基因芯片技術(shù)基礎(chǔ)知識(shí)(概念、制備、雜交、應(yīng)用及發(fā)展方向)上課講義

1、HGP生物科學(xué)正迅速地演變?yōu)橐婚T信息科學(xué)。最明顯的一個(gè)例子就是目前正在進(jìn)行的 （human genome project ），最終要搞清人類全部基因組的 30 億左右堿基對(duì)的序列。除了 人的遺傳信息以外，還有其它生物尤其是模式生物（ model organism ）已經(jīng)或正在被大規(guī) 模測(cè)序， 如大腸桿菌、 啤酒酵母、 秀麗隱桿線蟲(chóng)以及中國(guó)和日本科學(xué)家攻關(guān)的水稻基因組計(jì) 劃。但單純知曉生物基因組序列一級(jí)結(jié)構(gòu)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠， 還必須了解其中基因是怎樣組織起來(lái) 的，每個(gè)基因的功能是什么， 又是怎樣隨發(fā)育調(diào)控和微環(huán)境因素的影響而在特定的時(shí)空域中 展開(kāi)其表達(dá)譜的， 即我們正由結(jié)構(gòu)基因組時(shí)代邁入功能基因組時(shí)代

2、。 隨著這個(gè)功能基因組學(xué) 問(wèn)題的提出（后基因組時(shí)代，蛋白組學(xué)） 1 ，涌現(xiàn)出許多功能強(qiáng)大的研究方法和研究工具， 最突出的就是細(xì)胞蛋白質(zhì)二維凝膠電泳（ 2-D-gel ）（及相應(yīng)的質(zhì)譜法測(cè)蛋白分子量）和生物 芯片（ Biochip ）技術(shù) 2 。一什么是基因芯片生物芯片，簡(jiǎn)單地說(shuō)就是在一塊指甲大?。?cm 3）的有 多聚賴氨酸 包被的硅片上或其它固相支持物（如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、 硝酸纖維素膜 、 尼龍膜 等，但需經(jīng)特殊處理。 作原位合成的支持物在聚合反應(yīng)前要先使其表面衍生出羥基或氨基 （視所要固定的分子為核 酸或寡肽而定） 并與保護(hù)基建立共價(jià)連接； 作點(diǎn)樣用的支持物為使其表面帶上正電荷以吸

3、附 帶負(fù)電荷的探針?lè)肿樱?通常需包被以氨基硅烷或 多聚賴氨酸 等）將生物分子探針 （寡 核苷酸 片段或基因片段）以大規(guī)模陣列的形式排布，形成可與目的分子（如基因）相互作用，交行 反應(yīng)的固相表面， 在激光的順序激發(fā)下標(biāo)記熒光根據(jù)實(shí)際反應(yīng)情況分別呈現(xiàn)不同的熒光發(fā)射 譜征， CCD 相機(jī)或 激光共聚焦顯微鏡 根據(jù)其波長(zhǎng)及波幅特征收集信號(hào)，作出比較和檢測(cè)， 從而迅速得出所要的信息。 生物芯片包括基因芯片、 蛋白質(zhì)芯片、 組織芯片。 而基因芯片中， 最成功的是 DNA 芯片，即將無(wú)數(shù)預(yù)先設(shè)計(jì)好的寡 核苷酸 或 cDNA 在芯片上做成點(diǎn)陣，與樣 品中同源核酸分子雜交 3 的芯片。基因芯片的基本原理同芯片技

4、術(shù)中雜交測(cè)序（ sequencing by hybridization, SBH ）。 即任何線狀的單鏈 DNA 或 RNA 序列均可被分解為一個(gè)序列固定、 錯(cuò)落而重疊的寡 核苷酸 ， 又稱亞序列( subsequence )。例如可把寡 核苷酸 序列 TTAGCTCATATG 分解成 5個(gè) 8 nt 亞 序列：(1) CTCATATG(2) GCTCATAT(3) AGCTCATA(4) TAGCTCAT(5) TTAGCTCA這5個(gè)亞序列依次錯(cuò)開(kāi)一個(gè)堿基而重疊 7個(gè)堿基。亞序列中 A、 T、C、G 4個(gè)堿基自由 組合而形成的所有可能的序列共有 65536 種。假如只考慮完全互補(bǔ)的雜交，那么

5、48個(gè) 8 nt亞序列探針中， 僅有上述 5個(gè)能同靶 DNA 雜交?？梢杂萌斯ず铣傻囊阎蛄械乃锌赡艿?n 體寡核苷酸探針與一個(gè)未知的熒光標(biāo)記 DNA/RNA 序列雜交， 通過(guò)對(duì)雜交熒光信號(hào)檢測(cè)， 檢 出所有能與靶 DNA 雜交的寡 核苷酸 ，從而推出靶 DNA 中的所有 8 nt 亞序列，最后由計(jì)算 機(jī)對(duì)大量熒光信號(hào)的譜型( pattern )數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，重構(gòu)靶 DNA 的互補(bǔ)寡 核苷酸 序列。二芯片類型一般基因芯片按其材質(zhì)和功能，基本可分為以下幾類 4(一)元件型微陣列芯片1. 生物電子芯片2. 凝膠元件微陣列芯片3. 藥物控釋芯片(二 ) 通道型微陣列芯片1. 毛細(xì)管電泳 芯片2 .

6、PCR 擴(kuò)增芯片3. 集成DNA分析芯片4. 毛細(xì)管電層析芯片（三）生物傳感芯片1光學(xué)纖維陣列芯片2白光干涉譜傳感芯片小鼠基因表達(dá)譜芯片（MGEC）附:目前國(guó)內(nèi)基因芯片常見(jiàn)品種.（上海博星公司）芯片品種芯片點(diǎn)數(shù)MGEC-20S2000MGEC-40S4000MGEC-80S8000癌癥相關(guān)基因表達(dá)譜芯片 （CRGEC）分類芯片型號(hào)芯片點(diǎn)數(shù)肝癌相關(guān)基因表達(dá)譜芯片LiverC-16S1626LiverC-16D3252LiverC-9.5NS954LiverC-9.5ND1908肺癌相關(guān)基因表達(dá)譜芯片Lun gC-7.3S737Lun gC-7.3D1474人類基因表達(dá)譜芯片（HGEC）芯片品種芯

7、片點(diǎn)數(shù)HGEC-10S1024HGEC-10D2048HGEC-20S2048HGEC-20D4096HGEC-40S4096HGEC-40D8192HGEC-80S8192HGEC-80D16184三基因芯片的制備芯片種類較多，制備方法也不盡相同，常見(jiàn)的芯片可分為兩大類：一類是原位合成；一種是直接點(diǎn)樣。原位合成適用于寡核苷酸；直接點(diǎn)樣多用于大片段DNA，有時(shí)也用于寡核苷酸，甚至mRNA。原位合成有兩種途徑。一是光蝕刻法；一是噴印法。光蝕刻法可以合 成30nt左右，噴印法可以合成 40-50nt，光蝕刻法每步縮合率較低，一般為95%左右，合成30nt產(chǎn)率僅20% ;噴印法可達(dá)99%以上，合成3

8、0nt產(chǎn)率可達(dá)74%，從這個(gè)意義上說(shuō)噴印法 特異性應(yīng)比光刻法高。此外，噴印法不需特殊的合成試劑。與原位合成法比較點(diǎn)樣法較簡(jiǎn)單，只需將預(yù)先制備好的寡 核苷酸或cDNA等樣品通過(guò)自動(dòng)點(diǎn)樣裝置點(diǎn)于經(jīng)特殊處理的玻璃片 或其它材料上即可。1原位光蝕刻合成5-7寡聚核苷酸原位光蝕刻合成技術(shù)是由 Asymetrix公司開(kāi)發(fā)的，采用 的技術(shù)原理是在合成堿基單體的5'羥基末端連上一個(gè)光敏保護(hù)基。合成的第一步是利用光照射使羥基端脫保護(hù)，然后一個(gè)5'端保護(hù)的核苷酸單體連接上去，這個(gè)過(guò)程反復(fù)進(jìn)行直至合成在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈完畢。使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣列， 指數(shù)增長(zhǎng)。某一含n

9、個(gè)核苷酸的寡聚核苷酸，通過(guò)4 xn個(gè)化學(xué)步驟能合成出4n個(gè)可能結(jié)構(gòu)。 例如：一個(gè)完整的十 核苷酸 通過(guò)32個(gè)化學(xué)步驟， 8個(gè)小時(shí)可能合成 65,536 個(gè)探針。目前美國(guó) Affymetrix 公司已有同時(shí)檢測(cè) 6,500 個(gè)已知人類基因的 DNA 芯片，并且正在制 備含 500,000-1,000,000 個(gè)寡 核苷酸 探針的人類基因檢測(cè)芯片。該公司每月投入基因芯片研 究的經(jīng)費(fèi)約 100 萬(wàn)美元，目前產(chǎn)品尚未公開(kāi)投放市場(chǎng)發(fā)揮經(jīng)濟(jì)效益，但已有許多公司及研究 機(jī)構(gòu)與其簽約購(gòu)買其產(chǎn)品。 該產(chǎn)品不僅可用于基因表達(dá)分析和基因診斷等， 而且在大規(guī)模藥 物開(kāi)發(fā)方面也具有誘人的前景。 Affymetrix 的

10、大部分產(chǎn)品將在 98 年底全面投放市場(chǎng)。屆時(shí)， 在其產(chǎn)品被廣泛采用的同時(shí)， 其所有的研究投入將變成巨大的利潤(rùn)。 其它公司產(chǎn)品也正在從 實(shí)驗(yàn)室技術(shù)研究走向開(kāi)發(fā)應(yīng)用。目前，用于分子診斷的 DNA 芯片不僅已可用于檢測(cè)愛(ài)滋病 病毒基因還可用于囊性纖維化（ CF ）、乳腺癌、卵巢癌等疾病相關(guān)基因的基因診斷。鑒于光 刻設(shè)備技術(shù)復(fù)雜， 只能有專業(yè)化公司生產(chǎn)， 加之成本高及合成效率不高的問(wèn)題， 因此有待進(jìn) 行以下研究：對(duì)光刻技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，提高合成效率；開(kāi)發(fā)新的原位合成技術(shù)，如噴印合成技術(shù)，該技術(shù)既能進(jìn)行原位合成又能進(jìn)行非原位合成。另一方法是光導(dǎo)原位合成法。 具體方法是在經(jīng)過(guò)處理的載玻片表面鋪上一層連接分子（

11、linker ），其羥基上加有光敏保護(hù)基團(tuán)，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（photolithographic mask ）保護(hù)不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羥基上的保護(hù)基團(tuán)， 游離羥基，利用化學(xué)反應(yīng)加上第一個(gè) 核苷酸 ，所加 核苷酸 種類及在芯片上的部位預(yù)先設(shè)定， 所引入的 核苷酸 帶有光敏保護(hù)基團(tuán)， 以便下一步合成。 然后按上述方法在其它位點(diǎn)加上另外 三種 核苷酸 完成第一位 核苷酸 的合成，因而 N 個(gè)核苷酸 長(zhǎng)的芯片需要 4N 個(gè)步驟。每一個(gè)獨(dú) 特序列的探針?lè)Q為一個(gè)feature，這樣的芯片便具有4N個(gè)feature，包含了全部長(zhǎng)度為 N的核苷酸 序列。這種原位直接合

12、成的方法無(wú)須制備處理克隆和 PCR 產(chǎn)物，但是每輪反應(yīng)所需 設(shè)計(jì)的 光柵則是主要的經(jīng)費(fèi)消耗。運(yùn)用這種方法制作的芯片密度可高達(dá)10 6探針/平方厘米，即探針間隔為 5 10 g，但只能制作II型DNA芯片。見(jiàn)圖一。ChiptliLtf"A- minkIJCi ivjI r/Jd >Ul I 曲 c：CtiupluiifRen|S?niACATC MTrAACGeCCG ATGCTAGCATTAGAGCT GCGAAATCTTTAGGGCT VTAAfreMOftAAAATTe CCCTTAGAGGAATCTCCyW/ing CiMjpliflC Rcrapmclighi ；k i

13、j vamlPb rl 皿I、13 in tikldsynl I心 i* ef6 )llUlKtClKllkN5RcpaGcdi Synthcik CyclesNuckoiide Key- AC r G T 72原位噴印合成芯片原位噴印合成原理與噴墨打印類似，不過(guò)芯片噴印頭和墨盒有多個(gè)，墨盒中裝的是四種堿基等液體而不是碳粉。噴印頭可在整個(gè)芯片上移動(dòng)并根據(jù)芯片上不同位點(diǎn)探針的序列需要將特定的堿基噴印在芯片上特定位置。該技術(shù)采用的化學(xué)原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成一致，因此不特殊制備的化學(xué)試劑。3點(diǎn)樣法 點(diǎn)樣法是將合成好的探針、cNDA或基因組DNA通過(guò)特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片上。點(diǎn)樣分子可以

14、是核酸也可以是寡核酸。一些研究者采用人工點(diǎn)樣的方法將寡 核苷酸 分子點(diǎn)樣于化學(xué)處理后的載玻片上， 經(jīng)一定的化學(xué)方法處理非干燥后， 寡 核苷酸 分子 即固定于載玻片上，制備好的 DNA 芯片可置于緩沖液中保存。由于方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適于 大規(guī)模 DNA 芯片制作，因而實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化點(diǎn)樣就顯得尤為重要。有的研究者用 多聚賴氨酸 包 被固相支待物玻片， 經(jīng)過(guò)分區(qū)后用計(jì)算機(jī)控制的微陣列點(diǎn)樣機(jī)按照預(yù)先設(shè)計(jì)順序點(diǎn)上核酸分 子，點(diǎn)樣量很小，約為5nl。大規(guī)模CDNA芯片多采用這種方法， 與其寡核苷酸微芯片相比。 DNA 芯片的潛在優(yōu)越性是具有更強(qiáng)的親和勢(shì)和特異性雜交，但是需要大量制備，純化，量 化，分類PCR產(chǎn)物

15、。有的研究者將玻片上覆蓋 20 pm厚薄層聚丙烯酰胺凝膠作為支持物， 采用機(jī)械刻寫或光刻的方法在其表面劃上網(wǎng)格，并用激光照射蒸發(fā)掉單元間隙的多余凝膠， 以實(shí)現(xiàn) DNA芯片分區(qū)，單元大小為 40 >40 pm或100 X100 pm間隔分別為50 pm和100 pm。 然后將化學(xué)方法合成的寡 核苷酸探針自動(dòng)化點(diǎn)樣于各個(gè)單元內(nèi)而制成 DNA 芯片，點(diǎn)樣速度 可達(dá) 2000 單元 /秒。其裝置采用的機(jī)器人有一套計(jì)算機(jī)控制三維移動(dòng)裝置、多個(gè)打印/噴印針的打印 /噴印頭；一個(gè)減震底座， 上面可放內(nèi)盛探針的多孔板和多個(gè)芯片。 根據(jù)需要還可以有溫度和濕度 控制裝置、針洗滌裝置。打印 /噴印針將探針從多

16、孔板取出直接打印或噴印于芯片上。直接 打印時(shí)針頭與芯片接觸， 而在噴印時(shí)針頭與芯片保持一定距離。 打印法的優(yōu)點(diǎn)是探針密度高， 通常1平方厘米可打印 2,500個(gè)探針。缺點(diǎn)是定量準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性不好，打印針易堵塞且使 用壽命有限。噴印法的優(yōu)點(diǎn)是定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，使用壽命長(zhǎng)。缺點(diǎn)是噴印的斑點(diǎn)大，因 此探針密度低，通常 1平方厘米只有 400點(diǎn)。國(guó)外有多家實(shí)驗(yàn)室和公司研究開(kāi)發(fā)打印/噴印設(shè)備，目前有一些已經(jīng)商品化。 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院和益生堂生物企業(yè)公司目前正在聯(lián)手利用打印 /噴印技術(shù)進(jìn)行生物芯片的研究和開(kāi)發(fā)，預(yù)計(jì) 2年內(nèi)將有用于實(shí)驗(yàn)室研究或臨床診斷的基因芯片產(chǎn)品問(wèn)世。見(jiàn)圖Robot pi petter4

17、電子芯片8-10電子芯片是由美國(guó)N anogen公司開(kāi)發(fā)的，目前國(guó)內(nèi)清華大學(xué)和復(fù)旦大學(xué) 也在開(kāi)發(fā)這一技術(shù)。這種芯片為帶有陽(yáng)電荷的硅芯片、芯片經(jīng)熱氧化，制成1mm ximm的陣列、每個(gè)陣列含多個(gè)微電極，在每個(gè)電極上通過(guò)氧化硅沉積和蝕刻制備出樣品池。將連接鏈親和素的瓊脂糖覆蓋在電極上，在電場(chǎng)作用下生物素標(biāo)記的探針即可結(jié)合在特定電極上。電子芯片最大特點(diǎn)是雜交速度快，可大大縮短分析時(shí)間。制備復(fù)雜、成本高是其不足。5三維芯片11-12三維芯片是由美國(guó)的 Packard、摩托羅拉、Argonne國(guó)家實(shí)驗(yàn)室三家機(jī) 構(gòu)與俄羅斯Engelhardt分子生物學(xué)研究所合作開(kāi)發(fā)的一種芯片技術(shù)。三維生物芯片實(shí)質(zhì)上 是一

18、塊顯微鏡載玻片，其上有10,000個(gè)微小聚乙烯酰胺凝膠條，每個(gè)凝膠條可用于靶 DNA ,RNA和蛋白質(zhì)的分析。先把乙知化合物加在凝膠條上，再用3cm長(zhǎng)的微型玻璃毛細(xì)管將待測(cè)樣品加到凝膠條上。每個(gè)毛細(xì)管能把小到0.2nl的體積打到凝膠上。以上幾家機(jī)構(gòu)合作研究的生物芯片系統(tǒng)具有其它生物芯片系統(tǒng)不具有的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。一是凝膠的三維化能加進(jìn)更多的已知物質(zhì)，增加了敏感性。二是可以在芯片上同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增與檢則。一般情況下，必須在微量多孔板上先進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，再把樣品加到芯片上，因此需要進(jìn)行許多額外操作。本芯 片所用凝膠體積很小。使PCR擴(kuò)增體系的體積減小1,000倍（總體積約納升級(jí)），從而節(jié)約了每個(gè)反應(yīng)所用的

19、 PCR酶（約減少100倍）。三是以三維構(gòu)象形式存在的蛋白和基因材料可 以其天然狀態(tài)在凝膠條上分析，可以進(jìn)行免疫測(cè)定，受體-配體研究和蛋白組分析。6流過(guò)式芯片（flow-thru chip ） 13 Cene Logic正在開(kāi)發(fā)一種在芯片片基上制成格柵狀微通道，Cene Logic設(shè)計(jì)及合成特定的寡核苷酸探針，結(jié)合于微通道內(nèi)芯片的特定區(qū)域。從待測(cè)樣品中分離 DNA或RNA并對(duì)其進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后，該樣品流過(guò)芯片，固定的寡核苷酸探針捕獲與之相互補(bǔ)的核酸，采用Cene Logic's信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)分析結(jié)果。 流通式芯片用于高通量分析已知基因的變化，其特定在于敏感性高：由于寡核苷酸吸附表面的增

20、大，流過(guò)式芯片可監(jiān)測(cè)稀有基因表達(dá)的變化；速度快：微通道加速了雜交反應(yīng)， 減少了每次檢測(cè)所需時(shí)間；價(jià)格降低：由于采用了特殊的共價(jià)化學(xué)技術(shù)將寡 核苷酸吸附于微通道內(nèi)， 使 每一種流過(guò)芯片可反復(fù)使用多次，從而使其成本降低。四基因芯片樣品制備一般說(shuō)來(lái)應(yīng)用 DNA芯片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)包括5個(gè)過(guò)程：生物學(xué)問(wèn)題的提出和芯片設(shè)計(jì)；樣品制備；生物雜交反應(yīng)；結(jié)果探測(cè)；數(shù)據(jù)處理和建模。1 樣品制備。一般所需 mRNA的量是以一張表達(dá)譜芯片需要 3用mRNA計(jì)算的不同組織抽提3 10mRNA所需組織量器官/組織*提取3用mRNA所需組織量（克）提取10 （jgmRNA 所需織量（克）總RNA得率單位:毫克RNA/克組織mRN

21、A所占百分比%成人正常組織肝0.20830.69441.80 - 1.80 mg/g0.80成人正常組織腦缺數(shù)據(jù)缺數(shù)據(jù)1.30 - 1.30 mg/g缺數(shù)據(jù)成人正常組織肺0.30001.00001.00 - 1.00 mg/g1.00成人正常組織心0.50001.66670.60 - 0.60 mg/g1.00成人正胃0.18520.61732.70 - 2.70 mg/g0.60常組織成人正常組織喉0.31251.04171.20 - 1.20 mg/g0.80病理組織結(jié)腸癌0.25210.84031.70 - 1.70 mg/g0.70病理組織1=1=1 J i=r'冃癌0.431

22、71.43880.50 - 0.50 mg/g1.39病理組織空腸腺癌0.35711.19051.40 - 1.40 mg/g0.60病理組織直腸癌0.16040.53481.70 - 1.70 mg/g1.10病理組織肝癌0.11160.37203.84 - 3.84 mg/g0.70病理組織肺癌0.12820.42742.00 - 2.00 mg/g1.17考慮到個(gè)體差異以及樣品在研磨、勻漿等過(guò)程中的損失，客戶提供的樣品量應(yīng)在上述基礎(chǔ)上增加1-2倍。2樣本采集過(guò)程關(guān)鍵點(diǎn).組織標(biāo)本采集操作建議規(guī)程，（取標(biāo)本所需關(guān)鍵器材和處理要求）鋁箔經(jīng)DEPC水浸泡過(guò)夜，78 °C烘干，高壓滅菌后

23、烘干1.5 ml微離心管15 ml聚丙烯離心管市場(chǎng)有售RNAase-Free 的相應(yīng)規(guī)格離心管標(biāo)簽紙記號(hào)筆樣品登記表由客戶指定專人填寫液氮罐應(yīng)常備液氮罐，并保證液氮的來(lái)源取材部位的病理切片由客戶提供1-2張注:以下步驟1 - 5應(yīng)在冰上進(jìn)行且不超過(guò)15分鐘，超過(guò)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致樣品的RNA降解。對(duì)腫瘤組織的取材，要求盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，例如對(duì)于手術(shù)切除的整個(gè)或部分前列腺，可能要根據(jù)冰凍切片報(bào)告的結(jié)果來(lái)判定要進(jìn)行研究的取材部位。1離體新鮮組織，切成多個(gè)1cm3小塊，易V除結(jié)締組織和脂肪組織。胃、腸組織應(yīng)剪除外膜；肝、腎、脾應(yīng)剪除門部血管神經(jīng)，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)

24、將 周圍的腫瘤組織切除干凈）。2在RNase-Free 0.9 %生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。3用鋁箔包裹組織，或用 5ml凍存管裝載組織（但最好統(tǒng)一采用鋁箔）。用記號(hào)筆在鋁箔或 凍 存管外表寫明樣品編號(hào)，并貼上標(biāo)簽，迅速投入液氮冷卻。4填寫樣品登記表，寫明樣品名稱、種類、編號(hào)、取樣日期、樣品處理情況等將液氮冷卻的組織放入樣品袋（每個(gè)樣品袋只保存同樣的組織），袋口留一根編號(hào)繩，繩上粘一張標(biāo)簽紙（標(biāo)簽上注明：樣品名稱、編號(hào)、日期），迅速轉(zhuǎn)入便攜式液氮罐5保留1-2張取材部位的病理切片。五生物芯片雜交待分析基因在與芯片結(jié)合探針雜交之前必需進(jìn)行分離、 擴(kuò)增及標(biāo)記。 根據(jù)樣品來(lái)源、 基 因含

25、量及檢測(cè)方法和分析目的不同， 采用的基因分離、擴(kuò)增及標(biāo)記方法各異。當(dāng)然，常規(guī)的 基因分離、 擴(kuò)增及標(biāo)記技術(shù)完全可以采用， 但操作繁瑣且費(fèi)時(shí)。 高度集成的微型樣品處理系 統(tǒng)如細(xì)胞分離芯片及基因擴(kuò)增芯片等是實(shí)現(xiàn)上述目的的有效手段和發(fā)展方向。 為了獲得基因 的雜交信號(hào)必須對(duì)目的基因進(jìn)行標(biāo)記， 目前采用的最普遍的熒光標(biāo)記方法與傳統(tǒng)方法如體外 轉(zhuǎn)錄、 PCR 、逆轉(zhuǎn)錄等原理上并無(wú)多大差異，只是采用的熒光素種類更多，這可以滿足不 同來(lái)源樣品的平行分析。 用計(jì)算機(jī)控制的高分辨熒光掃描儀可獲得結(jié)合于芯片上目的基因的 熒光信號(hào)，通過(guò)計(jì)算機(jī)處理即可給出目的基因的結(jié)構(gòu)或表達(dá)信息。雜交條件的選擇與研究目的有關(guān)， 多態(tài)

26、性分析或者基因測(cè)序時(shí)， 每個(gè) 核苷酸 或突變位點(diǎn) 都必須檢測(cè)出來(lái)。 通常設(shè)計(jì)出一套四種寡聚 核苷酸 ，在靶序列上跨越每個(gè)位點(diǎn)， 只在中央位 點(diǎn)堿基有所不同， 根據(jù)每套探針在某一特點(diǎn)位點(diǎn)的雜交嚴(yán)謹(jǐn)程度， 即可測(cè)定出該堿基的種類。這有利于增加檢測(cè)如果芯片僅用于檢測(cè)基因表達(dá)，只需設(shè)計(jì)出針對(duì)基因中的特定區(qū)域的幾套寡聚 核苷酸 即可。表達(dá)檢測(cè)需要長(zhǎng)的雜交時(shí)間， 更高的嚴(yán)謹(jǐn)性， 更高的樣品濃度和低溫度，的特異性和低拷貝基因檢測(cè)的靈敏度。突變檢測(cè)， 要鑒別出單堿基錯(cuò)配，需要更高的雜交嚴(yán)謹(jǐn)性和更短的時(shí)間。此外， 雜交反應(yīng)還必須考慮雜交反應(yīng)體系中鹽濃度、 探針 GC 含量和所帶電荷、 探針與 芯片之間連接臂的長(zhǎng)

27、度及種類、 檢測(cè)基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。 有資料顯示探針和芯片之間適 當(dāng)長(zhǎng)度的連接臂可使雜交效率提高 150倍 9。連接臂上任何正或負(fù)電荷都將減少雜交效率。 由于探針和檢測(cè)基因均帶負(fù)電荷， 因此影響他們之間的雜交結(jié)合， 為此有人提出用不帶電荷 的肽核酸（ PNA ）做探針 9。雖然 PNA 的制備比較復(fù)雜，但與 DNA 探針比較有許多特點(diǎn)， 如不需要鹽離子， 因此可防止檢測(cè)基因二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成及自身復(fù)性。 由于 PNA-DNA 結(jié)合更 加穩(wěn)定和特異，因此更有利于單堿基錯(cuò)配基因的檢測(cè)。六 基因芯片檢測(cè)原理雜交信號(hào)的檢測(cè)是 DNA 芯片技術(shù)中的重要組成部分。以往的研究中已形成許多種探測(cè)分子雜交的方法，

28、 如熒光顯微鏡 、隱逝波傳感器、 光散射表面共振、 電化傳感器、 化學(xué)發(fā)光、 熒光各向異性等等，但并非每種方法都適用于 DNA 芯片。由于 DNA 芯片本身的結(jié)構(gòu)及性 質(zhì)，需要確定雜交信號(hào)在芯片上的位置，尤其是大規(guī)模 DNA 芯片由于其面積小，密度大， 點(diǎn)樣量很少，所以雜交信號(hào)較弱，需要使用 光電倍增管 或冷卻的電荷偶連照相機(jī) (charged- coupled device camera ，CCD) 攝像機(jī)等弱光信號(hào)探測(cè)裝置。此外，大多數(shù)DNA 芯片雜交信號(hào)譜型除了分布位點(diǎn)以外還需要確定每一點(diǎn)上的信號(hào)強(qiáng)度， 以確定是完全雜交還是不完全 雜交，因而探測(cè)方法的靈敏度及線性響應(yīng)也是非常重要的。 雜

29、交信號(hào)探測(cè)系統(tǒng)主要包括雜交 信號(hào)產(chǎn)生、信號(hào)收集及傳輸和信號(hào)處理及成像三個(gè)部分組成。由于所使用的標(biāo)記物不同， 因而相應(yīng)的探測(cè)方法也各具特色。 大多數(shù)研究者使用熒光標(biāo) 記物，也有一些研究者使用生物素標(biāo)記，聯(lián)合抗生物素結(jié)合物檢測(cè) DNA 化學(xué)發(fā)光。通過(guò)檢 測(cè)標(biāo)記信號(hào)來(lái)確定 DNA 芯片雜交譜型。1熒光標(biāo)記雜交信號(hào)的檢測(cè)方法使用熒光標(biāo)記物的研究者最多， 因而相應(yīng)的探測(cè)方法也就最多、 最成熟。 由于 熒光顯微 鏡可以選擇性地激發(fā)和探測(cè)樣品中的混合熒光標(biāo)記物，并具有很好的空間分辨率和熱分辨 率，特別是當(dāng) 熒光顯微鏡 中使用了共焦激光掃描時(shí)， 分辨能力在實(shí)際應(yīng)用中可接近由數(shù)值孔 徑和光波長(zhǎng)決定的空間分辨率，

30、而在傳統(tǒng)的顯微鏡是很難做到的，這便為 DNA 芯片進(jìn)一步 微型化提供了重要的檢測(cè)方法的基礎(chǔ)。大多數(shù)方法都是在人射照明式熒光顯微鏡 ( epifluoescence microscope )基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的， 包括激光掃描 熒光顯微鏡 、激光共焦掃描顯微鏡、 使用了 CCD 相機(jī)的改進(jìn)的 熒光顯微鏡 以及將 DNA 芯片直接制作在光纖維束切面上并結(jié)合 熒光顯微鏡 的光纖傳感器微陣列。這些方法基本上都是將待雜交對(duì)象 以熒光物質(zhì)標(biāo)記，如 熒光素或麗絲膠( lissamine )等，雜交后經(jīng)過(guò) SSC 和 SDS 的混合溶液或 SSPE 等緩沖液 清洗。( 1)激光掃描 熒光顯微鏡探測(cè)裝置比較典型。

31、方法是將雜交后的芯片經(jīng)處理后固定在計(jì)算機(jī)控制的二維傳動(dòng)平臺(tái) 上，并將一物鏡置于其上方， 由氬離子激光器產(chǎn)生激發(fā)光經(jīng)濾波后通過(guò)物鏡聚焦到芯片表面， 激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，光斑半徑約為5- 10 g。同時(shí)通過(guò)同一物鏡收集熒光信號(hào)經(jīng)另一濾波片濾波后， 由冷卻的 光電倍增管 探測(cè)， 經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換板轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)。 通過(guò)計(jì)算機(jī)控制 傳動(dòng)平臺(tái) XY 方向上步進(jìn)平移， DNA 芯片被逐點(diǎn)照射，所采集熒光信號(hào)構(gòu)成雜交信號(hào)譜 型，送計(jì)算機(jī)分析處理，最后形成20 口象素的圖像。這種方法分辨率高、圖像質(zhì)量較好，適用于各種主要類型的 DNA 芯片及大規(guī)模 DNA 芯片雜交信號(hào)檢測(cè)， 廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)、 基因診斷等方

32、面研究。(2)激光掃描共焦顯微鏡激光掃描共焦顯微鏡與激光掃描 熒光顯微鏡 結(jié)構(gòu)非常相似， 但是由于采用了共焦技術(shù)因 而更具優(yōu)越性。 這種方法可以在熒光標(biāo)記分子與 DNA 芯片雜交的同時(shí)進(jìn)行雜交信號(hào)的探測(cè)， 而無(wú)須清洗掉未雜交分子，從而簡(jiǎn)化了操作步驟大大提高了工作效率。Affymetrix 公司的SP AForder 等人設(shè)計(jì)的 DNA 芯片即利用此方法。其方法是將靶 DNA 分子溶液放在 樣品地中，芯片上合成寡 核苷酸 陣列的一面向下，與 樣品池 溶液直接接觸，并與 DNA 樣品 雜交。當(dāng)用激發(fā)光照射使熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光時(shí)，既有芯片上雜交的DNA 樣品所發(fā)出的熒光，也有樣品地中 DNA 所發(fā)出

33、的熒光，如何將兩者分離開(kāi)來(lái)是一個(gè)非常重要的問(wèn)題。而共 焦顯微鏡具有非常好的縱向分辨率， 可以在接受芯片表面熒光信號(hào)的同時(shí)， 避開(kāi) 樣品池 中熒 光信號(hào)的影響。一般采用氬離子激光器( 488nm )作為激發(fā)光源，經(jīng)物鏡聚焦，從芯片背 面入射， 聚集于芯片與靶分子溶液接觸面。 雜交分子所發(fā)的熒光再經(jīng)同一物鏡收集， 并經(jīng)濾 波片濾波， 被冷卻的 光電倍增管 在光子計(jì)數(shù)的模式下接收。 經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換反轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)送 微機(jī)處理， 成像分析。 在光電信增管前放置一共焦小孔， 用于阻擋大部分激發(fā)光焦平面以外 的來(lái)自 樣品池 的未雜交分子熒光信號(hào)， 避免其對(duì)探測(cè)結(jié)果的影響。 激光器前也放置一個(gè)小孔 光闌以盡量縮

34、小聚焦點(diǎn)處光斑半徑， 使之能夠只照射在單個(gè)探針上。 通過(guò)計(jì)算機(jī)控制激光束 或樣品池 的移動(dòng)， 便可實(shí)現(xiàn)對(duì)芯片的二維掃描， 移動(dòng)步長(zhǎng)與芯片上寡 核苷酸 的間距匹配， 在 時(shí)間長(zhǎng)， 比較適合研究用。 現(xiàn)在 Affymetrix 公司已推出商業(yè)化樣機(jī)， 整套系統(tǒng)約 12 萬(wàn)美元。幾分鐘至幾十分鐘內(nèi)即可獲得熒光標(biāo)記雜交信號(hào)圖譜。其特點(diǎn)是靈敏度和分辨率較高， 掃描（ 3）采用了 CCD 相機(jī)的 熒光顯微鏡這種探測(cè)裝置與以上的掃描方法都是基于 熒光顯微鏡 ，但是以 CCD 相機(jī)作為信號(hào)接收 器而不是 光電倍增管 ，因而無(wú)須掃描傳動(dòng)平臺(tái)。 由于不是逐點(diǎn)激發(fā)探測(cè)， 因而激發(fā)光照射光 場(chǎng)為整個(gè)芯片區(qū)域，由 CC

35、D 相機(jī)獲得整個(gè) DNA 芯片的雜交譜型。這種方法一般不采用激 光器作為激發(fā)光源， 由于激光束光強(qiáng)的高斯分布， 會(huì)使得光場(chǎng)光強(qiáng)度分布不均， 而熒光信號(hào) 的強(qiáng)度與激發(fā)光的強(qiáng)度密切相關(guān)， 因而不利于信號(hào)采集的線性響應(yīng)。 為保證激發(fā)光勻場(chǎng)照射， 有的學(xué)者使用高壓汞燈經(jīng)濾波片濾波， 通過(guò)傳統(tǒng)的光學(xué)物鏡將激發(fā)光投射到芯片上， 照明面 積可通過(guò)更換物鏡來(lái)調(diào)整； 也有的研究者使用大功率弧形探照燈作為光源， 使用光纖維束與 透鏡結(jié)合傳輸激發(fā)光，并與芯片表面呈 50o 角入射。由于采用了 CCD 相機(jī)，因而大大提高 了獲取熒光圖像的速度， 曝光時(shí)間可縮短至零點(diǎn)幾秒至十幾秒。 其特點(diǎn)是掃描時(shí)間短， 靈敏 度和分辨

36、率較低，比較適合臨床診斷用 14.（4）光纖傳感器有的研究者將 DNA 芯片直接做在光纖維束的切面上（遠(yuǎn)端） ，光纖維束的另一端（近 端）經(jīng)特制的耦合裝置耦合到 熒光顯微鏡 中。光纖維束由 7 根單模光纖組成。每根光纖的直 徑為200呵,兩端均經(jīng)化學(xué)方法拋光清潔。化學(xué)方法合成的寡 核苷酸探針共價(jià)結(jié)合于每根光纖的遠(yuǎn)端組成寡 核苷酸 陣列。 將光纖遠(yuǎn)端浸入到熒光標(biāo)記的靶分子溶液中與靶分子雜交， 通 過(guò)光纖維束傳導(dǎo)來(lái)自 熒光顯微鏡 的激光（ 490urn ），激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，仍用光纖維 束傳導(dǎo)熒光信號(hào)返回到 熒光顯微鏡 ，由 CCD 相機(jī)接收。每根光纖單獨(dú)作用互不干擾，而溶 液中的熒光信號(hào)基

37、本不會(huì)傳播到光纖中， 雜交到光纖遠(yuǎn)端的靶分子可在 90的甲酸胺（ for mamide ）和 TE 緩沖液中浸泡 10秒鐘去除，進(jìn)而反復(fù)使用。這種方法快速、便捷，可實(shí)時(shí) 檢測(cè) DNA 微陣列雜交情況而且具有較高的靈敏度，但由于光纖維束所含光纖數(shù)目有限，因 而不便于制備大規(guī)模 DNA 芯片，有一定的應(yīng)用局限性。2.生物素標(biāo)記方法中的雜交信號(hào)探測(cè)以生物素 ( biotin )標(biāo)記樣品的方法由來(lái)已久， 通常都要聯(lián)合使用其它大分子與抗生物素的結(jié)合物(如結(jié)合化學(xué)發(fā)光底物酶、熒光素等) ，再利用所結(jié)合大分子的特殊性質(zhì)得到最 初的雜交信號(hào)， 由于所選用的與抗生物素結(jié)合的分子種類繁多， 因而檢測(cè)方法也更趨多樣

38、化。 特別是如果采用 尼龍膜 作為固相支持物，直接以熒光標(biāo)記的探針用于 DNA 芯片雜交將受到 很大的限制， 因?yàn)樵?尼龍膜 上熒光標(biāo)記信號(hào)信噪比較低。 因而使用 尼龍膜 作為固相支持物的 這些研究者大多是采用生物素標(biāo)記的。目前應(yīng)用較多的是美國(guó) General Scanning 公司開(kāi)發(fā)的基因芯片專用檢測(cè)系統(tǒng) (ScanArray 3 000) ，采用激光共聚焦掃描原理進(jìn)行熒光信號(hào)采集， 由計(jì)算機(jī)處理熒光信號(hào)， 并對(duì)每個(gè)點(diǎn)的 熒光強(qiáng)度數(shù)字化后進(jìn)行分析。近期又開(kāi)發(fā)出了 ScanArray 5000 ，其掃描精度和功能有較大 的提高。七 結(jié)果的分析樣品在被測(cè)定前，首先要經(jīng)過(guò)消化，使待測(cè)組織細(xì)胞中的

39、 DNA 或 RNA 釋放出來(lái)，在經(jīng) 過(guò)適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增后，以熒光標(biāo)記物標(biāo)記，放入基因芯片自動(dòng)孵育裝置( Fluidics Station )中， 由其自動(dòng)控制反應(yīng)的時(shí)間、溫度以及緩沖液的配比等反應(yīng)條件，進(jìn)行雜交， 這一過(guò)程， 僅需 要數(shù)秒鐘。雜交完成后，要對(duì)基因芯片進(jìn)行 “讀片 ”，即應(yīng)用激光共聚焦熒光掃描顯微鏡，對(duì) 基因芯片表面的每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。 這種顯微鏡， 將聚焦的平面設(shè)定為芯片的表面， 因此可 以檢測(cè)結(jié)合到芯片表面位點(diǎn)的樣品片斷的熒光標(biāo)記， 而待測(cè)樣品中未與芯片上探針結(jié)合的熒 光標(biāo)記物， 則懸浮于溶液中，由于不在聚焦平面上，因而不被檢測(cè)。樣品與探針的錯(cuò)配是影 響雜交反應(yīng)結(jié)果的重要因素，

40、但由于樣品與芯片上的探針正確配對(duì)時(shí)產(chǎn)生的熒光信號(hào)要比錯(cuò) 配時(shí)強(qiáng)的多，因此，通過(guò)對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的分析，就可以區(qū)分正確與錯(cuò)誤的配對(duì)。為了使結(jié)果的檢驗(yàn)更加簡(jiǎn)便和快速， Affymetrix 的基因芯片的分析系統(tǒng)中采用了基因陣 列掃描儀和專用的基因芯片工作站， 對(duì)一幅包含數(shù)萬(wàn)個(gè)探針位點(diǎn)的基因芯片圖樣的分析， 僅 需要數(shù)分鐘的時(shí)間。 這樣在短短的幾十分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)， 就可以完成用傳統(tǒng)方法需要數(shù)月才 能完成的幾萬(wàn)乃至幾十萬(wàn)次雜交分析試驗(yàn)。八 基因芯片的應(yīng)用（一）基因表達(dá)分析 基因芯片具有高度的敏感性和特異性， 它可以監(jiān)測(cè)細(xì)胞中幾個(gè)至幾千 個(gè) mRNA 拷貝的轉(zhuǎn)錄情況。 與用單探針?lè)治?mRNA 的點(diǎn)雜交技術(shù)不

41、同， 基因芯片表達(dá)探針 陣列應(yīng)用了大約 20對(duì)寡核苷酸 探針來(lái)監(jiān)測(cè)每一個(gè) mRNA 的轉(zhuǎn)錄情況。每對(duì)探針中，包含一 個(gè)與所要監(jiān)測(cè)的 mRNA 完全吻合和一個(gè)不完全吻合的探針（圖2），這兩個(gè)探針的差別在于其中間位置的 核苷酸 不同。這種成對(duì)的探針可以將非特異性雜交和背景訊號(hào)減小到最低的水 平，由此我們就可以確定那些低強(qiáng)度的 mRNA 。目前， Affymetrix 公司已經(jīng)生產(chǎn)出 Hugene FL 、 Mu6500 （含有小鼠 6 500個(gè)基因）、 Ye6100 （含有酵母 6 100個(gè)基因）等基因芯片 成品。1 分析基因表達(dá)時(shí)空特征。英國(guó)劍橋大學(xué) Whitehead 研究所的 Frank C

42、.P. Holstege 等 人，應(yīng)用含有酵母基因組的基因芯片， 深入研究了真核細(xì)胞基因組的調(diào)節(jié)周期。 應(yīng)用基因組 水平的表達(dá)分析，監(jiān)測(cè)那些表達(dá)受轉(zhuǎn)錄起始機(jī)制的關(guān)鍵成分控制的基因，發(fā)現(xiàn) RNA 聚合酶 II、主要的轉(zhuǎn)錄因子 TFIID和SAGA染色體修飾復(fù)合物等均在基因的表達(dá)中有自己特定的作 用位點(diǎn) 15 。通過(guò)本試驗(yàn)， 研究人員揭示了： （1）基因特異性的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)表達(dá)的調(diào)控作用。 （2）細(xì)胞在缺乏營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境中，基因不同位點(diǎn)的協(xié)同調(diào)節(jié)作用的全新機(jī)制。（3）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的最終作用位點(diǎn)， 在最初的幾步中就可以確定。 以此試驗(yàn)為基礎(chǔ)， 研究人員進(jìn)一步繪制 出了酵母基因組控制圖， 并由此分析出了各種

43、調(diào)節(jié)因子在基因上不同的作用位點(diǎn)和其作用的 分子機(jī)制。美國(guó) Stanford 大學(xué)的 V.R.Iyer 等人16，對(duì)成纖維細(xì)胞中與細(xì)胞增生和損傷修復(fù)有關(guān)的 基因進(jìn)行了分析。首先，他們用成纖維細(xì)胞中的 8600個(gè)基因片斷制成基因芯片的探針陣列，通過(guò)與 mRNA 反轉(zhuǎn)錄形成的 cDNA 的雜交反應(yīng)， 可以判斷出該基因的活性。 在試驗(yàn)中， 成纖維細(xì)胞被置于無(wú)營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境中， 使絕大部分基因的活性關(guān)閉， 兩天后，加入10% 的血清， 24小時(shí)內(nèi)，分 6個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)，觀察基因的活化情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，在所有被監(jiān)測(cè)的基因中，約有 500個(gè)基因最為活躍，而使細(xì)胞保持不分裂狀態(tài)的基因活性被抑制。其中，最早被活化

44、的是那些轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因。在活化的基因中，有28 個(gè)基因共同作用，控制細(xì)胞的增殖；8個(gè)與免疫反應(yīng)的激活有關(guān)； 19 個(gè)與血管重建有關(guān)；另有許多基因，與血管新生密切相關(guān)。 在腫瘤細(xì)胞中， 基因的表達(dá)與正常的細(xì)胞存在著明顯的差異。 通過(guò)基因芯片繪出基因表達(dá)的 時(shí)空?qǐng)D譜，有助于人類認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)過(guò)程和特征。2 基因差異表達(dá)檢測(cè) 17 生命活動(dòng)中基因表達(dá)的改變是生物學(xué)研究的核心問(wèn)題。 理解人類 基因組中 10萬(wàn)個(gè)不同的基因功能，監(jiān)測(cè)某些組織、細(xì)胞不同分化階段的差異基因表達(dá)( diff erential gene expression ，DGE )十分重要。對(duì)差異表達(dá)的研究， 可以推斷基因與基因的 相互關(guān)系，

45、細(xì)胞分化中基因 “開(kāi)啟”或“關(guān)閉 ”的機(jī)制；揭示基因與疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的 內(nèi)在聯(lián)系。目前 DGE 研究方法主要有表達(dá)序列標(biāo)簽( ESTs )測(cè)序、差減克隆( subtractiv e cloning )、差異顯示( differential display )、基因表達(dá)系列分析 (serial analysis of gen e expression, SAGE) 。而 cDNA 微陣列雜交技術(shù)可監(jiān)測(cè)大量 mRNA 的轉(zhuǎn)錄，直接快速地 檢測(cè)出極其微量的 mRNA ，且易于同時(shí)監(jiān)測(cè)成千上萬(wàn)的基因，是研究基因功能的重要手段 之一。 Rihn BH 等利用基因芯片檢測(cè)胸膜間皮瘤與正常細(xì)胞間比較

46、了 6500 個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)了 300 多個(gè)差異基因的表達(dá)。 其中幾個(gè)典型基因的表達(dá)經(jīng) RT-PCR 進(jìn)行定量后， 可作為胸膜間 皮瘤診斷的標(biāo)記物(Markers ) 18。Sgroi19報(bào)告DNA芯片結(jié)合激光捕獲顯微切割技術(shù)(I aser capture microdissection )用于乳癌浸潤(rùn)期和轉(zhuǎn)移期及正常細(xì)胞的基因表達(dá)譜 ( gene expression profiIes )差異研究，結(jié)果被 定量 PCR 和免疫組化所證實(shí)。差異表達(dá)有助于早 期發(fā)現(xiàn)瘤細(xì)胞 3萬(wàn)個(gè)基因與正常細(xì)胞的區(qū)別， 有助于了解瘤細(xì)胞的發(fā)生、 浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和藥敏。 最近，美國(guó)毒物化學(xué)研究所( CIIT ) 和國(guó)家環(huán)

47、境健康科學(xué)研究所( NIEHS )正計(jì)劃在一張 玻片上建立 8 700個(gè)小白鼠 cDNA 芯片，用于肝癌的研究。我國(guó)也已成功研制出能檢出 41 000 種基因表達(dá)譜的芯片。美國(guó) Stanford 大學(xué)的 David Botstein 利用 cDNA 微陣列芯片， 對(duì)乳腺癌細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行了分析， 發(fā)現(xiàn)其基因表達(dá)水平明顯低于正常細(xì)胞。 利用基因芯 片對(duì)表達(dá)進(jìn)行分析，在一次試驗(yàn)中可以獲取相當(dāng)于在60 余萬(wàn)次傳統(tǒng)的 Northern 雜交中所獲 得的關(guān)于基因表達(dá)的信息。 通過(guò)這種實(shí)驗(yàn)方法， 可以建立一種全新的腫瘤分類學(xué)方法， 即依 據(jù)每個(gè)腫瘤細(xì)胞中的基因表達(dá)情況對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分類。 基因芯片技術(shù)在

48、分析基因的表達(dá)中 具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)。3 發(fā)現(xiàn)新基因 Moch 等利用腫瘤微陣列芯片（ 5 184 個(gè) cDNA 片段）發(fā)現(xiàn)了腎細(xì)胞癌的 腫瘤標(biāo)志物基因， 并于正常細(xì)胞進(jìn)行比較。 在532 份標(biāo)本中檢測(cè)到胞漿纖維Vimentin 的表達(dá)基因，陽(yáng)性率為51%61%20。追蹤觀察，有 Vimentin表達(dá)的患者，預(yù)后極差。人類大量 ESTs 給 cDNA 微陣列提供了豐富的資源， 數(shù)據(jù)庫(kù)中 400 000個(gè) ESTs 代表了所有人類基因， 成千上萬(wàn)的 ESTs 微陣列將為人類基因表達(dá)研究提供強(qiáng)有力的分析工具。 這將大大地加速人 類基因組的功能分析 21。定量檢測(cè)大量基因表達(dá)水平在闡述基因功能、 探

49、索疾病原因及機(jī)理、 發(fā)現(xiàn)可能的診斷及治療 靶等方面是很有價(jià)值的。如該技術(shù)在炎癥性疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）和炎癥性腸?。↖BD）的基因表達(dá)研究中，由RA或IBD組織制備探針，用 Cy3和Cy5熒光素標(biāo)記，然后與靶CDNA微陣列雜交，可檢測(cè)出炎癥疾病誘導(dǎo)的基因如TNF- a IL或粒細(xì)胞集落刺激因子，同時(shí)發(fā)現(xiàn)一些以前未發(fā)現(xiàn)的基因如 HME 基因和黑色素瘤生長(zhǎng)刺激因子。 Schena 等人22報(bào)道 了 CDNA 的微陣列在人類基因表達(dá)監(jiān)測(cè)、 生物學(xué)功能研究和基因發(fā)現(xiàn)方面的應(yīng)用。 采用含 1, 046 個(gè)已知序列的 CDNA 微陣列，用高速機(jī)器人噴印在玻片上，用雙色雜交法定量監(jiān)測(cè)不同 基因表達(dá)， 在

50、一定的實(shí)驗(yàn)條件下， 不同表達(dá)模式的陣列成分通過(guò)序列分析鑒定其特征。 該方 法較以往常用的方法敏感 10倍以上，檢測(cè)限度為 1:500,000（wt/wt） 總?cè)梭w mRNA 。在培養(yǎng) T 細(xì)胞熱休克反應(yīng)的測(cè)定中，發(fā)現(xiàn) 17個(gè)陣列成分的熒光比較明顯改變，其中1 1個(gè)受熱休克處理的誘導(dǎo)， 6個(gè)呈現(xiàn)中度抑制，對(duì)相應(yīng)于 17個(gè)陣列成分的 CDNA 測(cè)序發(fā)現(xiàn) 5個(gè)表達(dá)最高的成 分是 5種熱休克蛋白， 1 7個(gè)克隆中發(fā)現(xiàn) 3個(gè)新序列。另外，在佛波酯誘導(dǎo)檢測(cè)中 23，發(fā)現(xiàn)有 6個(gè)陣列成分信號(hào)增強(qiáng)超過(guò) 2倍，測(cè)序及數(shù)據(jù)庫(kù)比較揭示有 5個(gè)已知的，誘導(dǎo)表達(dá)最高的兩個(gè) 是PCA-1酪氨酸磷酸酶和核因子-啟1 ,有一

51、個(gè)是未知的。 這4個(gè)新基因的表達(dá)水平均相對(duì)較 低，僅呈現(xiàn) 2倍的誘導(dǎo)。 Northern 雜交結(jié)果證實(shí)了微陣列的結(jié)果。進(jìn)一步檢測(cè)了人的骨髓、4種組織中檢測(cè)出 1 5種熱休克和腦、前列腺及心臟組織中熱休克和佛波酯調(diào)節(jié)基因的表達(dá)， 佛波酯調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，其表達(dá)水平與 Jurkat 細(xì)胞中相應(yīng)成分的表達(dá)水平密切相關(guān)如在四種組織中表達(dá)水平最高的兩個(gè)基因3-actin和細(xì)胞色素C氧化酶在Jurkat細(xì)胞中的表達(dá)水平也很高。 上述實(shí)驗(yàn)提示在缺乏任何序列信息的條件下， 微陣列可用于基因發(fā)現(xiàn)和基因表達(dá)檢 測(cè)。目前，大量人類 ESTs 給 cDNA 微陣列提供了豐富的資源，數(shù)據(jù)庫(kù)中 400,000 個(gè) ESTs

52、 代表了所有人類基因， 成千上萬(wàn)的 ESTs 微陣列將為人類基因表達(dá)研究提供強(qiáng)有力的分析工 具。這將大大地加速人類基因組的功能分析。4 大規(guī)模 DNA 測(cè)序 人類基因組計(jì)劃的實(shí)施促進(jìn)了高效的、自動(dòng)化操作的測(cè)序方法 的發(fā)展。芯片技術(shù)中雜交測(cè)序( sequencing by hybridization, SBH )技術(shù)及鄰堆雜交( co ntiguous stacking hybridization, CSH )技術(shù)即是一種新的高效快速測(cè)序方法 24-26 。用含 65 536個(gè)8聚寡核苷酸 的微陣列，采用 SBH 技術(shù)，可測(cè)定 200 bp 長(zhǎng) DNA 序列，采用 67 1 08 864個(gè)13聚

53、寡核苷酸的微陣列，可對(duì)數(shù)千個(gè)堿基長(zhǎng)的DNA測(cè)序。SBH技術(shù)的效率隨著微陣列中寡 核苷酸 數(shù)量與長(zhǎng)度的增加而提高， 但微陣列中寡 核苷酸數(shù)量與長(zhǎng)度的增加則提高 了微陣列的復(fù)雜性，降低了雜交準(zhǔn)確性。 CSH 技術(shù)彌補(bǔ)了 SBH 技術(shù)存在的弊端， CSH 技 術(shù)的應(yīng)用增加了微陣列中寡 核苷酸的有效長(zhǎng)度，加強(qiáng)了序列準(zhǔn)確性，可進(jìn)行較長(zhǎng)的 DNA 測(cè) 序。計(jì)算機(jī)模擬論證了 8聚寡核苷酸微陣列與 5聚寡核苷酸鄰堆雜交，相當(dāng)于 13聚寡核苷酸 微陣列的作用，可測(cè)定數(shù)千個(gè) 核苷酸 長(zhǎng)的 DNA 序列26 。 Dubiley 等人26將合成的 10聚寡核 苷酸固定于排列在載片表面的 0.1 >0.1 X0.

54、02mm或1 X1 X0.02mm聚丙酰胺凝膠墊上制備聚 寡核苷酸 微陣列，先用分離微陣列( fractionation chips )進(jìn)行單鏈 DNA 分離，再用測(cè)序微 陣列(sequencing chips )分析序列，后者聯(lián)合采用了10聚寡核苷酸微陣列的酶促磷酸化、DNA 雜交及與鄰堆的 5聚寡核苷酸連接等技術(shù)。該方法可用于含重復(fù)序列及較長(zhǎng)序列的 DN A 序列測(cè)定及不同基因組同源區(qū)域的序列比較。利用基因芯片測(cè)序的準(zhǔn)確率達(dá)99% 以上。正如 NIH 首腦 Harold Varmus 在美國(guó)細(xì)胞生物學(xué) 1 998年年會(huì)上所說(shuō)： “在基因芯片的幫助 下，我們將能夠監(jiān)測(cè)一個(gè)細(xì)胞乃至整個(gè)組織中所

55、有基因的行為?！?二) 基因型、基因突變和多態(tài)性分析在同一物種不同種群和個(gè)體之間， 有著多種不同的基因型， 而這種不同， 往往與個(gè)體的不同性狀和多種遺傳性疾病有著密切的關(guān)系。通過(guò)對(duì)大量具有不同性狀的個(gè)體的基因型進(jìn)行比 較，就可以得出基因與性狀的關(guān)系。 但是， 由于大多數(shù)性狀和遺傳性疾病是由多個(gè)基因同時(shí) 決定的， 因此分析起來(lái)就十分困難， 然而基因芯片技術(shù)恰恰解決了這一問(wèn)題， 利用其可以同 時(shí)反應(yīng)數(shù)千甚至更多個(gè)基因的特性，我們就可以分析基因組中不同基因與性狀或疾病的關(guān) 系。美國(guó) Stanford 大學(xué)的 E.A.Winzeler 等27 ，以兩種不同菌株的酵母（ S96 和 YJM789 ） 作

56、為實(shí)驗(yàn)材料， 對(duì)控制酵母對(duì)放線菌酮的抗藥性的基因進(jìn)行分析。 將含有酵母 150 000 個(gè) D NA 片斷的基因芯片分別與這兩株酵母活化轉(zhuǎn)錄的 mRNA 分子雜交， S96 幾乎全部吻合， 而 YJM789與芯片上的探針組存在較大的差異，約有3000個(gè)位點(diǎn)沒(méi)有雜交顯色。由于S96對(duì)放線菌酮有抗藥性而 YJM789 的抗藥性則弱的多，因此可以判定控制這一抗藥性的基因的所 在。而后，通過(guò)對(duì) S96 和 YJM789 雜交后產(chǎn)生的抗藥子代的遺傳標(biāo)記的分析，進(jìn)一步確定， 控制該抗藥性的基因位于 15號(hào)染色體，是一長(zhǎng)約 57 000個(gè)堿基的片斷。美國(guó)國(guó)家人類基因 組研究室的 J.G.Hacia 等在 F

57、odor 研究小組的協(xié)助下 28，將基因芯片應(yīng)用于雙色突變分析。 他們的分析對(duì)象是與人類遺傳性乳腺癌和卵巢癌密切相關(guān)的BRCA1 基因的外顯子 11。在擴(kuò)增后，將 BRCA1 基因的外顯子 11置于含有熒光素 -12-UTP 的環(huán)境中進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，而 后將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的 mRNA 與 BRCA1 外顯子 11芯片雜交， 4小時(shí)后，用藻紅蛋白染色。在觀察 時(shí)，用 488nm 的氬離子激光進(jìn)行掃描，熒光染色位點(diǎn)呈現(xiàn)綠色，而藻紅蛋白染色的位點(diǎn)呈 現(xiàn)紅色。 應(yīng)用雙色分析， 可以更為清楚的監(jiān)測(cè)未知樣品與標(biāo)準(zhǔn)鏈之間的競(jìng)爭(zhēng)性雜交情況，進(jìn)而分析該基因中的不同突變。通過(guò)對(duì) 15名患者 BRCA1 基因的觀察，有 14名患者在外顯子 1 1位點(diǎn)存在不同的突變。Hacia等：29在1.28 cm X1.28 cm的芯片上固定了 9.66 X104個(gè)長(zhǎng)度為20 nt的寡核苷酸探針，用于檢測(cè)乳腺癌基因BRCA1的e