蛋白質(zhì)工程重點

1、一、名詞解釋1、蛋白質(zhì)工程（Protein Engineering）以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過化學(xué)、物理和分子生物學(xué)的手段進行基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類對生產(chǎn)和生活的需求的工程技術(shù)。2、結(jié)構(gòu)模體（supersecondary structure，motif）介于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)之間的空間結(jié)構(gòu),指相鄰的二級結(jié)構(gòu)單元組合在一起，彼此相互作用，排列形成規(guī)則的、在空間結(jié)構(gòu)上能夠辨認的二級結(jié)構(gòu)組合體，并充當(dāng)三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)件（block building），其基本形式有、和等。3、結(jié)構(gòu)域（domain）是在二級結(jié)構(gòu)或超二級結(jié)

2、構(gòu)的基礎(chǔ)上形成三級結(jié)構(gòu)的局部折疊區(qū)，它是相對獨立的緊密球狀實體。 4、蛋白質(zhì)的折疊(protein folding)從體內(nèi)新生的多肽鏈或體外變性的多肽鏈的一維線性氨基酸序列轉(zhuǎn)化為具有特征三維結(jié)構(gòu)的活性蛋白質(zhì)的過程。5、分子伴侶 （molecular chaperone）一大類相互之間沒有關(guān)系的蛋白質(zhì)，它們具有的共同功能是幫助其他含蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)在體內(nèi)進行非共價的組裝和卸裝，但不是這些結(jié)構(gòu)在發(fā)揮其正常的生物學(xué)功能時的永久組成部分。6、晶胞(Unit cell)空間點陣的單位（大小和形狀完全相同的平行六面體），是晶體結(jié)構(gòu)的最小單位。7、核磁共振現(xiàn)象（nuclear magnetic resonanc

3、e ，NMR）指核磁矩不為零的核，在外磁場的作用下，核自旋能級發(fā)生塞曼分裂(Zeeman splitting)，共振吸收某一特定頻率的射頻輻射（radio frequency, RF）的物理過程。8、化學(xué)勢（位）移 （d）在有機化合物中，各種氫核周圍的電子云密度不同（結(jié)構(gòu)中不同位置）共振頻率有差異，即引起共振吸收峰的位移，這種現(xiàn)象稱為化學(xué)位移。9、耦合常數(shù) （J）由于自旋裂分形成的多重峰中相鄰2峰間的距離。用以表征2核之間耦合作用的大小，單位赫茲Hz。10、蛋白質(zhì)組（proteome）一個基因組、一種生物或一種細胞/ 組織所表達的全套蛋白質(zhì)。二、問答題1、蛋白質(zhì)修飾特異性與非特異性誘變方法：

4、隨機突變：UV、X射線、其他化學(xué)方法、轉(zhuǎn)座元件、簡并引物 定點突變：核式突變、限制性內(nèi)切酶位點、寡核苷酸介導(dǎo)突變、PCR依賴1）、Kunkel突變法UUUUUUTemplateUUUUUUTemplateUUMutant TemplateUU +UU dut-ung-雙突變菌株添加突變引物 在不含U堿基的噬菌體內(nèi)延伸引物 轉(zhuǎn)染于dut+ung+野生型受體菌 不含U堿基的保留，含U堿基的被切除原理：當(dāng)大腸桿菌dUTP酶缺失突變時（dut-），這些細菌就不能把dUTP轉(zhuǎn)化為dUMP,因而細菌體內(nèi)的dUTP濃度大為增加，并且一些dUTP會摻入到DNA合成中應(yīng)該由胸腺嘧啶占據(jù)的位置。而此時大腸桿菌體內(nèi)

5、還存在一種尿嘧啶-N-糖基化酶，它可以去除摻入到DNA中的尿嘧啶殘基。但在尿嘧啶-N-糖基化酶缺陷性菌株中（ung-），由于該酶的失活將不能把尿嘧啶從DNA鏈中剔除，使細菌DNA中一小部分胸腺嘧啶殘基被尿嘧啶所取代。在dut-ung-F菌株中，取代比例有所提高，由該菌株培養(yǎng)的M13噬菌體的DNA中會含有20-30個尿嘧啶殘基。用這些噬菌體轉(zhuǎn)染ung+菌株，尿嘧啶被除去，并因此產(chǎn)生一些可阻斷DNA合成且對特定核酸酶敏感的位點。病毒DNA被破壞，感染力下降約5個數(shù)量級。Kunkel 突變法正是利用上述機制，首先在dut-ung-的雙突變菌株中培養(yǎng)適當(dāng)?shù)闹亟MM13噬菌體，制備出帶U的單鏈DNA模板，

6、然后與突變引物退火、引物延伸，然后將延伸反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)染ung+受體菌，模板鏈因由U堿基位點的存在而被破壞，野生型噬菌體的產(chǎn)生受到抑制。大部分（80%）的后代噬菌體是由所轉(zhuǎn)染的不帶U的負鏈復(fù)制而來的。由于該鏈?zhǔn)怯赏蛔円镅由於鴣淼?，因此，后代噬菌體多帶有突變的目標(biāo)基因。所以，Kunkel 突變法所產(chǎn)生的突變體不需要利用標(biāo)記的寡核苷酸探針來篩選陽性噬菌斑，可直接通過序列分析來確定突變體。2）、DpnI法進行定點突變 常規(guī)大腸桿菌中質(zhì)粒含Dpn位點 添加一對正反向突變引物 體外退火延伸 模板質(zhì)粒對Dpn酶敏感，被切除 體外合成的突變序列質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化原理：一對包含突變位點的引物（正、反向），和模版質(zhì)粒

7、退火后用PfuTurbo聚合酶“循環(huán)延伸”，(所謂的循環(huán)延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5端終止，再經(jīng)過反復(fù)加熱褪火延伸的循環(huán)，這個反應(yīng)區(qū)別于滾環(huán)擴增，不會形成多個串聯(lián)拷貝。)正反向引物的延伸產(chǎn)物退火后配對成為帶缺刻的開環(huán)質(zhì)粒。DpnI酶切延伸產(chǎn)物，由于原來的模版質(zhì)粒來源于常規(guī)大腸桿菌，是經(jīng)dam甲基化修飾的，對DpnI敏感而被切碎（DpnI識別序列為甲基化的GATC，GATC在幾乎各種質(zhì)粒中都會出現(xiàn)，而且不止一次），而體外合成的帶突變序列的質(zhì)粒由于沒有甲基化而不被切開，因此在隨后的轉(zhuǎn)化中得以成功轉(zhuǎn)化，即可得到突變質(zhì)粒的克隆。2、重疊延伸PCR（4個引物）技術(shù)Forward mu

8、tagenic primerSP6 primer3Remove primersDenature and annealFirst PCRT7 primerReverse mutagenic primer DNA cloningT7 primerSP6 primerSecond PCRExtend to full length by DNA polymerase3（正向引物） （反向引物） （第一輪PCR，共有4種產(chǎn)物） （引物退火變性延伸） （只能5 3方向聚合） （用DNA聚合酶擴增至完整鏈） （第二輪PCR） （用兩端引物擴增目的基因）原理：由于采用具有互補末端的引物,使PCR產(chǎn)物形成了重疊

9、鏈,從而在隨后的擴增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸,將不同來源的擴增片段重疊拼接起來.此技術(shù)利用PCR技術(shù)能夠在體外進行有效的基因重組,而且不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理,可利用這一技術(shù)很快獲得其它依靠限制性內(nèi)切酶消化的方法難以得到的產(chǎn)物.3、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定方法的優(yōu)缺點 1）、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定方法：X射線晶體結(jié)構(gòu)測定、核磁共振波譜法（NMR）、三維電鏡重構(gòu)。 2）、X射線晶體結(jié)構(gòu)測定：優(yōu)點：分辨率高、不損傷樣品、無污染、相對快捷、能得到晶體完整性的大量信息；缺點：晶體構(gòu)象是靜態(tài)的，不能測定不穩(wěn)定的過渡態(tài)的構(gòu)象；很多蛋白質(zhì)很難結(jié)晶，或者很難得到用于結(jié)構(gòu)分析的足夠大的單晶；（瓶頸）X射線晶體衍射的工作流程較長

10、。 核磁共振波譜法（NMR）：優(yōu)點：同樣具有高分辨率可以在溶液中操作，接近生理狀態(tài) 分析并直接模擬出蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)與輔基和底物結(jié)合的情況以及酶催化的動態(tài)機理 缺點：樣品的分子量要比較?。?0KD以下）對不溶的蛋白比較困難（如膜蛋白） 實驗周期長（>1年） 三維電鏡重構(gòu)： 優(yōu)點：1.可以直接獲得分子的形貌信息；2.適于解析那些不適合應(yīng)用X射線晶體學(xué)和核磁共振技術(shù)進行分析的樣品（如難以結(jié)晶的膜蛋白，大分子復(fù)合體等）；3.適于捕捉動態(tài)結(jié)構(gòu)變化信息；4.易同其他技術(shù)相結(jié)合得到分子復(fù)合體的高分辨率的結(jié)構(gòu)信息；5.電鏡圖像中包含相位信息，所以在相位確定上要比X射線晶體學(xué)直接和方便。缺點：最

11、大的缺點是分辨率較低 對小分子蛋白效果不佳4、X射線晶體結(jié)構(gòu)測定原理、步驟及優(yōu)缺點1)、原理：1.光的衍射現(xiàn)象2.X射線的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用3.晶體學(xué)基礎(chǔ)知識4. X射線晶體衍射n 光的衍射現(xiàn)象衍射現(xiàn)象：光波偏離直線傳播而出現(xiàn)光強不均勻 分布的現(xiàn)象 n X射線的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用n 本質(zhì)的爭論（波動說 微粒說）n X射線衍射的發(fā)現(xiàn)n 晶體學(xué)基礎(chǔ)知識n X射線晶體衍射 2）、X射線晶體結(jié)構(gòu)測定基本過程：蛋白質(zhì)獲?。ㄌ峒儯┚w生長并經(jīng)冷凍技術(shù)處理重原子衍生物制備衍射數(shù)據(jù)收集衍生數(shù)據(jù)分析和改進結(jié)構(gòu)模型的獲?。òㄐ拚?3）、優(yōu)缺點：優(yōu)點：分辨率高、不損傷樣品、無污染、相對快捷、能得到晶體完整性的大量信息；缺點：晶

12、體構(gòu)象是靜態(tài)的，不能測定不穩(wěn)定的過渡態(tài)的構(gòu)象；很多蛋白質(zhì)很難結(jié)晶，或者很難得到用于結(jié)構(gòu)分析的足夠大的單晶；X射線晶體衍射的工作流程較長。 三、簡答題（有些沒聽到）1、空間結(jié)構(gòu)組件及其特點 螺旋（helix）、折疊（sheet）、環(huán)肽鏈（loop）、轉(zhuǎn)角（turn）1）.-螺旋 結(jié)構(gòu)： 多肽鏈中的各個肽平面圍繞同一軸旋轉(zhuǎn)，形成螺旋結(jié)構(gòu). 肽鏈內(nèi)形成氫鍵，氫鍵的取向幾乎與軸平行(同一方向），具有極性， N(+)、C(-) 。 中心無空腔，穩(wěn)定 蛋白質(zhì)分子為右手a-螺旋。（選） 螺旋一周，沿軸上升的距離即螺距為0.54nm,含3.6個氨基酸殘基；兩個氨基酸之間的距離為0.15nm; 沿主鏈計算，一個

13、氫鍵閉合的環(huán)包含13個原子，3.613 螺旋一側(cè)主要分布親水（荷電、極性）殘基，另一側(cè)主要集中疏水殘基 對生物活性具有重要作用 可用螺旋轉(zhuǎn)輪(helical wheel)的方式預(yù)測兩親性 2）、折疊： 伸展的構(gòu)象，每圈只有2個氨基酸殘基的特殊螺旋 a-碳原子處于折疊的角上，R基團處于棱角上與棱角垂直，兩個氨基酸之間的軸心距為0.35nm 折疊片也是一種重復(fù)性的結(jié)構(gòu)，可以把它想象為由折疊的條狀紙片側(cè)向并排而成。肽主鏈沿紙條形成鋸齒狀。 氫鍵是在片層間而不是片層內(nèi)形成。 折疊片上的側(cè)鏈都垂直于折疊片的平面，并交替地從平面上下二側(cè)伸出。3）、轉(zhuǎn)角（turn）回折(reverse turn) 轉(zhuǎn)折（轉(zhuǎn)

14、角）(b-turn) 轉(zhuǎn)折(-turn)發(fā)夾 發(fā)夾(hairpin) 無規(guī)則卷曲2、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)層次一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)模體、結(jié)構(gòu)域、三級結(jié)構(gòu)/亞基、四級結(jié)構(gòu)。3、第二遺傳密碼的定義及其特點定義：無結(jié)構(gòu)的多肽鏈到有完整結(jié)構(gòu)的功能蛋白質(zhì)信息傳遞部分遺傳密碼的第二部分，蛋白質(zhì)中氨基酸序列與其三維結(jié)構(gòu)的對應(yīng)關(guān)系，稱之為第二遺傳密碼或折疊密碼。特點：簡并性氨基酸序列不同的肽鏈可以有極為相似甚至相同的三維結(jié)構(gòu)。 多意性相同的氨基酸序列可以在不同的條件下決定不同的三維結(jié)構(gòu)。 全局性在肽鏈上相距很遠的殘基可以在空間上彼此靠近而相互作用，并對分子總體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要影響；后形成的肽段可以影響已經(jīng)形成的肽段

15、個構(gòu)象從而造成對分子整體的影響等。4、表達系統(tǒng)宿主的選擇： 體內(nèi)翻譯系統(tǒng) 體外翻譯系統(tǒng)：原核生物表達系統(tǒng)：大腸桿菌、枯草桿菌 真核生物表達系統(tǒng)：酵母表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)5、大腸桿菌表達載體的組件復(fù)制起始點、選擇性基因、多克隆位點（MCS）、啟動子(Promoter)、終止子(Terminator)、核糖體結(jié)合位點(SD序列)四、其他一）、蛋白質(zhì)工程緒論1、蛋白質(zhì)工程化的順序：工程化：理念設(shè)計制造功能實現(xiàn)2、基因工程和蛋白質(zhì)工程（選） 基因工程蛋白質(zhì)工程相同點都要改造基因，都屬于分子水平產(chǎn)生的基因（型）無新基因（型） 有新基因（型）產(chǎn)生的蛋白質(zhì)原有的新的聯(lián)系

16、蛋白質(zhì)工程以基因工程為基礎(chǔ)，是基因工程的應(yīng)用和延伸3、酶工程與蛋白質(zhì)工程的區(qū)別 酶工程：酶工程的重點在于對已存酶的合理充分利用和大量制備。 蛋白質(zhì)工程：重點則在于對已存在的蛋白質(zhì)分子的改造。4、蛋白質(zhì)工程產(chǎn)生的標(biāo)志、研究內(nèi)容、支撐技術(shù)1)、1983年，美國的Ulmer在Science上首先提出了“Protein Engineering“蛋白質(zhì)工程誕生(Science, 219: 666-671. ) 2）、1. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析 基礎(chǔ)2. 結(jié)構(gòu)、功能的設(shè)計和預(yù)測 基礎(chǔ)的應(yīng)用與驗證3. 創(chuàng)造和/或改造蛋白質(zhì)新蛋白質(zhì) 終目標(biāo)3）、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)、生物信息學(xué)分析技術(shù)、定點突變等遺傳操作技術(shù)二）、蛋

17、白質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)5、氨基酸的構(gòu)型與構(gòu)象及多肽鏈構(gòu)象的表征參數(shù) 構(gòu)型configuration：一個分子中原子的特定空間排布（L-型的單一手性分子） 構(gòu)型轉(zhuǎn)化時必須有共價鍵的斷裂和重新形成 不同構(gòu)型分子除鏡面操作外不能以任何方式重合 化學(xué)上可以分離，不可由單鍵旋轉(zhuǎn)相互轉(zhuǎn)換 構(gòu)象conformation：組成分子的原子或基團繞單鍵旋轉(zhuǎn)而形成的不同空間排布 構(gòu)象轉(zhuǎn)化時不需要共價鍵的斷裂和重新形成 化學(xué)上難以區(qū)分和分離表征參數(shù)：（1）多肽鏈的構(gòu)象角 (f,y)（2）拉氏構(gòu)象圖（Ramachandra plot）及多肽鏈構(gòu)象的允許區(qū)6、可用螺旋轉(zhuǎn)輪(helical wheel)的方式預(yù)測兩親性7、折疊的幾種

18、形式：平行型/反平行型、混合型（選）8、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)：多肽鏈中氨基酸的排列順序，二硫鍵的數(shù)目和排列方式9、維系蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力：肽鍵、二硫鍵、氫鍵、離子鍵、疏水鍵 、范德華力維持蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的作用力是：肽 鍵、二硫鍵三）、蛋白質(zhì)折疊10、20世紀(jì)60年代，Anfinsen基于還原變性的牛胰RNase在不需其他任何物質(zhì)幫助下，僅通過去除變性劑和還原劑就使其恢復(fù)天然結(jié)構(gòu)的實驗結(jié)果，提出了“多肽鏈的氨基酸序列包含了形成其熱力學(xué)上穩(wěn)定的天然構(gòu)象所必需的全部信息”的“自組裝學(xué)說” 。證明了一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)。Anfinsen的貢獻：氨基酸序列決定空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué) 第一個發(fā)現(xiàn)了二硫鍵異

19、構(gòu)酶 親和層析純化蛋白 合成葡萄桿菌核酸酶固相合成11、體外蛋白質(zhì)折疊與細胞內(nèi)新生肽鏈折疊的區(qū)別 完整肽鏈在試管內(nèi)的重折疊相當(dāng)于翻譯完成后才折疊，與新生肽鏈的合成延伸與折疊同時進行的不同。 細胞內(nèi)新生肽鏈折疊是一個比蛋白質(zhì)體外重折疊快得多的過程。 溫度、濃度、pH值不同 細胞和試管另一個重要差別是“大分子擁擠”問題。12、幫助蛋白質(zhì)和新生肽鏈折疊的生物大分子 分子伴侶 （molecular chaperone） 折疊酶：催化與折疊直接有關(guān)的化學(xué)反應(yīng)的酶。 蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI) 肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPI)13、分子伴侶與酶的異同點及作用機制1）、分子伴侶與酶的異同點 相同點 參與促進

20、一個反應(yīng)而本身并不在最終產(chǎn)物中出現(xiàn) 不同點 分子伴侶對靶蛋白不具有高度專一性 分子伴侶的催化效率很低 分子伴侶有時只是阻止肽鏈的錯誤折疊而不是促進其正確折疊。2）、作用機制 識別折疊過程中形成的折疊中間物的非天然結(jié)構(gòu)。與這些中間物結(jié)合，生成復(fù)合物，防止過早的或者錯誤的相互作用而阻止不正確的無效的折疊途徑，抑制不可逆的聚合物的產(chǎn)生，促進折疊向正確的有效的途徑進行。 分子伴侶首先會識別折疊過程中形成的折疊中間物的非天然構(gòu)象，而不會去理會天然構(gòu)象。 分子伴侶與早期形成的中間物相互作用而防止它們之間的聚合；一旦聚合形成，分子伴侶就無能為力了。14、蛋白質(zhì)的質(zhì)量控制系統(tǒng)（選） 蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)一切功能的

21、執(zhí)行者。 蛋白質(zhì)的錯誤折疊可以導(dǎo)致一些疾病。 為保證細胞的正?；顒?，細胞通過各種層次的“質(zhì)量控制”來識別、糾正和防止錯誤的發(fā)生。 15、折疊病與構(gòu)象病的區(qū)別（選） “分子病”:由于基因突變造成蛋白質(zhì)分子中僅僅一個氨基酸殘基的變化就引起疾病的情況，如地中海鐮刀狀紅血球貧血癥。分子病不是構(gòu)象病。 “折疊病”:蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列沒有改變，只是其結(jié)構(gòu)或者說構(gòu)象有所改變引起的疾病。四）、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)16、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)：1）、蛋白質(zhì)折疊過程中會打破水的有序化,則S溶劑為較大的正值,因而有利于折疊態(tài)。2）、對于典型的蛋白質(zhì)來說,對折疊結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性做出單項最大貢獻的是疏水殘基引起的S溶劑。3）、蛋

22、白質(zhì)的穩(wěn)定性主要指蛋白質(zhì)的物理上（熱力學(xué)）的穩(wěn)定性，而不是化學(xué)穩(wěn)定性。4）、與蛋白質(zhì)折疊相關(guān)的焓有兩個： 通過平衡常數(shù)算得的Vant Hoff 焓， DHVH 通過量熱法獲得的量熱焓，DHcal如果DHVH DHcal ，表明在 Tm處沒有中間體的存在, 系統(tǒng)屬于兩態(tài)轉(zhuǎn)變 五）、蛋白質(zhì)分子模擬與設(shè)計17、設(shè)計層次、分類Ø “小改”：定位突變和化學(xué)修飾Ø “中改”：結(jié)構(gòu)域進行拼接組裝 全新蛋白質(zhì)設(shè)計（“大改”） 完全從頭設(shè)計全新的蛋白質(zhì) 基于某些理論和研究結(jié)果，設(shè)計出初始分子模型設(shè)計循環(huán)18、蛋白質(zhì)設(shè)計的目標(biāo)及解決辦法 設(shè)計目標(biāo) 解決辦法熱穩(wěn)定性對氧化的穩(wěn)定性引入二硫橋增加內(nèi)

23、氫鍵數(shù)目改善內(nèi)疏水堆積增加表面鹽橋把Cys轉(zhuǎn)換為Ala或Ser把Met轉(zhuǎn)換為Gln、Val、Ile或Leu把Trp轉(zhuǎn)換為Phe或Tyr19、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸的構(gòu)象特征 分子量都比較小 靈活性 Gly>Ala>Pro 甘氨酸具有高度柔韌性，可在螺旋、 折疊處出現(xiàn)，但更常見于鉸鏈區(qū)或 轉(zhuǎn)角。Gly在定點突變時，一般不宜隨意改變 Pro比較剛性，常出現(xiàn)在轉(zhuǎn)角 Ala處于二者之間，常用作取代別的氨基酸的首選。20、Janus-真正符合Paracelsus挑戰(zhàn)的蛋白 六）、蛋白質(zhì)修飾21、基因融合與基因連接的方法及用途 方法：通過限制性內(nèi)切酶、通過無義突變產(chǎn)生的限制性內(nèi)切酶、重疊延伸P

24、CR 用途：1）、單分子活性組合 2）、檢測和提純 3）、提高基因表達量和增溶作用 4）、細胞定位22、非天然氨基酸的引入方法（tRNA介導(dǎo)的蛋白質(zhì)工程）1）、在體內(nèi)引入氨基酸類似物2）、氨酰化tRNA半合成酶介導(dǎo)體內(nèi)外翻譯3）、非天然氨基酸t(yī)RNA合成酶/tRNA對介導(dǎo)的蛋白質(zhì)工程復(fù)制起始點、選擇性基因、多克隆位點、啟動子、終止子、核糖體結(jié)合位點七）、蛋白質(zhì)的分離純化與鑒定23、與蛋白質(zhì)分離純化相關(guān)的理化特性 蛋白質(zhì)的溶解特性：鹽析法、有機溶劑沉淀法、等電點沉淀法 蛋白質(zhì)的分子大小：透析、超濾、凝膠過濾、離心 蛋白質(zhì)的帶電特性：電泳、離子交換層析 蛋白質(zhì)的吸附性質(zhì) 蛋白質(zhì)與配體特異性結(jié)合不同

25、：免疫親和層析、生物親和層析、金屬螯合親和 層析、擬生物親和層析 蛋白質(zhì)的分子形狀 蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性24、蛋白質(zhì)純化的總原則和純化步驟 總原則 以合理的效率、速度、收率和純度，將目標(biāo)蛋白從細胞的全部其他成分特別是不想要的雜蛋白中分離出來，同時仍保留其生物學(xué)活性和化學(xué)完整性。 步驟 選擇實驗材料，實驗材料預(yù)處理 蛋白質(zhì)的提取 蛋白質(zhì)的粗分級 蛋白質(zhì)的細分級 蛋白質(zhì)的鑒定 25、蛋白質(zhì)的粗分級、細分級方法粗分級：1）、使用蛋白質(zhì)提取緩沖液提取實驗材料后，蛋白提取液中目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度往往較低，采取一些簡單的方法使目標(biāo)蛋白質(zhì)濃縮，同時去除大量的雜質(zhì)，這些純化方法就屬于蛋白質(zhì)的粗分級。2）、硫酸銨分級

26、沉淀、有機溶劑分級沉淀、超速離心、等電點沉淀、透析、超過濾、蛋白質(zhì)結(jié)晶等。細分級：1）、粗分級只是使蛋白質(zhì)得到濃縮和初步分離純化，多數(shù)情況下還要根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小、分子形狀、分子表面特征或分子帶電狀況進一步純化，這就是蛋白質(zhì)細分級。2）、常用技術(shù)：層析（分子篩層析、離子交換層析、疏水作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析）和電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、等電聚焦電泳（IEF）、雙向電泳）26、不連續(xù)PAGE分離蛋白質(zhì)的原理（選） 電荷效應(yīng) 濃縮效應(yīng) 快慢離子效應(yīng) 凝膠濃度差效應(yīng) 分子篩效應(yīng)27、鎳離子層析方法屬于親和層析八）、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定28

27、、Western Blot基本原理與步驟基本原理:在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。一般流程: 蛋白樣品的制備、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、抗原抗體顯色反應(yīng)。具體步驟：轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗雜交、二抗雜交、底物顯色29、晶體的初步鑒定（選） 小分子晶體蛋白質(zhì)晶體邊界完整，漂亮常不完整，易出現(xiàn)多晶硬度偏硬，易碎成2瓣或幾瓣偏軟，易碎成粉脫水不變化因脫水而變壞溶解性慢快偏光性強相對弱染色性弱強漂浮性下沉漂浮30、共振條件(1) 核有自旋(磁性核)(2)外磁場,能級裂分;(3)照射頻率與外磁場的比值n0 / H0 = g / (2p ) 外加

28、射場的頻率與原子核自旋進動的頻率相同31、電子顯微技術(shù)的最大缺點是分辨率較低譜圖中化合物的結(jié)構(gòu)信息（1）峰的位移(d )：每類質(zhì)子所處的化學(xué)環(huán)境，化合物中位置；（2）峰的裂分數(shù)：相鄰碳原子上質(zhì)子數(shù)；（3）偶合常數(shù)(J)：確定化合物構(gòu)型。（4）峰的數(shù)目：標(biāo)志分子中磁不等性質(zhì)子的種類，多少種；（5）峰的強度(面積)：每類質(zhì)子的數(shù)目(相對)，多少個；不足之處：僅能確定質(zhì)子（氫譜）。九）、蛋白質(zhì)組學(xué)32、HPP里程碑 兩譜：蛋白表達譜、修飾譜 兩圖：蛋白連鎖圖、亞細胞定位圖 三庫：樣本庫、抗體庫、數(shù)據(jù)庫33、 蛋白質(zhì)組研究整體技術(shù)的特點：規(guī)?；⑼炕?、自動化技術(shù)目標(biāo)（要求）：有效分離、準(zhǔn)確鑒定、合理分析34、蛋白質(zhì)組學(xué)研究的手段 蛋白質(zhì)組研究的核心用于分離的雙向電泳(2 -DE) 蛋白質(zhì)組技術(shù)的支柱鑒定技術(shù)(Identification) 蛋白質(zhì)組研究的百科全書數(shù)據(jù)庫(database)35、生物質(zhì)譜技術(shù)p 原理:將樣品離子化,根據(jù)不同的質(zhì)量和電荷差 異確定分子量的技術(shù)p 應(yīng)用:蛋白質(zhì)序列分析 蛋白質(zhì)修飾分析p 最重要的鑒定技術(shù)（支柱）36、 質(zhì)譜儀組成：進樣器、離子化源、質(zhì)量分析器、離子檢測器、控制電腦、數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)離子源 電子碰撞 快原子轟擊 電