翻譯好的羅氏公司Tunel試劑盒操作說明書

1、羅氏（Roche）公司Tunel試劑盒操作說明書（Insitucelldeathdetectionkit-POD 法 ）一、原理：TUNEL （TdT-mediateddUTPnickendlabeling）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒是用來(lái)檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡早期過程中細(xì)胞核DNA 的斷裂情況。其原理是熒光素（fluorescein）標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核甘酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdTEnzyme）的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂 DNA的3'-OH 末端，并與連接辣根過氧化酶（HRP， horse-radishperoxidase）的熒光素抗體特異性結(jié)合，后者又與HRP底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）

2、 反應(yīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)（呈深棕色），特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞， 因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞；由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA 斷裂，因而沒有3 -OH 形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片）在單細(xì)胞水平上的凋亡原位檢測(cè)。還可應(yīng)用于抗腫瘤藥的藥效評(píng)價(jià)，以及通過雙色法確定細(xì)胞死亡類型和分化階段。二、器材與試劑器材：光學(xué)顯微鏡及其成像系統(tǒng)、小型染色缸、濕盒（塑料飯盒與紗布）、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規(guī)格的加樣器及槍頭等；試劑：試劑盒含：1 號(hào)（藍(lán)蓋）EnzymeSolution 酶溶液：TdT10x、2號(hào)（紫蓋）La

3、belSolution標(biāo)記液：熒光素標(biāo)記的 dUTP1x、3號(hào)（棕瓶）Converter-POD標(biāo)記熒光素抗體的HRP;自備試劑：PBS、雙蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（臨用前配制，5 "20X DAB+1"L30%H2O2+94" lPBS）、ProteinaseK工作液（10-20 區(qū) g/mlin10mMTris/HCl , pH7.4-8）或細(xì)胞通透液（ 0.1%TritonX-100 溶于0.1%檸檬酸鈉，臨用前配制）、蘇木素或甲基綠、DNase1（3000U/ml - 3U/mlin50mMTris-HCl

4、,pH7.5, 10mMMgCl2, 1mg/mlBSA）等。三、實(shí)驗(yàn)步驟操作流程圖：制作石蠟切片一脫蠟、水合一細(xì)胞通透一加TUNEL反應(yīng)液一加converter-POk與底物DAB反應(yīng)顯色一光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)并 拍照。具體操作步驟（石蠟包埋切片的檢測(cè)）：1 .用二甲苯浸洗2 次，每次5min；2 .用梯度乙醇（100、 95、 90、 80、 70%）各浸洗1 次，每次3min；注：上面兩步是針對(duì)石蠟切片樣本的處理4 .用ProteinaseK工作液處理組織15-30min在21 - 37 C （溫度、時(shí)間、濃度均需摸索）如果凋亡細(xì)胞染色較弱時(shí)，可用高濃度的ProteinaseK （400g/m

5、L）處理5分鐘。其它替代方法：石蠟切片的預(yù)處理也可根椐實(shí)際情況可采用下述三種替代方法之一，即蛋白酶 K 處理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同：替代方法1:將脫蠟及水合好的切片浸入通透液中8-10min （通透液:0.1%TritonX-100 溶于0.1%檸檬酸鈉，需新鮮配制）替代方法2：將脫蠟及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10min （胃蛋白酶：0.25%-0.5%溶于 HC1PH2,胰蛋白酶 0.25%-0.5%溶于0.01NHCl）替代方法3:將脫蠟及水合好的切片浸入含200ml0.1M 的檸檬酸緩沖液PH6的塑料盒中，置于微波爐中350W （低檔）處理5min。5 .PB

6、S漂洗2次；6 .制備TUNEL 反應(yīng)混合液：處理組用50區(qū)11號(hào)液+450區(qū)12號(hào)液混勻；而陰性對(duì)照組僅加50區(qū)12號(hào)液，陽(yáng)性對(duì)照組先加入100“DNase1,反應(yīng)在1525c x 10min,后面步驟同處理組。7 .玻片干后，加50 1TUNEL反應(yīng)混合液（陰性對(duì)照組僅加 50履2 號(hào)液）于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37c X1h。8 .PBS漂洗3次；9 .可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞（激發(fā)光波長(zhǎng)為450500nm,檢測(cè)波長(zhǎng)為 515565nm）;10 .玻片干后加50區(qū)13號(hào)液（converter-POD）于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng) 37c x

7、30min。11 .PBS 漂洗 3 次；12 .在組織處加50100區(qū)1DAB底物，反應(yīng)1525c xiOmin;13 .PBS漂洗3次；14 .拍照后再用蘇木素或甲基綠復(fù)染，幾秒后立即用自來(lái)水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。15 .加一滴PBS或甘油在視野下，用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞（共計(jì)200500個(gè)細(xì)胞）并拍照?？山Y(jié)合凋亡細(xì)胞形態(tài)特征來(lái)綜合判斷（未染色細(xì)胞變小，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期出現(xiàn)凋亡小體，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)鄒縮、變圓、脫落；而染色細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體）對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞的預(yù)處理：在載玻片上鋪一層薄薄的多聚賴氨酸，干燥后在去離子

8、水中漂洗，干燥后4保存；適當(dāng)方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)設(shè)未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照組，各組離心收集約1X106個(gè)細(xì)胞，PBS洗一次，重懸，加到鋪好的多聚賴氨酸載玻片上，自然干燥，使細(xì)胞很好的吸附到載玻片上；將吸附細(xì)胞的載玻片在4%多聚甲醛中固定25min；PBS浸洗二次，每次5min;將吸附細(xì)胞的載玻片在0.2%的 TritonX-100 中處理5min；PBS浸洗二次，每次5min;后續(xù)操作如同石蠟包埋切片的6-15四、注意事項(xiàng)1進(jìn)行PBS清洗時(shí)，每次清洗5min。2 .PBS清洗后，為了各種反應(yīng)的有效進(jìn)行，請(qǐng)盡量除去PBS溶液后再進(jìn)行下一步反應(yīng)。3 .在載玻片上的樣本上加上實(shí)驗(yàn)用反應(yīng)液后，請(qǐng)蓋上蓋玻片或保

9、鮮膜，或在濕盒中進(jìn)行，這樣可以使反應(yīng)液均勻分布于樣本整體，又可以防止反應(yīng)液干燥造成實(shí)驗(yàn)失敗。4 .TUNEL 反應(yīng)液臨用前配制，短時(shí)間在冰上保存。不宜長(zhǎng)期保存，長(zhǎng)期保存會(huì)導(dǎo)酶活性的失活。5 .如果20X DAB溶液顏色變深成為紫色，則不可使用，需重新配制。6 .用甲基綠（MethylGreen）染液（3-5%甲基綠溶于0.1M醋酸巴比妥PH4.0）染色后，請(qǐng)用滅菌蒸儲(chǔ)水清洗多余的甲基綠。然后進(jìn)行洗凈（ 100%乙醇）、脫水（二甲苯）透明、封片后通過光學(xué)顯微鏡觀察操作。如果此時(shí)使用8090%的乙醇洗凈時(shí)，甲基綠比較容易脫色，注意快速進(jìn)行脫水操作。7 .2 號(hào)液 含甲次砷酸鹽和二氯鈷等致癌物，可通

10、過吸入、口服等途徑進(jìn)入機(jī)體，注意防護(hù)。8 .試劑保存；未打開的試劑盒貯存在-20（-1525）；3 號(hào)液（ converter-POD） 液一旦解凍，以后就保存在4（28）下，至少在 6m 內(nèi)穩(wěn)定，避免再次凍存；TUNEL 反應(yīng)液臨用前配好后，放至冰上直至使用。9 .結(jié)果分析時(shí)注意：在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細(xì)胞中可產(chǎn)生大量DNA 片斷，從而引起假陽(yáng)性結(jié)果；而有些類型的凋亡現(xiàn)象可能原因建議非特異性 染色TdT酶的濃度過高用 TdTdilutionbuffer* 作 1 ： 2 1 ： 10 稀釋TdT酶反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)或 TdT酶反應(yīng)過程中反應(yīng)液注意控制反應(yīng)時(shí)間，并確保 TdT酶反應(yīng)

11、液能性細(xì)胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不完全，以及細(xì)胞外的矩陣成分阻止TdT進(jìn)入胞內(nèi)反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。滲漏，細(xì)胞或組織表面不能保持濕潤(rùn)。很好地覆蓋樣品。光照紫外線導(dǎo)致包埋試劑的聚合（如：甲基丙烯酸 會(huì)導(dǎo)致樣本DNA的斷裂）嘗試改用其它包埋材料或其它聚合試劑在固定組織時(shí)樣本 DNA已斷裂（內(nèi)源核酸酶的作 用）確保樣品取樣后立即固定或通過肝靜脈灌注 固定使用了不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ?，例如一些酸性固定液采用推薦的固定液固定后某些核酸酶活性依然較高導(dǎo)致DNA斷裂用含有dUTP和dAPT的溶液封閉標(biāo)記率低如果以乙醇或甲醇固定的樣本則標(biāo)記效率較低 （因 為在固定時(shí)染色質(zhì)未能與蛋白質(zhì)交聯(lián)， 而在操作中 丟

12、失）用溶于PBSPH7.4中的4%多聚甲醛固定 或福爾馬林或戊二醛固定。固定時(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致交聯(lián)程度過高減少固定時(shí)間，或用溶于PBSPH7.4的2%多 聚甲醛固定熒光淬滅Fluorescence在普通光照 10分鐘就會(huì)嚴(yán)重淬 滅，需注意避光操作促滲條件不佳，以致于試劑不能到達(dá)靶分子或濃度 過低1、增加通透劑促滲時(shí)間2、增加通透劑的作用溫度（15-25 ）3、優(yōu)化蛋白酶K的作用濃度和作用時(shí)間（如： 以 400ug/ml 作用 5min）4、0.1M的檸檬酸鈉70 c作用30min。熒光背景很高支原體污染請(qǐng)使用支原體染色檢測(cè)試劑盒檢測(cè)是否為支 原體污染TdT酶的濃度過高或反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)用 TdTdilutionbuffer* 作 1 ： 2 1 ： 10 稀釋或注意控制反應(yīng)時(shí)間紅細(xì)胞中血紅蛋白導(dǎo)致的自發(fā)熒光產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。宜選擇其它細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒。高速分裂和增殖的細(xì)胞，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核中的 DN幽裂。陽(yáng)性對(duì)照 沒有信號(hào)DNasel的濃度過低1、