基因克隆和基因體外表達(dá)研究生

1、基因克隆和基因體外表達(dá)研究生2 基因克隆是指在體外對(duì)DNA分子按照既定的目的和方案，對(duì)DNA進(jìn)行剪切和重新連接，然后把它導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而能夠擴(kuò)增有關(guān)DNA片段，表達(dá)有關(guān)基因產(chǎn)物，進(jìn)行DNA序列分析，基因治療，研究基因表達(dá)的調(diào)節(jié)元件（如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等），以及研究基因的功能等。 3 第一節(jié) 基因克隆的工具酶一、限制性核酸內(nèi)切酶（restriction enzyme） 它是一種核酸內(nèi)切酶，能從雙鏈DNA內(nèi)部特異位點(diǎn)識(shí)別并且裂解磷酸二酯鍵。4 52限制性內(nèi)切酶的命名 EcoR E代表Escherichia屬 co代表coli 種 R代表RY13株63限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和切割位點(diǎn) 通常是46個(gè)堿基對(duì)

2、、具有回文序列（palindrom）的DNA片段，大多數(shù)酶是錯(cuò)位切割雙鏈DNA，產(chǎn)生5或3黏性末端（sticky end）。 如EcoR切割后產(chǎn)生5黏性末端7Pst切割后產(chǎn)生3黏性末端：有一些酶沿對(duì)稱軸切斷DNA，產(chǎn)生平端或鈍端（Blunt end）, 如Sma：8二、其他常用的工具酶1. DNA聚合酶 (DNA polymerase I) 有聚合酶活性 有35核酸外切酶活性 有53核酸外切酶活性 91011122. DNA聚合酶大片段 DNA聚合酶大片段(large fragment of DNA polymerase I)為DNA聚合酶I用枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)裂解后產(chǎn)生的

3、大片段，這個(gè)片段也稱為Klenow片段（Klenow fragment）。 有53聚合酶活性有35核酸外切酶活性 無53核酸外切酶活性13Klenow片段的主要用途有： (1) 補(bǔ)齊雙鏈DNA的3末端。14(2) 通過補(bǔ)齊3端，使3末端標(biāo)記。 5-G-OH Klenow 5-GTT*A*A-OH 3-CAATT-OH d*ATP,dTTP 3-CAA T T-OH(3) 在cDNA克隆中，第二股鏈的合成。(4) DNA序列分析。153. 逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase） 是一種RNA依賴的DNA聚合酶，即以RNA為模板合成DNA， 合成方向?yàn)?3延伸，無35外切酶活性。

4、用于以mRNA為模板合成cDNA，構(gòu)建cDNA文庫。 16174. T4 DNA連接酶（T4 DNA ligase） T4 DNA連接酶催化雙鏈DNA一端3-OH與另一雙鏈DNA的5端磷酸根形成35磷酸二酯鍵，使具有相同黏性末端或平端的DNA兩端連接起來。 18195. 堿性磷酸酶（alkaline phosphatase） 能去除DNA或RNA 5端的磷酸根。制備載體時(shí)，用堿性磷酸酶處理后，可防止載體自身連接，提高重組效率。2021 6. 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT），簡稱末端轉(zhuǎn)移酶。它的作

5、用是將脫氧核苷酸加到DNA的3-OH上，主要用于探針標(biāo)記；或者在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于進(jìn)行連接。 2223 第二節(jié) 基因克隆的載體 一、常用的克隆載體(一)質(zhì)粒（plasmid） 質(zhì)粒是存在于多數(shù)細(xì)菌和某些真核生物染色體外的雙鏈環(huán)狀的DNA分子。 24作為克隆載體的質(zhì)粒應(yīng)具備下列特點(diǎn)：（1）分子量相對(duì)較小，能在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定存在，有較高的拷貝數(shù)。（2）具有一個(gè)以上的遺傳標(biāo)志，便于對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇，如抗生素的抗性基因，-半乳糖苷酶基因（Lac Z）等。（3）具有多個(gè)限制性內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)，便于外源基因的插入。 25262728 質(zhì)粒一般只能容納小于10kb的外源DNA片段。29(

6、二)噬菌體 噬菌體(bacteriophage, phage)是感染細(xì)菌的病毒， 用作克隆載體的噬菌體有兩種：一種是噬菌體，另一種是M13噬菌體。 野生型噬菌體經(jīng)過改造，已衍生出100多種克隆載體。 噬菌體載體分為插入型和替換型(置換型)兩類。 目前應(yīng)用較廣的是EMBL系列、gt系列和Charon系列等。 30 31 gt10和gt11載體適用于建立cDNA文庫。這兩個(gè)載體都屬插入型載體，能克隆7kb以下的外源DNA。 gt11為表達(dá)型載體。32Ziplox載體33(三)黏性質(zhì)粒（cosmid） 黏性質(zhì)粒是由噬菌體的噬菌體的黏性末端（cos區(qū)）與質(zhì)粒重新構(gòu)建的載體，為雙鏈、環(huán)狀DNA。其克隆容

7、量可達(dá)4050kb。 34(四) M13噬菌體 M13噬菌體（M13 phage）是一種大腸桿菌雄性特異絲狀噬菌體，全長約6.5kb。M13感染細(xì)菌后，經(jīng)過復(fù)制轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈的復(fù)制型（RF）。復(fù)制型M13可用作克隆載體。35 當(dāng)每個(gè)細(xì)菌體內(nèi)的復(fù)制型M13拷貝數(shù)積累到100200后，M13的合成就變得不對(duì)稱，只有其中一條鏈進(jìn)行復(fù)制，產(chǎn)生大量的單鏈DNA，并被包裝到成熟的噬菌體顆粒中，然后從細(xì)菌中排出。M13噬菌體的最大優(yōu)點(diǎn)在于從細(xì)菌體內(nèi)釋放出的顆粒中所含的單鏈DNA。3637(五) 病毒載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、EB病毒等作為基因轉(zhuǎn)移的載體。多數(shù)病毒載體均已質(zhì)?；?，病毒載體質(zhì)粒主要由病毒

8、啟動(dòng)子、包裝元件、選擇性遺傳標(biāo)記，以及pBR322的復(fù)制子組成。38二、表達(dá)載體(一) 原核表達(dá)載體 表達(dá)載體中含有復(fù)制起始位點(diǎn)、抗性基因 、克隆位點(diǎn) 、啟動(dòng)子 、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào).3940(二) 真核表達(dá)載體 載體中含有原核復(fù)制起始位點(diǎn)、抗生素抗性基因. 還含有真核表達(dá)元件,包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、克隆位點(diǎn)、 轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和poly (A) 加尾信號(hào).41 第三節(jié) 基因克隆的基本過程 基因克隆主要分為以下幾個(gè)步驟：制備目的基因和相關(guān)載體；將目的基因和有關(guān)載體進(jìn)行連接；將重組的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞；DNA重組體的篩選和鑒定；DNA重組體的擴(kuò)增、表達(dá)和其他研究。 42一、 目的基因的獲得（

9、一）從基因組文庫中獲得 一個(gè)生物體的基因組用限制性內(nèi)切酶部分酶切后 ,將酶切片段克隆在載體分子中 ,所有這些插入了基因組片段的載體分子的集合體 ,將包含了這個(gè)生物體的整個(gè)基因組 ,也就是構(gòu)成了這個(gè)生物體的基因文庫。 43 （二）從cDNA文庫（cDNA library）中獲得 cDNA文庫是指某種特定細(xì)胞及特定狀態(tài)下的全部cDNA克隆.（三）用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)體外擴(kuò)增有關(guān)DNA片段（四）人工合成44二.載體的選擇45三、DNA分子的體外連接（一）黏性末端（二）人工接頭的使用（三）加入同聚體尾（四）平端連接46（一）黏性末端4748定向克隆49（二）人工接頭50（三）加入同聚體尾51（

10、四）平端連接52四、外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞 將重組DNA或其他外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞，常用的方法有以下幾種。 （一）轉(zhuǎn)化（transformation） （二）感染（infection） （三）轉(zhuǎn)染（transfection） 53（一）轉(zhuǎn)化（transformation） 轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)?；蚱渌庠碊NA導(dǎo)入處于感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并使其獲得新的表型的過程。轉(zhuǎn)化常用的宿主細(xì)胞是大腸桿菌，并處于感受態(tài)，稱為感受態(tài)細(xì)胞（competent cell）。 54（二）感染（infection） 噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細(xì)胞病毒為載體的重組DNA分子，在體外經(jīng)過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，才能感染

11、適當(dāng)?shù)募?xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)繁殖。由噬菌體和細(xì)胞病毒介導(dǎo) 的 遺 傳 信 息 轉(zhuǎn) 移 過 程 也 稱 為 轉(zhuǎn) 導(dǎo) （transduction）。55（三）轉(zhuǎn)染（transfection） 轉(zhuǎn)染是指真核細(xì)胞主動(dòng)攝取或被動(dòng)導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過程。 56五、目的基因的篩選和鑒定 將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞以后，首要任務(wù)是篩選含有目的基因的陽性克隆并加以擴(kuò)增。 所用的方法主要有遺傳學(xué)方法、免疫學(xué)方法、核酸雜交法、PCR等。57（一） 遺傳學(xué)方法 1. 抗生素篩選法(1) 單抗生素篩選 大多數(shù)克隆載體帶有抗生素抗性基因，如氨芐青霉素（ampicillin, Amp）、四環(huán)素(tetracyclin

12、e,Tet)、卡那霉素(kanamycin, Kan)抗性基因。帶有完整抗生素基因的載體轉(zhuǎn)化宿主菌后，其宿主菌能在含有相應(yīng)抗生素的瓊脂平板上生長。用該法可篩選出轉(zhuǎn)化子，但不能區(qū)分含目的基因的轉(zhuǎn)化子和不含目的基因的轉(zhuǎn)化子。58（2）雙抗生素篩選5960 含有兩個(gè)或兩個(gè)以上選擇標(biāo)志的載體,如pBR322帶有Amp和Tet抗性基因，將外源基因插入Tet基因內(nèi)，則Tet基因失活，所構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌落能在含Amp的培養(yǎng)板中生長，而不能在含Tet的培養(yǎng)板中生長。 612. 藍(lán)-白篩選（互補(bǔ)） 許多載體（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和氨基端145個(gè)

13、氨基酸的編碼序列。這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)。這種載體適用于可編碼-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主細(xì)胞。宿主和載體編碼的片段各自均無酶活性，但它們可以互補(bǔ)形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這種現(xiàn)象稱為互補(bǔ)。6263（二） 免疫學(xué)方法 如果克隆基因的產(chǎn)物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表達(dá)，因而可用相應(yīng)的抗血清或單克隆抗體，通過放射免疫、化學(xué)發(fā)光或顯色反應(yīng)進(jìn)行篩選。 64 65（三） 核酸雜交法 對(duì)菌斑或菌落進(jìn)行原位分子雜交是從基因組文庫、cDNA文庫或重組質(zhì)粒中篩選目的基因的最有效的方法之一，而且這種篩選不取決于目的基因是否表達(dá)。66菌落原位雜交的原理 67（四） PCR技術(shù) PCR技術(shù)具有高度的

14、靈敏度和特異性，能在極短的時(shí)間內(nèi)將目的基因擴(kuò)增至數(shù)百萬倍，通過瓊脂糖凝膠電泳，可直接觀察到產(chǎn)物的存在。 68(五) 酶切鑒定 用抗生素篩選、藍(lán)白篩選等方法篩選出的菌落需進(jìn)一步進(jìn)行酶切分析，鑒定插入片段的大小和插入方向。（1） 插入片段大小的鑒定（2） 插入片段方向性的鑒定69目的基因正向插入和反向插入的示意圖 7071 第四節(jié) 真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染一、真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法與基本原理（一）磷酸鈣沉淀法（calcium phosphate co-precipitation） 使外源DNA或重組質(zhì)粒DNA與磷酸鈣混合，形成微小顆粒，并加入到宿主細(xì)胞中，使這些顆粒沉積在細(xì)胞表面，以利于宿主細(xì)胞攝取這些顆粒。 7

15、2（二）電穿孔法（electroporation） 將外源DNA與宿主細(xì)胞混合于電穿孔杯中，在高頻電流的作用下，細(xì)胞膜出現(xiàn)許多小孔，使外源DNA能進(jìn)入宿主細(xì)胞。73（三）DEAE-葡聚糖（ DEAE-Dextran）法 外源DNA或重組質(zhì)粒DNA與DEAE葡聚糖混合，DEAE葡聚糖帶有大量正電荷的化學(xué)基團(tuán)，可與DNA中帶負(fù)電荷磷酸基團(tuán)結(jié)合，并粘附于細(xì)胞表面，借助細(xì)胞內(nèi)吞過程促進(jìn)外源DNA進(jìn)入細(xì)胞。74（四）脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因?qū)?DNA75（五）顯微注射法（microinjection）76二、 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選 ( 一) TK-細(xì)胞突變株篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)TTP的合成有兩條途徑 從頭合成 可被氨

16、基喋呤阻斷 補(bǔ)救合成 胸苷激酶(TK)是關(guān)鍵酶TK+: 細(xì)胞生長TK- 細(xì)胞導(dǎo)入含TK基因的載體: 細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基生長77（二）藥物篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞 新霉素抗性基因（neor）編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，使氨基糖苷抗生素G-418（新霉素衍生物）失活。G-418阻斷細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成，從而達(dá)到殺傷真核細(xì)胞的目的。 78 （一）寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變法 第五節(jié) 基因的改造 誘變引物通用引物Klenow片段，dNTPT4 DNA連接酶轉(zhuǎn)化大腸桿菌標(biāo)記誘變引物 原位分子雜交 放射自顯影79（二）含U模板法 80（三）PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變法81 第六節(jié) 克隆基因的表達(dá) 一、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) （一）基因表達(dá)

17、的基本要素 1目的基因 目的基因如果來自真核細(xì)胞必須是 cDNA 。 cDNA的始密碼子（ATG）上游 部分（5端非編碼區(qū)）必須除去。對(duì)于一些分泌性蛋白，還應(yīng)除去信號(hào)肽部分。82 2載體的選擇 所用表達(dá)載體必須是大腸桿菌表達(dá)載體，含有大腸桿菌RNA聚合酶所能識(shí)別的啟動(dòng)子（如PL、tac、T7等）和SD序列。 83 3目的基因與載體的連接 （1）起始密碼子 （2）融合蛋白 融合蛋白是指表達(dá)的蛋白質(zhì)由原核多肽和真核蛋白連接在一起。 8485864受體菌株和誘導(dǎo)條件 根據(jù)載體啟動(dòng)子選擇菌株 確定誘導(dǎo)表達(dá)條件 87（二）提高外源基因表達(dá)水平的措施 1提高翻譯水平 （1）調(diào)整SD序列與ATG之間的距離 （2）用點(diǎn)突變的方法改變某些堿基 （3）增加mRNA的穩(wěn)定性 882使細(xì)菌的生長與外源基因的表達(dá)分開 將宿主菌的生長和外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段，是減輕宿主細(xì)胞代謝負(fù)荷最為常用的一個(gè)方法。一般采用溫度誘導(dǎo)或藥物誘導(dǎo)。