體內(nèi)構(gòu)建骨軟骨復(fù)合體修復(fù)骨軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

1、體內(nèi)構(gòu)建骨軟骨復(fù)合體修復(fù)骨軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究         【摘要】  探討軟骨組織工程方法修復(fù)骨軟骨缺損理想的種子細(xì)胞和支架材料。方法體外誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞定向分化，分別與PLGA支架復(fù)合培養(yǎng)，并模仿馬賽克骨軟骨移植術(shù)在犬關(guān)節(jié)骨軟骨缺損深層置入MSC支架復(fù)合體，淺層置入誘導(dǎo)培養(yǎng)后的MSC支架復(fù)合體，緊密壓配，體內(nèi)構(gòu)建骨軟骨復(fù)合體，觀察其修復(fù)的情況。結(jié)果16周實(shí)驗(yàn)組缺損區(qū)完全由透明軟骨修復(fù)，與周圍正常軟骨完全融合，組織觀察顯示以軟骨細(xì)胞修復(fù)為主，軟骨下骨形成，潮線基本恢復(fù)；陰性對(duì)照組缺損區(qū)主要

2、由纖維組織修復(fù)，部分由透明軟骨修復(fù)，組織觀察顯示以纖維細(xì)胞修復(fù)為主，混有部分軟骨細(xì)胞；空白對(duì)照組完全由纖維組織修復(fù)。結(jié)論MSCs經(jīng)向軟骨細(xì)胞定向分化后復(fù)合PLGA支架材料，通過緊密壓配方式與MSCsPLGA支架在體內(nèi)構(gòu)建骨軟骨復(fù)合體，可以有效修復(fù)骨軟骨缺損。 【關(guān)鍵詞】  骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 馬賽克移植術(shù) 骨軟骨復(fù)合體 骨軟骨缺損   Abstract：ObjectiveTo evaluate the effect of treating the osteochondral defects with implanted cellscaffold composites,

3、 cultured MSCs as seed cells and PLGA as scaffolds,and to acquire desirable seed cells and scaffold materials.MethodBMSCs were induced to differenciatiated into chondrocytes, cocultured with PLGA scaffold respectively in vitro, then implanted into osteochondral defects on canine models by using tech

4、niques of mosaicplasty, induced BMSCPLGA scaffold composites in the top of the defect and BMSCPLGA scaffold composites in the bottom of the defect, osteochondral composites were constructed in vivo, and repair was observed with naked eyes and histology.ResultAt 16 weeks after transplantation the def

5、ects of expeirmental group were covered with semitransparent smooth white tissue and the margins between the repair tissue and the surrounding cartilage were not recognized. Histologically, most of the repair tissue was consisted with chondrocytes, maintained their thickness to the full depth of the

6、 original defects. The subchondral bone was well remodeled. The tidemark was observed.  The defects of positive control group were covered with repair tissues, and partial were conformed with original cartilage. The repair tissue was partly filled with chondrocytes. However, the defects of nega

7、tive control group were repaired with soft fibrous tissues without luster, and an obvious boundary between reparative and original cartilage was seen.ConclusionMSCsPLGA scaffold composites, constructed into osteochondral composites by suppressing closely in vivo,are the ideal materials for repairing

8、 cartilage defects.   Key words：bone mesenchymal stem cells(MSCs);   mosaicplasty;   osteochondral composites;   osteochondral  defect   關(guān)節(jié)軟骨損傷是骨科臨床的常見疾病，以往臨床使用的治療方法均難以達(dá)到理想的要求。組織工程技術(shù)的迅速發(fā)展，為這一難題的解決提供了前所未有的機(jī)遇。本實(shí)驗(yàn)研究的目的是采用軟骨組織工程技術(shù)，體外分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）

9、為種子細(xì)胞，經(jīng)軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)培養(yǎng)后，與聚羥基乙酸（poly glycolic acid， PLA）聚乳酸（poly lactic acid， PGA）共聚物(PLGA)支架材料復(fù)合培養(yǎng)，并模仿馬賽克骨軟骨移植術(shù)在犬膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損深層置入MSC支架復(fù)合體，淺層置入誘導(dǎo)培養(yǎng)后的軟骨細(xì)胞支架復(fù)合體，緊密壓配，體內(nèi)構(gòu)建骨軟骨復(fù)合體，觀察其修復(fù)的情況。期望能夠找到軟骨組織工程理想的種子細(xì)胞和支架材料。   1   材料和方法   1.  1   材料   1.  1.&#

10、160; 1   種子細(xì)胞   1012個(gè)月齡健康比格犬，無(wú)菌穿刺抽取髂骨骨髓78 ml，Percoll分離法分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行原代、傳代細(xì)胞培養(yǎng)。   1.  1.  2   支架材料   將PLGA支架(購(gòu)自山東醫(yī)療器械研究所)剪成1.  0 cm×1.  0 cm×0.  2 cm大小的方塊，放入12孔板內(nèi)，然后經(jīng)紫外線照射30 min消毒，備用。   1.  1.  3&

11、#160;  受體動(dòng)物及分組   1012個(gè)月齡健康比格犬10只（購(gòu)自山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），體重在810 kg。在每只犬的雙側(cè)膝關(guān)節(jié)分別制造3個(gè)骨軟骨缺損區(qū)，隨機(jī)分為3組。A組：實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)軟骨缺損內(nèi)深層植入MSCs復(fù)合PLGA支架材料，淺層植入經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞復(fù)合PLGA支架材料，緊密壓配；B組：陰性對(duì)照組，缺損內(nèi)僅植入MSCs復(fù)合PLGA支架材料；C組：陽(yáng)性對(duì)照組，缺損內(nèi)不植入任何材料。   1.  1.  4   主要試劑   一抗：兔抗人型膠原抗體，二抗:山羊抗兔IgG，

12、DAB顯色試劑盒，以上均購(gòu)自武漢博士德公司。   1.  2   方法   1.  2.  1   MSCs向軟骨細(xì)胞定向分化   P1傳代細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)，消化后調(diào)整細(xì)胞濃度，加入含TGF110 ng/ml、10胎牛血清的低糖DMEM溶液誘導(dǎo)培養(yǎng)。   1.  2.  2   誘導(dǎo)MSCs的鑒定   （1）糖胺聚糖（GAG）檢測(cè)（表1）。取傳代培養(yǎng)第二代MSCs（P2），實(shí)驗(yàn)組

13、加入TGF1誘導(dǎo)培養(yǎng)，對(duì)照組用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿全層時(shí)，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/ml，接種于96孔板每孔200 l，繼續(xù)加入含不同的培養(yǎng)液每孔200 l，每組5孔，培養(yǎng)第3 d換液1次，第7 d（誘導(dǎo)培養(yǎng)后第15 d）時(shí)，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，以硫酸軟骨素為標(biāo)準(zhǔn)品，紫外分光光度計(jì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，阿利新藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中GAG含量；（2）型膠原免疫組化  按試劑盒說明書進(jìn)行操作，型膠原陽(yáng)性的細(xì)胞，胞漿著色呈黃色或棕黃色（表2）。表1   細(xì)胞因子對(duì)MSCs分泌糖胺聚糖（GAG）的檢測(cè) 表2   型膠原免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞

14、數(shù)（個(gè)/視野）   1.  2.  3   細(xì)胞支架復(fù)合體的構(gòu)建及其體外培養(yǎng)  將上述2種細(xì)胞懸液調(diào)整濃度后，滴加到PLGA支架上，37、5CO2孵箱培養(yǎng)。繼續(xù)各用原培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)78 d，備掃描電鏡檢查和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。   1.  2.  4   復(fù)合體移植   1012個(gè)月齡健康比格犬10只，靜脈麻醉成功后，術(shù)區(qū)準(zhǔn)備完畢后，取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切口，顯露膝關(guān)節(jié)，在膝關(guān)節(jié)股骨滑車處，用手搖鉆制作一個(gè)直徑為5 mm的圓柱形軟骨缺損區(qū)，深達(dá)軟骨下骨，平均深為5

15、 mm。按照分組情況，A組：軟骨缺損處先在深層植入未誘導(dǎo)分化組的MSCs PLGA復(fù)合體，再在淺層植入誘導(dǎo)分化組的軟骨細(xì)胞PLGA復(fù)合體，緊密壓配；B組：缺損處全層植入未誘導(dǎo)分化組的MSCsPLGA復(fù)合體；C組：空白對(duì)照，只造成缺損不植入任何材料。嚴(yán)密縫合關(guān)節(jié)囊。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，自由活動(dòng)。   1.  2.  5   大體觀察   分別于術(shù)后12、16周取材，觀察缺損區(qū)軟骨生長(zhǎng)情況。   1.  2.  6   組織學(xué)觀察   2

16、0;  結(jié)   果   2.  1   細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變   倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，原代細(xì)胞接種后13 d可見少量細(xì)胞貼壁，呈短梭形。3 d后出現(xiàn)細(xì)胞集落，78d廣泛集落形成。1214 d細(xì)胞形成單層。傳代細(xì)胞貼壁快，78 d形成單層，細(xì)胞核大，胞漿內(nèi)顆粒多。加入細(xì)胞因子后，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯加快，體積增大，胞體變圓，呈漩渦狀生長(zhǎng)；   2.  2   實(shí)驗(yàn)組   MTT吸光度值、培養(yǎng)上清液中的糖胺聚糖（GAG）含量和型膠原分泌均明

17、顯高于對(duì)照組。型膠原免疫組化陽(yáng)性的MSCs胞漿染色為黃色或棕黃色(圖1、2)。   2.  3   電鏡觀察   掃描電鏡顯示PLGA支架呈不規(guī)則多孔狀，孔徑控制在200300 m，孔徑率85%，孔壁厚度較均勻,為2040 m。復(fù)合材料顯示MSCs細(xì)胞在PLGA支架上的黏附、伸展和增殖良好，可以見到細(xì)胞分泌的基質(zhì)和細(xì)胞偽足的鉚固作用(圖3)，表明支架材料具有良好的細(xì)胞親和性。            2.  4

18、0;  動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果   大體觀察。術(shù)后12周：A組新生組織表面平整、光滑，與周圍軟骨界線模糊，端面顯示軟骨厚度與正常軟骨相近；B組修復(fù)高度較周圍軟骨水平相近，但軟骨層厚度比A組明顯偏薄，無(wú)光澤，與周圍軟骨界線尚清楚；C組部分接近正常修復(fù)高度，修復(fù)組織呈黃色，局部凹陷。術(shù)后16周，A組缺損修復(fù)區(qū)組織與周圍關(guān)節(jié)軟骨相整合，軟骨缺損區(qū)被光滑白色半透明的組織覆蓋，與周圍軟骨組織外形無(wú)差異(圖4)；B組缺損區(qū)修復(fù)組織與周圍軟骨部分整合在一起，光澤較差(圖4)；C組缺損處修復(fù)組織低凹新生組織軟，無(wú)光澤，與周圍軟骨組織區(qū)別明顯。   組織學(xué)觀察。術(shù)后12周

19、：A組缺損區(qū)形成透明樣軟骨組織，比周圍正常軟骨偏厚，軟骨細(xì)胞數(shù)量多，出現(xiàn)明顯的規(guī)律，表面層的軟骨細(xì)胞平行關(guān)節(jié)面排列，深層縱向排列，軟骨基質(zhì)染色較四周時(shí)淡，軟骨下骨豐富。B組邊緣區(qū)厚度與周圍正常軟骨接近，軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則，與周圍軟骨結(jié)合可，無(wú)明顯裂隙存在。近中央?yún)^(qū)仍以纖維組織修復(fù)為主，細(xì)胞數(shù)很少，局部有裂隙。C組表面為纖維組織，細(xì)胞成分較少。術(shù)后16周，A組缺損區(qū)軟骨厚度與正常軟骨組織接近，細(xì)胞排列出現(xiàn)明顯規(guī)律，表面層的軟骨細(xì)胞平行關(guān)節(jié)面排列，深層縱向排列，與透明軟骨組織相似，軟骨下骨形成，潮線基本恢復(fù)，與周圍正常軟骨連接較好(圖5)。B組軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則，中央修復(fù)區(qū)大部分為纖維組織修復(fù)(圖

20、6)。C組缺損區(qū)內(nèi)主要為纖維組織(圖7)。   2.  5   統(tǒng)計(jì)學(xué)分析   采用SPSS10.  0統(tǒng)計(jì)軟件包分析，數(shù)值以±s表示，以P0.  05表示差異有顯著性意義。表3   關(guān)節(jié)軟骨缺損的組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表4   各組軟骨修復(fù)組織學(xué)評(píng)分結(jié)果 各時(shí)間段A組與B組、C組比較均有顯著性差異，*P0.05。   3   討   論   有研究認(rèn)為對(duì)于微環(huán)境尚未受到嚴(yán)重破壞的組織

21、修復(fù)或再生治療，不需要進(jìn)行體外誘導(dǎo)即可用干細(xì)胞直接移植修復(fù)，而對(duì)于缺損或微環(huán)境嚴(yán)重受損的組織修復(fù)或再生治療，則需要對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行定向誘導(dǎo)后移植1。作者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在體外對(duì)MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，(1)可以使細(xì)胞擴(kuò)增；(2)可以向軟骨細(xì)胞定向分化。在體外構(gòu)建成熟的組織工程化軟骨，是在模擬體內(nèi)微環(huán)境的條件，探索和研究軟骨種子細(xì)胞在支架內(nèi)黏附、增殖及種子細(xì)胞與支架材料的相容性即軟骨形成的條件、機(jī)制的問題。作者把細(xì)胞PLGA支架復(fù)合體在體外培養(yǎng)1周后，塑成圓柱狀，采用馬賽克移植方法植入缺損部位，底部為MSCsPLGA支架復(fù)合體，表層部分為誘導(dǎo)培養(yǎng)的MSCsPLGA支架復(fù)合體。在體內(nèi)微環(huán)境的作用下，迅速

22、生成軟骨組織。在12周時(shí)，軟骨組織已充滿了整個(gè)缺損區(qū)，隨后深層軟骨組織逐漸被軟骨下骨替代。16周時(shí)軟骨細(xì)胞出現(xiàn)分層排列，與周圍正常組織無(wú)明顯差別。在制造骨軟骨缺損模型的時(shí)候，損傷區(qū)會(huì)釋放生物活性因子，包括TGF、IGF1和BMP2。早期復(fù)合組織植入缺損部位后，在這些細(xì)胞因子的作用下，經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs細(xì)胞在PLGA支架材料中迅速增殖，表層的復(fù)合體在關(guān)節(jié)內(nèi)滑液細(xì)胞因子和周圍軟骨組織微環(huán)境的作用下形成早期軟骨組織。而深部的復(fù)合體被來自于損傷區(qū)的血管組織侵入，機(jī)體的MSCs細(xì)胞和誘導(dǎo)植入的MSCs細(xì)胞，在局部微環(huán)境的作用下，形成骨組織軟骨下骨，從而完成骨軟骨缺損組織的修復(fù)。這種修復(fù)的特點(diǎn)是軟骨與軟骨下

23、骨形成堅(jiān)固的自然連接，軟骨下骨與軟骨同時(shí)獲得修復(fù)。但是作者某些切片中觀察到2種復(fù)合體之間有裂隙、整合差，但深部復(fù)合體與軟骨下骨的結(jié)合均良好。   盡管很多專家學(xué)者在體內(nèi)、體外均成功構(gòu)建出骨軟骨復(fù)合組織37,但是存在以下問題:(1)無(wú)論在體外或體內(nèi),構(gòu)建組織的骨、軟骨界面結(jié)合欠佳；（）植入軟骨與周圍宿主軟骨組織整合欠佳；(3)形成的軟骨組織質(zhì)量缺陷:透明軟骨比例少,缺乏正常關(guān)節(jié)軟骨的分層結(jié)構(gòu),缺乏表淺的扁平細(xì)胞層和潮標(biāo)等；（）更為重要的是,以上構(gòu)建的骨軟骨復(fù)合組織只是短期觀察有證據(jù)初步表明在形態(tài)學(xué)、生化成分等方面具有骨軟骨組織結(jié)構(gòu),其生理功能、機(jī)械性能、能否長(zhǎng)期持續(xù)存在等尚待

24、進(jìn)一步研究證實(shí)。為了改善骨軟骨復(fù)合組織的結(jié)構(gòu)和界面形成情況,設(shè)計(jì)一體化、呈梯度變化的雙層支架材料將更為有利。She rwood等8應(yīng)用TheriForm三維打印方法研制出一種新型的骨軟骨三維支架,在骨、軟骨端配件交界區(qū)組成成分含量、氣孔率等方面形成梯度變化,這樣可以避免支架在體外培養(yǎng)和體內(nèi)植入時(shí)發(fā)生界面分層而有利于新生的骨與軟骨組織之間形成良好界面。   本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：MSCs適合成為軟骨組織工程的種子細(xì)胞。取材方便，體外培養(yǎng)性能穩(wěn)定，易于傳代擴(kuò)增，在一定誘導(dǎo)條件的培養(yǎng)下，可以分化為軟骨細(xì)胞。TGF1在促進(jìn)MSCs細(xì)胞增殖和向軟骨細(xì)胞定向分化方面有顯著的作用。PLGA支架

25、是理想的軟骨組織工程支架材料，具有良好的孔隙率和組織相容性，MSCs在其中可以很好地黏附、擴(kuò)展和增殖。MSCs經(jīng)向軟骨細(xì)胞定向分化后復(fù)合PLGA支架材料，通過緊密壓配方式與MSCsPLGA支架在體內(nèi)構(gòu)建骨軟骨復(fù)合體，可以有效修復(fù)骨軟骨缺損。   圖1   對(duì)照組 MSCs免疫組化結(jié)果陰性，胞漿內(nèi)未見到棕褐色顆粒   圖2   實(shí)驗(yàn)組MSCs免疫組化結(jié)果呈陽(yáng)性，胞漿內(nèi)見有棕黃色顆粒   圖3   細(xì)胞在支架材料上黏附、增殖，形成細(xì)胞團(tuán)，借偽足錨固于支架上  

26、 圖4   A組（黃箭頭）修復(fù)軟骨厚度較B組（綠箭頭）厚，與周圍組織邊界不清，需仔細(xì)辨認(rèn)（4個(gè)月后）   圖5   A組缺損區(qū)軟骨下骨結(jié)合緊密，潮線形成，與周圍軟骨組織融合好（4個(gè)月后×20）   圖6   B組缺損由纖維組織修復(fù)，細(xì)胞排列規(guī)律，與軟骨下骨結(jié)合尚可，局部有裂隙（4個(gè)月×10）   圖7   C組缺損部分纖維組織，排列雜亂，見分泌基質(zhì)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 潘興華，韓毅冰，郭坤元，等.成體干細(xì)胞的分化潛能及在修復(fù)重建中的應(yīng)用前景J.中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2002，16（5）：329332.2 Wakitani S, Goto T, Pineda SJ, et al. Mesenchymal cellbased repair of