不少是二倍體，并且愈傷組織繼代培養(yǎng)時(shí)間愈長(zhǎng)，二倍體的比例愈高。第五節(jié) 人工種子1. 人工種子的定義2. 人工種子的優(yōu)越性與局限性3. 人工種子的制作人工種子具備以下幾個(gè)特點(diǎn)：（1） 具有發(fā)育良好的體細(xì)胞胚，并能發(fā)育成正常的完整植株。（2） 具有人工胚乳可提供種胚發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)。（3）具有能起到保護(hù)作用的人工種皮。用于制備人工種子的繁殖體主要有哪些？答：主要有體細(xì)胞胚、微型營(yíng)養(yǎng)變態(tài)器官和芽繁殖體一人工種子（artificial seeds）：將植物組織培養(yǎng)產(chǎn)生的胚狀體包裹上用有機(jī)化合物和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)制作的人工種皮，具有形成完整植株能力的繁殖體。根據(jù)包被的程度可將人工種子分為三大類：裸

31、露的或休眠的繁殖體、人工種皮包被的繁殖體、水凝膠包埋再包被的繁殖體。二繁殖體的種類及其培養(yǎng)技術(shù)：體細(xì)胞胚、微型變態(tài)器官、微芽。三人工種子由以下三部分組成：繁殖體，人工胚乳，人工種皮。四包埋介質(zhì)的要求：1、要能對(duì)繁殖體起保護(hù)作用，要對(duì)繁殖體沒(méi)有毒害。2、要求具有一定的緩沖強(qiáng)度，以保證繁殖體在生產(chǎn)、運(yùn)輸和種植操作中的安全。3、能夠提供類似于胚乳的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以供繁殖體發(fā)芽的需要。4、應(yīng)含有適當(dāng)?shù)臍⒕鷦?。五理想的人工種皮：1具有一定的封閉性以保證人工胚乳的各種成分不易流失；2具有良好的透氣性，以保證繁殖體維持生理活性的需要；3有一定的堅(jiān)硬度，以加強(qiáng)人工種子的耐儲(chǔ)運(yùn)性和適于機(jī)械化操作；4無(wú)毒無(wú)害，能保證繁

32、殖體順利穿透發(fā)芽。第四章 莖尖分生組織培養(yǎng)第一節(jié) 莖尖分生組織培養(yǎng)的目的和應(yīng)用1. 形態(tài)建成研究2. 無(wú)病株的生產(chǎn)3. 營(yíng)養(yǎng)繁殖4. 育種中的應(yīng)用第二節(jié) 脫毒苗的培育1. 病毒的危害及培育無(wú)毒苗的意義2. 病毒侵染的特點(diǎn)3. 熱處理脫毒4. 莖尖培養(yǎng)脫毒5. 熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒6. 脫毒苗在生產(chǎn)中的應(yīng)用7. 幾種主要植物的脫毒苗生產(chǎn)技術(shù)一植物脫毒：利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)脫出植物細(xì)胞中侵染的病毒，生產(chǎn)健康的繁殖材料。二脫毒 基本原理：病毒在植物體內(nèi)的分布具有不均勻性。三脫毒苗制備流程：索取材料的病毒檢測(cè) 外植體的選擇及預(yù)處理莖尖分生組織培養(yǎng)再生植株 脫毒效果檢測(cè) 脫毒苗的保存與繁殖四（填空、簡(jiǎn)

33、答）培養(yǎng)物的增殖方式：1.腋芽增殖2. 不定芽增殖3. 體細(xì)胞胚增殖4. 愈傷組織增殖19.為什么莖尖分生組織培養(yǎng)能夠除去植物病毒？答：因?yàn)椴《局饕ㄟ^(guò)維管束和胞間連絲傳播，在植物莖尖分生組織無(wú)維管束，且胞間連絲不發(fā)達(dá)，病毒運(yùn)轉(zhuǎn)速度慢；加之分生組織內(nèi)細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)速度快，病毒擴(kuò)散的速度趕不上細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)速度，所以莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)病毒數(shù)量極少，幾乎檢測(cè)不出。12、為什么莖尖分生組織培養(yǎng)能夠能夠除去植物病毒？答：原因：病毒在植物體內(nèi)的分布不均勻性，在分生組織中不帶或很少帶有病毒。其中證明病毒的分布不均勻性的假說(shuō)：能量競(jìng)爭(zhēng)、轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制、激素抑制、酶缺乏、抑制因子13、哪些因素影響莖尖培養(yǎng)的脫毒效果？答：影

34、響因素：1.母體材料病毒侵染的程度：?jiǎn)我徊《靖腥镜闹仓昝摱据^容易。2.起始培養(yǎng)的莖尖大小：一般不帶葉原基的生長(zhǎng)點(diǎn)培養(yǎng)脫毒效果最好3.外植體的生理狀態(tài)：頂芽的脫毒效果比側(cè)芽好，生長(zhǎng)旺盛季節(jié)的芽為外植體脫毒比休眠體芽或快進(jìn)入休眠的芽的脫毒效果好。32、如何檢測(cè)再生植株的脫毒效果？答：再生植株后，一般在18個(gè)月以內(nèi)進(jìn)行病毒鑒定，因?yàn)椴《镜臐摲谝话銥?12個(gè)月以上。通過(guò)指示植物鑒定和血清學(xué)鑒定及其他方法鑒定：1.指示植物鑒定法：常用指示植物有：千日紅、曼陀羅和心葉煙。將待測(cè)植物的汁液接種到指示植物上，如果被測(cè)植株帶毒，則指示植物會(huì)出現(xiàn)特定癥狀。2.血清法：可分為試管沉淀法（抗原-抗體沉淀反應(yīng)）、免疫

35、雙擴(kuò)散（同左）、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)驗(yàn)（抗原-抗體反應(yīng)及酶的催化反應(yīng)結(jié)合）電鏡檢測(cè)技術(shù)：分汁液提取染色、免疫吸附電鏡、病毒粒子修飾等；3.核酸雜交 e）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)3、指示植物：具有能夠辨別某種病毒?；誀畹募纳参锏谖逭?原生質(zhì)體培養(yǎng)與細(xì)胞融合第一節(jié) 原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)1. 原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義2. 原生質(zhì)體培養(yǎng)的發(fā)展歷史3. 原生質(zhì)體的分離4. 原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體（protoplast）是指除去細(xì)胞壁的裸細(xì)胞;是體細(xì)胞雜交育種的材料是轉(zhuǎn)基因的良好受體;是開(kāi)展基礎(chǔ)理論研究的良好材料;是分離細(xì)胞器的良好材料2簡(jiǎn)述酶法分離植物原生質(zhì)體的基本原理。植物細(xì)胞壁由纖維素，半纖維素，果膠質(zhì)等組成，通過(guò)用酶把

36、原生質(zhì)體外的細(xì)胞壁分解，便能得到完整的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體純化有哪些方法？（填空、簡(jiǎn)答）答：方法有：沉降法：在酶解處理中用相對(duì)分子質(zhì)量較小的甘露醇作為滲透壓調(diào)節(jié)劑時(shí)，將收集的濾液低速離心，使原生質(zhì)體沉降于管底。漂浮法：在酶解處理中用相對(duì)分子質(zhì)量較大的蔗糖作為滲透壓調(diào)節(jié)劑時(shí)，將收集的濾液于1000r/m的轉(zhuǎn)速下離心10min，原生質(zhì)體將漂浮于溶液表面，細(xì)胞碎片等雜質(zhì)將下沉到管底。界面法：利用比重不同的溶液，經(jīng)過(guò)離心后使完整無(wú)損的原生質(zhì)體處在兩液相的界面之間，而細(xì)胞碎片等雜質(zhì)則下沉到管底。原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法有哪些？各有何優(yōu)缺點(diǎn)？?jī)?yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)液體淺層培養(yǎng)法操作簡(jiǎn)便，對(duì)原生質(zhì)體的傷害較小，通氣性好，代謝物易

37、擴(kuò)散，易于補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，形成細(xì)胞團(tuán)或小愈傷組織后易于轉(zhuǎn)移。原生質(zhì)體在培養(yǎng)基中分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間的黏連現(xiàn)象，或造成局部原生質(zhì)體的密度過(guò)高，從而影響了原生質(zhì)體再生細(xì)胞的進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育，并且難以定點(diǎn)觀察和跟蹤單個(gè)原生質(zhì)體的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程懸滴培養(yǎng)法所需材料少，生長(zhǎng)快，容易添加新鮮培養(yǎng)基，不易污染，并且由于微滴的體積小，在一個(gè)培養(yǎng)基中可以做很多種培養(yǎng)基的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，有利于原生質(zhì)體的低密度培養(yǎng)原生質(zhì)體分布不均勻，容易集中在小微中央。另外由于微滴與空氣的接觸面積大，水分容易蒸發(fā)而造成培養(yǎng)基成分濃度變高。微滴培養(yǎng)法可用倒置顯微鏡觀察原生質(zhì)體的發(fā)育過(guò)程，易于添加新鮮培養(yǎng)基，可用于較多組合的實(shí)驗(yàn)或進(jìn)行

38、融合體及單個(gè)原生質(zhì)體的培養(yǎng)與懸浮培養(yǎng)法相似，原生質(zhì)體易于聚集在小滴的中央，微滴容易揮發(fā)。固體培養(yǎng)法原生質(zhì)體被彼此分開(kāi)并固定了位置，可以避免細(xì)胞間有害代謝產(chǎn)物的影響，并便于定點(diǎn)觀察，有利于跟蹤觀察單個(gè)原生質(zhì)體發(fā)育過(guò)程，易于統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體的分裂頻率和植板率對(duì)操作要求較嚴(yán)格，在原生質(zhì)體懸浮液與瓊脂或瓊脂糖培養(yǎng)基混合時(shí)溫度必須合適，太高會(huì)影響活力，太低培養(yǎng)基凝固太快使原生質(zhì)體分布不均勻，并且原生質(zhì)體的生長(zhǎng)發(fā)育比液體淺層法要慢。液體淺層-固體平板雙層培養(yǎng)法優(yōu)點(diǎn)：固體培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分可以緩慢地釋放到液體培養(yǎng)基中，以補(bǔ)充培養(yǎng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的消耗，產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)可被固體培養(yǎng)基吸收，有利于培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。在下層固體培

39、養(yǎng)基中如果添加一定量的活性碳，可有效地吸附培養(yǎng)物產(chǎn)生的有害物質(zhì)，促進(jìn)原生質(zhì)體的分裂及細(xì)胞團(tuán)的形成瓊脂糖珠培養(yǎng)法優(yōu)點(diǎn)：通氣性好飼養(yǎng)層培養(yǎng)法優(yōu)點(diǎn)：可提高原生質(zhì)體的植板率 第二節(jié) 細(xì)胞融合與培養(yǎng)1. 細(xì)胞融合的意義2. 細(xì)胞融合的方法3. 培養(yǎng)方法4. 雜種細(xì)胞的選擇5. 體細(xì)胞雜種鑒定四原生質(zhì)體活力測(cè)定方法：（P114）1.形態(tài)識(shí)別法 2.熒光素雙醋酸酯（FDA）染色法：有活力的原生質(zhì)體產(chǎn)生綠色熒光。3.酚藏花紅染色法：有活力的原生質(zhì)體不能被染色。4、熒光增白劑染色法：有活力的原生質(zhì)體隨著細(xì)胞壁的再生產(chǎn)生綠色熒光。5、伊凡藍(lán)染色法：有活力的原生質(zhì)體不能被染色。五植物體細(xì)胞雜交：又稱為原生質(zhì)體融合，

40、是指將植物不同種、屬、甚至科間的原生質(zhì)體通過(guò)人工方法誘導(dǎo)融合，然后進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其再生雜種植株的技術(shù)。植物細(xì)胞雜交的類型：1）體細(xì)胞雜交2）體細(xì)胞-配子雜交3）配子間細(xì)胞雜交4）微細(xì)胞雜交原生質(zhì)體融合的種類（完整程度）：1）對(duì)稱融合 2）非對(duì)稱融合六原生質(zhì)體的融合方法之一: PEG誘導(dǎo)融合法1）特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是成本低；融合子產(chǎn)生的異核率高；不受物種限制。缺點(diǎn)是融合過(guò)程繁瑣，PEG對(duì)細(xì)胞有毒害。2）作用機(jī)理：PEG分子具有輕微的負(fù)極性，可與帶正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，在原生質(zhì)體之間形成分子橋，使原生質(zhì)體發(fā)生粘連進(jìn)而促使原生質(zhì)體的融合；PEG還鞥增加類脂膜的流動(dòng)性，使原生質(zhì)體的核

41、、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。七原生質(zhì)體的融合方法之二：電融合的基本過(guò)程細(xì)胞膜的接觸：原生質(zhì)體在電場(chǎng)作用下極化而產(chǎn)生偶極子，使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串。膜的擊穿：給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個(gè)緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。優(yōu)點(diǎn)：1）不存在對(duì)細(xì)胞的毒害問(wèn)題2）融合效率高3）融合技術(shù)操作簡(jiǎn)便八（填空）原生質(zhì)體的融合產(chǎn)物：異核體（核未融合）、 同核體（同一親本融合 AA）、 未發(fā)生融合的雙親原生質(zhì)體。30、體細(xì)胞雜交和原生質(zhì)體融合有哪些類型？其產(chǎn)物和再生個(gè)體有何特點(diǎn)？答：細(xì)胞雜交類型有：體細(xì)胞-體細(xì)胞雜交、配子-體細(xì)胞雜交、配子間雜交、微細(xì)胞雜交原生質(zhì)體融合有：對(duì)稱融合、非對(duì)稱融合（A細(xì)

42、胞核+B細(xì)胞質(zhì)、A完整細(xì)胞+B細(xì)胞質(zhì)、A完整細(xì)胞+B細(xì)胞質(zhì)和部分核物質(zhì)）其產(chǎn)物和再生個(gè)體特點(diǎn)：對(duì)種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義；克服了遠(yuǎn)緣雜交不親和；產(chǎn)生了新的核外遺傳系統(tǒng)33、使細(xì)胞核失活的途徑有哪些？答：使細(xì)胞核失活的方法有物理和化學(xué)方法：物理方法：常用射線處理，如X射線、射線等；化學(xué)方法：常用試劑有碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸5、試述PEG融合法和電融合法的基本原理。答：PEG融合法的基本原理：原生質(zhì)體融合首先必須使兩個(gè)原生質(zhì)體緊密接觸，質(zhì)膜之間的距離要小于10Å。由于PEG分子有帶負(fù)電荷的醚鍵，具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成氫鍵，在原

43、生質(zhì)體之間形成分子橋，其結(jié)果是使原生質(zhì)體發(fā)生黏連。當(dāng)用高Ca2+和高PH溶液清洗后，Ca2+和PEG被清洗掉，打破了電荷平衡，使原生質(zhì)體某些正電荷與另一些原生質(zhì)體和負(fù)電荷連接起來(lái)，進(jìn)而促使原生質(zhì)體的融合。另外，PEG能增加類似脂膜的流動(dòng)性，這也是原生質(zhì)體的核和細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。電融合法的基本原理：根據(jù)原生質(zhì)體的融合過(guò)程設(shè)計(jì)的，實(shí)質(zhì)上它是借助于電場(chǎng)和電脈沖的作用來(lái)加速原生質(zhì)體的融合過(guò)程，即給予了原生質(zhì)體融合一個(gè)更有利的外部條件。融合程序包括細(xì)胞膜的接觸和膜的擊穿原生質(zhì)體是去掉細(xì)胞壁的單細(xì)胞，它是在離體培養(yǎng)條件下能夠再生完整植株的最小單位。每個(gè)原生質(zhì)體都含有該個(gè)體的全部遺傳信息，在適宜的培養(yǎng)

44、條件下，具有再生成與其親本相似的個(gè)體的全能性。原生質(zhì)培養(yǎng)（Protoplast culture）的主要目的是通過(guò)原生質(zhì)體的融合，克服遠(yuǎn)緣雜交障礙，實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞雜交（Somatic hybridization），從而產(chǎn)生雜交后代。原生質(zhì)體的分離（1）機(jī)械分離方法（2）酶解分離法影響原生質(zhì)體活力的因素滋養(yǎng)培養(yǎng)是利用能夠分泌生物活性物質(zhì)的細(xì)胞或組織培養(yǎng)物作為滋養(yǎng)者，來(lái)促進(jìn)原生質(zhì)體的分裂和生長(zhǎng)。影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素l（1）原生體的活力 （2）原生質(zhì)體密度 （3）細(xì)胞壁再生速度 （4）培養(yǎng)條件 原生質(zhì)體融合與體細(xì)胞雜交：兩種異源原生質(zhì)體在誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合，并形成雜種

45、細(xì)胞的過(guò)程稱為細(xì)胞融合，或細(xì)胞雜交。如果融合的細(xì)胞為體細(xì)胞則稱體細(xì)胞雜交。l細(xì)胞融合具有重要意義，它可克服種、屬以上植物有性雜交不親和性障礙，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交，為廣泛重組遺傳物質(zhì)開(kāi)辟新途徑。 l原生質(zhì)體融合：（1）自發(fā)融合（2）誘發(fā)融合1）NaNO3誘導(dǎo)融合3）高pH高鈣離子誘導(dǎo)融合3)聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)融合4）PEG與高pH、高鈣離子相結(jié)合的融合法5）電擊融合體細(xì)胞雜交技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用（1）體細(xì)胞雜交合成新物種（2）體細(xì)胞雜交可培育抗病新品種（3）胞質(zhì)雜種在育種上的應(yīng)用具有一個(gè)親本細(xì)胞核和兩個(gè)親本細(xì)胞質(zhì)的體細(xì)胞雜種稱為胞質(zhì)雜種。不對(duì)稱融合的供體受體系統(tǒng)，使得一個(gè)親本的原生質(zhì)體的細(xì)胞核失

46、活（細(xì)胞質(zhì)供體），另一個(gè)親本的原生質(zhì)體細(xì)胞質(zhì)的線粒體失活（細(xì)胞質(zhì)受體）。、哪些因素會(huì)影響原生質(zhì)體培養(yǎng)？答：影響因素有：濃度：激素的濃度、無(wú)機(jī)鹽的濃度、有機(jī)成分的濃度；滲透壓；營(yíng)養(yǎng)成分完全性；培養(yǎng)基的條件： PH、激素等；培養(yǎng)條件：光照、溫度6、非對(duì)稱融合：利用物理或化學(xué)的方法使親本的核或細(xì)胞質(zhì)失活后再進(jìn)行融合第六章 體細(xì)胞無(wú)性系變異1. 培養(yǎng)細(xì)胞變異的類型2. 影響體細(xì)胞無(wú)性系變異的因素3. 植株再生的調(diào)控4. 優(yōu)良變異系的篩選方法5. 體細(xì)胞無(wú)性系變異的應(yīng)用6、體細(xì)胞無(wú)性系變異：植物的組織、細(xì)胞、原生質(zhì)體在離體培養(yǎng)的條件下所得的培養(yǎng)物及再生植株的變異叫體細(xì)胞8、離體培養(yǎng)物的遺傳與變異有何特點(diǎn)

47、？答：特點(diǎn)：遺傳穩(wěn)定性：一般有較高的遺傳穩(wěn)定性；變異的普遍性：各種植物離體培養(yǎng)中變異普遍發(fā)生變異局限性變異的嵌合性：同一個(gè)有機(jī)體重同時(shí)存在有遺傳組成不同的細(xì)胞。一體細(xì)胞無(wú)性系：由任何形式的細(xì)胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的植株統(tǒng)稱為體細(xì)胞無(wú)性系。體細(xì)胞無(wú)性系變異：由體細(xì)胞無(wú)性系表現(xiàn)出來(lái)的變異。從對(duì)生物遺傳的影響而言，細(xì)胞工程技術(shù)本身即包含了雙重性：遺傳穩(wěn)定性和變異性。二離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點(diǎn)：遺傳穩(wěn)定性；變異的普遍性；變異的局限性；嵌合性8，細(xì)胞無(wú)性突變篩選育種有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？?jī)?yōu)點(diǎn)有：1）變異廣泛 各種性狀都可能發(fā)生變異，但變異并不完全隨機(jī)：有些性狀的變異頻率比較高，有些變異導(dǎo)致個(gè)體死亡而無(wú)法表達(dá)，多數(shù)變異（

48、DNA分子的變異）并不表達(dá)或表達(dá)方式和水平難以察覺(jué)。2）后代穩(wěn)定快 多數(shù)變異是單基因變異：顯性變異可以直接選擇利用；隱性變異可以通過(guò)1次自交純合，得到表現(xiàn)。3）可與輻射和其他化學(xué)誘變相結(jié)合 通過(guò)多種方法的結(jié)合可能顯著提高離體細(xì)胞的變異頻率。離體培養(yǎng)細(xì)胞的輻射誘變效果比個(gè)體水平的輻射的效果要好，其中最主要的是嵌合現(xiàn)象比較少，特別是通過(guò)胚胎再生途徑的情況更是如此。4）特別適合進(jìn)行抗性突變體的篩選 可以通過(guò)在培養(yǎng)基中添加篩選劑而簡(jiǎn)單地對(duì)上百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞進(jìn)行有效的篩選。缺點(diǎn)有：1），自發(fā)突變和誘發(fā)突變的隨機(jī)性，即難以進(jìn)行定向誘變；2），某些基因高度穩(wěn)定，即某些性狀不會(huì)發(fā)生突變；3），多數(shù)變異性狀難以在細(xì)胞

49、水平進(jìn)行選擇，例如株高，穗長(zhǎng)，果皮顏色等等；4），細(xì)胞水平和個(gè)體水平表現(xiàn)的不一致性，細(xì)胞水平比較單純，而有相當(dāng)多的功能需要多細(xì)胞或多種器官組織共同參與完成。5），細(xì)胞的生理適應(yīng)性和突變的混淆，這是造成選擇無(wú)效的原因。第八章 細(xì)胞培養(yǎng)及生產(chǎn)有用物質(zhì)第一節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)方法1. 細(xì)胞的分離2. 單細(xì)胞培養(yǎng)3. 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)1、薄層細(xì)胞培養(yǎng)：從外植體的表皮撕下數(shù)層細(xì)胞于合適的培養(yǎng)基上進(jìn)行的離體培養(yǎng)；現(xiàn)也將外植體橫切成1mm厚的薄片2、單細(xì)胞培養(yǎng):指從植物器官，愈傷組織或細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液中游離出單個(gè)細(xì)胞，于無(wú)菌條件下，進(jìn)行體外培養(yǎng)，使其繁殖，生長(zhǎng)，發(fā)育的一門(mén)技術(shù)。3、平板培養(yǎng)法 ：將懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞接種到一薄

50、層固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。 4、最低有效密度：在植物懸浮培養(yǎng)液中，使懸浮培養(yǎng)細(xì)胞能夠增殖的最少接種量。5、看護(hù)培養(yǎng)法：指用一塊愈傷組織或植物離體組織看護(hù)單細(xì)胞使其生長(zhǎng)并增殖的一種單細(xì)胞培養(yǎng)方法。 6、植板率：長(zhǎng)出的細(xì)胞團(tuán)的單細(xì)胞在接種細(xì)胞中所占的百分比數(shù)。17、用于建立懸浮細(xì)胞系的愈傷組織有何要求？ 答：必須有較好的松散性，使之在懸浮培養(yǎng)的起始階段細(xì)胞容易打散；具備較強(qiáng)的增殖和再生能力18、一個(gè)好的懸浮細(xì)胞系有哪些特征？答：其特征如下：懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細(xì)胞團(tuán)小，一般在3050個(gè)細(xì)胞以下。；均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同，懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細(xì)胞色澤呈

51、鮮艷的乳白或淡黃色。；細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)量一般23d甚至更短時(shí)間便可增加1倍。19、細(xì)胞懸浮系培養(yǎng)基群體生長(zhǎng)有何規(guī)律？答：其規(guī)律是： 在一個(gè)周期不添加培養(yǎng)基的懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中，細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始隨著時(shí)間的變化，其擴(kuò)增生長(zhǎng)呈S形曲線。在細(xì)胞接種最初的時(shí)間內(nèi)細(xì)胞很少分裂，經(jīng)過(guò)一個(gè)延遲期，然后進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期和細(xì)胞迅速增值的直線生長(zhǎng)期，接著是細(xì)胞增值減慢的減緩期和停止生長(zhǎng)的靜止期。靜止期的細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量均會(huì)下降，如果繼代不及時(shí)，長(zhǎng)期處于停止期的細(xì)胞往往會(huì)出現(xiàn)死亡和下降，從而影響整個(gè)懸浮細(xì)胞系的狀態(tài)。通常狀態(tài)下，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入減緩期時(shí)就要及時(shí)繼代。26、建立懸浮細(xì)胞系的關(guān)鍵技術(shù)有哪些？答：關(guān)鍵技術(shù)有：愈傷組織的誘導(dǎo)、懸浮系的建立與繼代培養(yǎng)及細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)調(diào)控第二節(jié) 培養(yǎng)物的次級(jí)代謝28、細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)有哪些培養(yǎng)系統(tǒng)？答：主要包括：成批培養(yǎng)：指在一個(gè)培養(yǎng)體積中接種細(xì)胞和添加培養(yǎng)基后，中途不再添加培養(yǎng)基也不更換培養(yǎng)基的方法；連續(xù)培養(yǎng)：在培養(yǎng)過(guò)程中，不斷向反應(yīng)器中以一定的流量添加新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)以相同的流量從系統(tǒng)中取出培養(yǎng)基，從而維持培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)在細(xì)胞密度、產(chǎn)物濃度以及物理狀態(tài)上的相對(duì)平衡。；半連續(xù)培養(yǎng)：在完成上訴成批培養(yǎng)的一個(gè)周期后，只從反應(yīng)器