基因探針及其應(yīng)用

1、基因探針及其應(yīng)用當(dāng)前人類(lèi)基因組研究方興未艾，許多基因的結(jié)構(gòu)、功能相繼得到闡明。人類(lèi)基因組有3109個(gè)堿基對(duì)，約有10萬(wàn)個(gè)基因在不停地工作，我們?cè)撊绾螐倪@龐大的基因組中找到自已感興趣的目的基因，尤其是單拷貝基因？這里就需要用到核酸雜交技術(shù)。所謂核酸雜交，是根據(jù)堿基配對(duì)原理，以已知DNA片斷(基因片斷)作為探針與待測(cè)樣品DNA片斷進(jìn)行雜交，從而判斷兩者的一致性或同源性程度。其中，選擇、制備合適的基因探針至關(guān)重要。1 基因探針的概念基因探針，即核酸探針，是一段帶有檢測(cè)標(biāo)記，且順序已知的，與目的基因互補(bǔ)的核酸序列(DNA或RNA)。基因探針通過(guò)分子雜交與目的基因結(jié)合，產(chǎn)生雜交信號(hào)，能從浩翰的基因組中把

2、目的基因顯示出來(lái)。根據(jù)雜交原理，作為探針的核酸序列至少必須具備以下兩個(gè)條件：應(yīng)是單鏈，若為雙鏈，必須先行變性處理。應(yīng)帶有容易被檢測(cè)的標(biāo)記。探查不同的目的基因和不同種類(lèi)的基因缺陷，應(yīng)當(dāng)選擇使用不同種類(lèi)和長(zhǎng)度的探針。2 基因探針的種類(lèi)總體上，基因探針可以分為人工合成的DNA探針和天然的克隆探針兩鐘。21 人工合成的DNA探針(主要是指寡核苷醚探針)用磷酸三酯法或亞磷酸三酯法等化學(xué)法人工合成，目前均由DNA合成儀合成。最常見(jiàn)的寡核苷酸探針長(zhǎng)度在1830個(gè)堿基之間。其特異性可以根據(jù)需要加以改變，以識(shí)別靶序列中單堿基變化。如果被測(cè)基因的序列已知，基因缺陷主要是點(diǎn)突變，可以人工合成一段與被測(cè)序列互補(bǔ)的寡苷

3、酸探針。通常是兩種寡核苷酸探針同時(shí)使用，一個(gè)與正常序列互補(bǔ)，一個(gè)與缺陷序列互補(bǔ)，通過(guò)分子雜交，將缺陷基因與正常基因區(qū)別開(kāi)來(lái)。22 天然的克隆探針 是對(duì)天然核酸序列進(jìn)行克隆得到，大致包括cDNA探針、基因組探針、RNA探針、內(nèi)含子序列探針和小衛(wèi)星DNA探針等。最常見(jiàn)的有三種：cDNA探針：經(jīng)典方法是先從細(xì)胞總RNA中分離出mRNA，再由逆轉(zhuǎn)錄途徑從mRNA合成cDNA，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，并用適當(dāng)方法從文庫(kù)中篩選出所需的cDNA克隆。也可應(yīng)用PCR法從總RNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)，再克隆到某種質(zhì)粒中，經(jīng)細(xì)菌擴(kuò)增，可得大量的重組質(zhì)粒。通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶切下特異cDNA，再進(jìn)行標(biāo)記，即可獲得用于雜交的探針。

4、基因組探針：這類(lèi)探針是直接從人基因文庫(kù)中篩選而得，故包含內(nèi)含子序列。其制備過(guò)程大致如下：將人基因組DNA切割成20kb左右的片斷，以DNA為載體，組建成包括所有人類(lèi)基因的基因文庫(kù)。從基因文庫(kù)中可以篩選出各種特定的基因重組體，再經(jīng)次級(jí)克隆，將一段特異基因重組到不同質(zhì)粒上。經(jīng)篩選、擴(kuò)增后，抽提質(zhì)粒DNA，并用限制性?xún)?nèi)切酶切下特異DNA片斷，再進(jìn)行標(biāo)記，制成基因組探針(見(jiàn)圖1)。RNA探針：將一段已知的基因序列重組在細(xì)菌啟動(dòng)子的后面，在細(xì)菌RNA聚合酶的作用下，加入標(biāo)記底物，就可合成拷貝數(shù)很高的RNA探針。RNA探針的特征是單鏈、與DNA結(jié)合更牢、拷貝數(shù)高、容易制備。天然的克隆探針具有較長(zhǎng)的序列和更

5、高的復(fù)雜性，因而通常要比寡核苷酸探針具有更高的特異性，一般也容易獲得較強(qiáng)的雜交信號(hào)。3 基因探針的標(biāo)記和工作程序作為探針的核酸樣品必須進(jìn)行標(biāo)記才能被檢測(cè)。基因探針的標(biāo)記可分為放射性同位素標(biāo)記和非放射性同位素標(biāo)記兩種。放射性標(biāo)記常用的同位素有32P、35S、125I及3H等。標(biāo)記方法是依靠酶促反應(yīng)將用同位素標(biāo)記的核苷酸摻入到探針中。標(biāo)記好的探針即可用于和待測(cè)樣品DNA進(jìn)行雜交反應(yīng)，然后通過(guò)放射自顯影來(lái)檢測(cè)(圖2)。放射性標(biāo)記探針與放射自顯影檢測(cè)相結(jié)合為當(dāng)前應(yīng)用的雜交分析提供了最高的靈敏度和最強(qiáng)的分辨率。然而放射性同位素的污染、昂貴、半衰期短、自顯影時(shí)間長(zhǎng)及對(duì)人體有危害等缺點(diǎn)，使得放射性標(biāo)記探針的

6、應(yīng)用尤其是商業(yè)性應(yīng)用受到一定限制。所以非放射性標(biāo)記探針取代放射性標(biāo)記探針將是趨勢(shì)。目前發(fā)展的非放射性標(biāo)記探針主要有三種類(lèi)型：(1)生物素標(biāo)記探針。(2)半抗原標(biāo)記探針。(3)酶標(biāo)記探針，如過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或半乳糖苷酶等。它們都是將標(biāo)記物直接或間接連接在DNA或RNA片斷上，利用標(biāo)記物和其特異性結(jié)合物之間的結(jié)合及熒光素或酶的顯色反應(yīng)來(lái)指示雜交反應(yīng)。以生物素標(biāo)記探針為例，通過(guò)酶促聚合作用將生物素標(biāo)記的三磷酸脫氧核苷酸摻入到DNA中制得探針?？股锼氐鞍子卸鄠€(gè)位點(diǎn)可以結(jié)合生物素，所以利用抗生物素蛋白和生物素-酶結(jié)合去檢測(cè)這些生物素標(biāo)記的探針。當(dāng)其與酶(如堿性磷酸酶)的底物反應(yīng)時(shí)，通過(guò)反應(yīng)產(chǎn)物的

7、顏色顯示目的基因之所在(圖3)。總體上說(shuō)，目前非放射性標(biāo)記在靈敏度、穩(wěn)定性等方面還不如放射性同位素標(biāo)記。4 基因探針的應(yīng)用利用基因探針的各種核酸分子雜交技術(shù)，在分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的研究方面應(yīng)用極為廣泛，是DNA分析的基礎(chǔ)。例如提取出一段核酸片斷是否帶有必要的基因，可以利用制備的基因探針來(lái)進(jìn)行分子雜交加以判斷。利用基因探針還可以對(duì)分子克隆進(jìn)行篩選，以獲得所需的陽(yáng)性克隆?；蛱结槍?duì)遺傳病的診斷尤其重要。現(xiàn)已知許多遺傳病的致病基因及其突變類(lèi)型，其中由單基因突變所致的遺傳病就達(dá)6000多種。如世界上最常見(jiàn)、發(fā)生率最高的單基因遺傳病地中海貧血癥，是由于珠蛋白肽鏈合成的障礙所致。應(yīng)用珠蛋白基因探針對(duì)地

8、中海貧血癥風(fēng)險(xiǎn)胎兒作產(chǎn)前DNA分析，是比較可靠和可行的診斷方法。而利用這一方法廣泛地開(kāi)展遺傳病的產(chǎn)前基因診斷可防止患兒出生，降低發(fā)病率，具有重大的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)意義。癌的形成是遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，其中癌基因與抑癌基因的活動(dòng)與癌癥的發(fā)生關(guān)系密切。利用基因探針可對(duì)它們進(jìn)行分析，這不僅對(duì)闡明癌癥的發(fā)生機(jī)制具有重要意義，也為在基因水平上對(duì)癌癥進(jìn)行診斷、分類(lèi)、分型和預(yù)后開(kāi)辟了新的途徑。采用基因探針技術(shù)對(duì)傳染性流行病病原體如細(xì)菌、病毒的檢測(cè)可以得到直接、可靠的結(jié)果，并且靈敏度很高，有時(shí)甚至存在一個(gè)病原體即可檢出。如可在那些持續(xù)感染乙肝病毒(HBV)而血清學(xué)檢查陰性的人的血清標(biāo)本中檢出HBV。

9、又如用沙眼衣原體的DNA制備的探針可特異地檢測(cè)出15個(gè)血清型病原。基因探針還在其它許多方面發(fā)揮作用。如用性染色體Y特異的DNA探針可對(duì)妊娠早期的胎兒進(jìn)行性別鑒定；應(yīng)用小衛(wèi)星DNA探針?biāo)M(jìn)行的DNA指紋分析已在法醫(yī)學(xué)中用于罪犯身份的鑒定。5 展望基因探針技術(shù)目前正處于繼續(xù)發(fā)展階段。時(shí)下已經(jīng)出現(xiàn)的基因芯片(genechip)就是基因探針的“集成化”。它是將大量的寡聚DNA探針固定于特殊載體上，經(jīng)與帶有熒光標(biāo)記的樣品DNA雜交后，通過(guò)分析熒光信號(hào)來(lái)獲得樣品DNA序列信息。例如合成8個(gè)堿基的探針數(shù)目為48即65536種，將它們固定于載體上，探針密度最高可達(dá)106/cm2，這種驚人的密度大大提高了基因探針的檢測(cè)效率。由于基因芯片技術(shù)的迅速發(fā)展，將使基因探針的應(yīng)用更為廣泛