高活性蛋白酶乳酸菌的篩選

1、深圳大學(xué)綜合性、設(shè)計(jì)性與探索研究性實(shí)驗(yàn)課程名稱： 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目名稱： 高活性蛋白酶乳酸菌的篩選 學(xué)院 ： 生命科學(xué)學(xué)院 專業(yè)： 生物科學(xué) 指導(dǎo)教師： 韓慶國(guó) 報(bào)告人： 魏高斌 學(xué)號(hào)： 班級(jí)： 5 實(shí)驗(yàn)時(shí)間： 2013-12-142013-12-31 實(shí)驗(yàn)報(bào)告提交時(shí)間： 2014-01-03 高活性蛋白酶乳酸菌的篩選摘要本實(shí)驗(yàn)利用添加了碳酸鈣的改良乳酸菌的固體培養(yǎng)基通過(guò)初篩、復(fù)篩，火腿腸中得到一種能分解碳酸鈣的菌種，對(duì)該菌種進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定，確定此菌株屬乳酸菌的乳酸球菌屬。通過(guò)單因變量的改變，不斷篩選分離得到高蛋白酶活性的乳酸菌種。關(guān)鍵詞乳酸菌、篩選、蛋白酶；乳酸菌具有多種生理功能，乳

2、酸菌具有提高食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改善食品風(fēng)味，延長(zhǎng)保存時(shí)間，對(duì)人體具有多方面的保健作用，如能調(diào)節(jié)腸道菌群，維持體內(nèi)微生態(tài)平衡，抑制腸道內(nèi)腐敗菌生長(zhǎng)繁殖，消除體內(nèi)有毒物質(zhì)的產(chǎn)生，改善便秘，降低膽固醇水平，改善肝功能，緩解乳糖不耐癥，改善維生素代謝，增強(qiáng)免疫，抗腫瘤，抗突變等，在畜牧業(yè)方面，乳酸菌還有增膘作用等，引起了人們廣泛的研究興趣，本文利用簡(jiǎn)單的培養(yǎng)分離純化方法，利用單因素變量，將高蛋白酶活性的乳酸菌從肉類制品中分離篩選出來(lái)，這類高蛋白酶菌種在食品工業(yè)或畜牧業(yè)上有一定的意義。1. 材料與方法1.1. 材料菌種來(lái)源：市售金鑼火腿腸；試劑：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、檸檬酸二銨、葡萄糖、乙酸鈉、磷酸氫二鉀

3、、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫-60、去離子水、瓊脂、碳酸鈣、結(jié)晶紫染液、碘液、番紅染液、干酪素；器材：錐形瓶、燒杯、試管、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)皿桶、移液管、洗耳球、接種環(huán)、移液器、移液器頭、超凈工作臺(tái)、顯微鏡、電爐、分析天平、高壓蒸汽鍋、恒溫培養(yǎng)箱等。1.2. 培養(yǎng)基配方1.2.1. 改良乳酸細(xì)菌固體培養(yǎng)基（MRS）蛋白胨10.0 g，牛肉膏8.0 g，酵母膏4.0 g，檸檬酸二銨2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫-60 1.0 ml，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g、瓊脂20.0 g，碳酸鈣3%，pH 6.06.8，加蒸餾水至1000 ml。1.2.2. 乳酸

4、菌蛋白酶活性檢測(cè)的固體培養(yǎng)基蛋白胨10.0 g，牛肉膏8.0 g，酵母膏4.0 g，檸檬酸二銨2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫-60 1.0 ml，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g、瓊脂20.0 g， 0.5%干酪素，pH 6.06.8，加蒸餾水至1000 ml。1.3. 方法1.3.1. 改良乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS）配置在室溫的條件下，按照配方用分析天平分別使用稱量紙稱量：蛋白胨10.0 g、牛肉膏8.0 g、酵母膏4.0 g、檸檬酸二銨2.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g

5、，使用量程為1 ml的移液管量取吐溫-60 1.0 ml到1000 ml燒杯中，與以上的全部試劑混勻，加去離子水至1000 ml，在電爐上稍微加熱攪拌，以助于吐溫-60的溶解，以制成pH 6.06.8的液體培養(yǎng)基。 分裝于500ml錐形瓶中，每瓶200ml。按配方稱取瓊脂4 g、碳酸鈣6 g于一個(gè)錐形瓶中制備成篩選乳酸細(xì)菌的固體培養(yǎng)基；按配方稱取瓊脂4 g、干酪素1 g制備成乳酸菌蛋白酶活性檢測(cè)的固體培養(yǎng)基；錐形瓶用干凈的膠塞和報(bào)紙封口。包扎若干潔凈試管，準(zhǔn)備移液器頭，培養(yǎng)皿，2瓶100ml去離子水，于高壓蒸汽鍋121滅菌15min后冷卻至50待用。1.3.2. 乳酸菌的分離和純化1.3.2.

6、1. 乳酸菌的分離在超市購(gòu)買(mǎi)金鑼火腿腸，用萬(wàn)分之一的天平稱取10 g，在超凈工作臺(tái)中減碎放入裝有90 ml 冷卻的無(wú)菌水的150ml錐形瓶中，并充分混合均勻，即為稀釋度為10-1的樣品液，另取3根無(wú)菌試管，用移液管和洗耳球各加入10ml無(wú)菌水，使用無(wú)菌的1ml移液器將樣品稀釋至10-2、10-3、10-4，分別吸取10-1、10-2、10-3、10-4 樣品稀釋液1 ml于培養(yǎng)皿中，然后倒入冷卻至50后碳酸鈣MRS固體培養(yǎng)基搖勻，待冷卻后取出倒置于恒溫培養(yǎng)箱中37 、無(wú)氧條件下培養(yǎng)1-2天，并將剩余培養(yǎng)基倒平板，待用。1.3.2.2. 乳酸菌的純化從培養(yǎng)了1-2天的碳酸鈣MRS培養(yǎng)基上挑取有透

7、明圈的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，取菌種培養(yǎng)物常規(guī)涂片、干燥、固定，滴加結(jié)晶紫初染1-2分鐘，水洗，再用碘液沖去殘余水漬，并用碘液覆蓋媒染約1分鐘后水洗，并用濾紙吸取載玻片上的殘水，將載玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇無(wú)紫色時(shí)，立即水洗，最后用番紅液復(fù)染約2分鐘，水洗，待干燥后，高倍鏡觀察。在超凈工作臺(tái)中選取革蘭氏陽(yáng)性菌的透明圈菌落，在倒好碳酸鈣MRS固體培養(yǎng)基平板上劃線分離，于溫培養(yǎng)箱中37 、無(wú)氧條件下培養(yǎng)1-2天。重復(fù)以上操作，直至得到純菌落。培養(yǎng)獲得的乳酸菌，通過(guò)形態(tài)分析對(duì)菌種進(jìn)行鑒定。1.3.3. 乳酸菌蛋白酶活性的測(cè)定在超凈工作臺(tái)下，取已純化的乳酸菌，蛋

8、白酶活性檢測(cè)的MRS固體培養(yǎng)基上點(diǎn)接種若干個(gè)點(diǎn)，在保溫箱里37攝氏度培養(yǎng)1-2天，當(dāng)平板中干酪素分解時(shí), 菌落周圍會(huì)出現(xiàn)透明圈。2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1. 乳酸菌的分離純化及革蘭氏鑒定如圖1所示，在火腿稀釋度10-1濃度的碳酸鈣MRS平板在37培養(yǎng)分離數(shù)日，其中有可以分解碳酸鈣的菌落生長(zhǎng)，分解碳酸鈣產(chǎn)生透明圈，透明圈內(nèi)有乳白色菌落，可初步認(rèn)為此菌就是乳酸菌。挑選透明圈中菌種進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果呈陽(yáng)性，如圖2所示，菌落被染成紫色，在10×40高倍鏡下觀察，可觀察到菌體形態(tài)呈球狀，單個(gè)或鏈狀排列，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜，邊緣光滑細(xì)膩，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為此乳酸菌是乳桿菌屬。 圖 1 乳酸菌的篩選 圖 2革蘭氏

9、染色鑒定乳酸菌2.2. 乳酸菌的純化挑選透明圈內(nèi)的乳酸菌落在新的碳酸鈣MRS平板上劃線分離，在37培養(yǎng)2day，可分離得到單個(gè)菌落的乳酸菌。圖 3 乳酸菌的純化2.3. 蛋白酶活的測(cè)定從分離純化出的菌落中選取單個(gè)菌落，接種到含干酪素的MRS培養(yǎng)在37培養(yǎng)2day，如圖4所示，乳酸菌將含干酪素的MRS培養(yǎng)基的干酪素分解，并在其周圍產(chǎn)生透明圈，說(shuō)明了分離出的乳酸菌有分解蛋白的能力。圖 4 乳酸菌蛋白酶活性檢測(cè)3. 實(shí)驗(yàn)分析及討論3.1. 乳酸菌產(chǎn)酸的能力與應(yīng)用通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究，驗(yàn)證了乳酸菌能夠分解碳酸鈣而出現(xiàn)透明圈，但產(chǎn)生的透明圈很小且需要培養(yǎng)數(shù)日才長(zhǎng)出來(lái)，說(shuō)明從火腿等肉類中提取出來(lái)的乳酸菌產(chǎn)酸的能力比較弱，可能是由于火腿腸在加工時(shí)經(jīng)過(guò)較嚴(yán)格的滅菌使得乳酸菌的活力下降，或者是火腿中加入防腐劑過(guò)多抑制乳酸菌的生長(zhǎng)，乳酸菌在分解碳酸鈣產(chǎn)生透明圈并使透明圈內(nèi)酸性增強(qiáng)，從另外一方面來(lái)說(shuō)明，乳酸菌種能夠耐酸，在酸性環(huán)境下生長(zhǎng)，