實(shí)驗(yàn)研究醫(yī)學(xué)論文范文 最新醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究范文

1、實(shí)驗(yàn)研究醫(yī)學(xué)論文范文 最新醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究范文    實(shí)驗(yàn)研究醫(yī)學(xué)論文范文 最新醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究范文    鋅和維生素 E 對(duì)型糖尿病大鼠心肌 Livin 表達(dá)的影響 醫(yī)學(xué)論文發(fā)表?創(chuàng)新醫(yī)學(xué)網(wǎng) http:/www.yixue3 醫(yī)學(xué)論文發(fā)表?創(chuàng)新醫(yī)學(xué)網(wǎng) ? 作者：張婷 張端蓮 作者單位：(武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖 與組織胚胎學(xué)系 武漢 430071)【摘要】 目的：探討鋅(Zn)和維生素 E(VE)對(duì)糖尿病大鼠心肌細(xì) 胞保護(hù)作用的機(jī)制。方法：按體重將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(10 只) 和實(shí)驗(yàn)組(40 只),實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物采用

2、腹腔注射鏈脲左菌素(streptozotocin， STZ)，60mg/kg 一次注射，制備糖尿病大鼠模型。將 40 只按血糖值 參考體重分為 4 組:糖尿病對(duì)照組,糖尿病補(bǔ)鋅組,糖尿病補(bǔ) VE 組,糖尿 病補(bǔ) Zn+VE 組。6 周后將各組大鼠處死,切取心室肌組織,進(jìn)行免疫組 織化學(xué)染色,觀察各組心肌組織 Livin 的表達(dá)水平, 利用 HPIAS 2000 圖像分析系統(tǒng)測(cè)定 Livin 在以上各組中表達(dá)的平均光密度和平均 陽(yáng)性面積率。 結(jié)果：正常對(duì)照組心肌細(xì)胞內(nèi) Livin 呈陽(yáng)性表達(dá), 糖尿 病對(duì)照組心肌細(xì)胞內(nèi) Livin 呈陰性表達(dá);糖尿病補(bǔ)鋅組和糖尿病補(bǔ) VE 組心肌細(xì)胞內(nèi) Livi

3、n 呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá);糖尿病補(bǔ) Zn+VE 組心肌細(xì)胞內(nèi) Livin 呈弱陽(yáng)性表達(dá)。圖像分析結(jié)果顯示：糖尿病補(bǔ) Zn+VE 組與糖尿 病對(duì)照組、糖尿病補(bǔ)鋅組及糖尿病補(bǔ) VE 組之間 Livin 的平均光密度 及陽(yáng)性面積率的差異有顯著性意義(P<0.05);糖尿病補(bǔ) Zn+VE 組與正 常組之間 Livin 的平均光密度及陽(yáng)性面積率的差異無(wú)顯著性意義(P>0 05)。 結(jié)論： Zn 和 VE 聯(lián)合使用可對(duì)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞具有重要 的保護(hù)作用?！娟P(guān)鍵詞】 鋅; 維生素 E; 糖尿病; 心肌; Livin糖尿病( diabetes mellitus ,DM) 是一類由于胰島素絕對(duì)或相對(duì)缺

4、乏或胰島素生物活性降低,或者以上二者共同引起體內(nèi)代謝失調(diào)及高 血糖狀態(tài)。臨床上主要分為 2 型,即 1 型糖尿病和型糖尿病1。 型糖尿病,或稱胰島素依賴性糖尿病( IDD) 屬于自身免疫性疾病。機(jī) 體對(duì)自身胰腺細(xì)胞進(jìn)行持續(xù)攻擊,造成細(xì)胞大量破壞,胰島素分泌 嚴(yán)重匱乏。型糖尿病的發(fā)病是由于機(jī)體對(duì)胰島素產(chǎn)生抵抗,同時(shí)合 并胰島素分泌的相對(duì)不足2。近幾年來(lái),糖尿病的發(fā)病率持續(xù)增長(zhǎng)。 截止到 1997 年,全世界糖尿病患者為 12 億 4 千萬(wàn),其中 97 %屬于型 糖尿病3 。隨著生活方式的改變,經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,以及人口結(jié)構(gòu)變化,到 2010 年,全球糠尿病患者將達(dá)到 22 億 1 千萬(wàn)。 在中國(guó),糖尿

5、病的患病 人口為 2 0004 000 萬(wàn),并在以年發(fā)病率 75 萬(wàn)人的速度遞增。如何 有效控制糖尿病及其并發(fā)癥是當(dāng)前世界醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)切的課題。糖尿病性心肌病是糖尿病的慢性并發(fā)癥之一,是糖尿病發(fā)病過(guò)程 中特異性的心肌受損和心臟功能改變,糖尿病性心肌病的出現(xiàn)可以不 伴有缺血性病變、血管病變及高血壓等并發(fā)癥。目前有關(guān)糖尿病性心 肌病的確切病因還不清楚,但認(rèn)為糖尿病性心肌病的發(fā)生主要與心肌 能量代謝紊亂、Ca2+ 超載、血管動(dòng)脈硬化、氧化應(yīng)激、高血壓及高 血糖導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡等有關(guān)4。細(xì)胞凋亡是由多種因子介導(dǎo)的細(xì)胞主動(dòng)死亡的過(guò)程,對(duì)機(jī)體或組 織維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、生命周期、衰老死亡都

6、有 著重要的作用。在凋亡的調(diào)節(jié)因素中,凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)是新發(fā)現(xiàn)的一類在結(jié)構(gòu)上具有同源性的細(xì)胞 凋亡抑制蛋白,它不僅抑制天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspases) 的活性使細(xì)胞凋亡受阻,同時(shí)還調(diào)節(jié)著細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期及信號(hào)傳 導(dǎo)等多個(gè)重要環(huán)節(jié),其成員 livin 是新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制基因, 它可以作 為一種酶抑制劑通過(guò) BIR 結(jié)構(gòu)域與激活的 Caspases 蛋白，如 Caspase 3、 Caspase 7 等結(jié)合， 導(dǎo)致 Caspases 蛋白的失活和降解。 Caspases 蛋白是介導(dǎo)凋亡的主要因素之一，大多

7、數(shù)刺激物通過(guò)激活 Caspases 蛋白的級(jí)聯(lián)反應(yīng)而引起凋亡57。Zn 作為機(jī)體必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素,是體內(nèi) 200 多種蛋白酶的金屬 配基,其含量的增加勢(shì)必有利于這些酶活性的提高。Zn 對(duì)細(xì)胞保護(hù)作 用的途徑之一,是基于控制過(guò)氧化作用。VE 作為天然抗氧化成分,對(duì) 維持體內(nèi)自由基平衡,促進(jìn)機(jī)體正常發(fā)育,保護(hù)細(xì)胞膜穩(wěn)定具有重要作 用。鋅和維生素 E 是抗氧化劑并具有細(xì)胞保護(hù)作用。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察了鋅和維生素 E 聯(lián)合應(yīng)用對(duì) 高血糖引起的心肌細(xì)胞的保護(hù)作用， 旨在探討兩者對(duì)糖尿病大鼠心肌 結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用。1 材料與方法1.1 材料昆明種 SD 大鼠 50 只,雄性,體重 180200

8、g ,武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物中心提供,適應(yīng)飼養(yǎng) 1w 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.2 方法1.2.1 動(dòng)物模型建立及分組 按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組(10 只) 和實(shí)驗(yàn)組(40 只) ,各組大鼠禁食 12h 后,實(shí)驗(yàn)組大鼠以 60mg/kg 的劑量 一次性腹腔注射 STZ 溶液(用 0.1mol/ L、 4.4 的枸櫞酸鹽緩沖液在 pH 冰浴下配制成 11mg/ml 的 STZ 溶液),正常對(duì)照組大鼠(NC)注射等體 積的枸櫞酸鹽緩沖液。觀察動(dòng)物飲水、進(jìn)食及尿量變化等情況。一周 后,采尾靜脈血測(cè)血糖,以血糖濃度> 16.6mmol/ L ,飲水量> 40 ml/ d ,尿 糖強(qiáng)陽(yáng)性( + +

9、+ + + + + )的大鼠作為糖尿病大鼠。將選取糖尿病 大鼠 40 只按血糖值參考體重分為 4 組:糖尿病對(duì)照組,糖尿病補(bǔ)鋅組, 糖尿病補(bǔ) VE 組,糖尿病補(bǔ) Zn+VE 組。各組動(dòng)物均喂飼人工合成飼料, 配方:酪蛋白 20 % ,玉米淀粉 65% ,植物油 8% ,纖維素 1% ,混合維生素 1% ,混合無(wú)機(jī)鹽 5%?；旌暇S生素和無(wú)機(jī)鹽配方參見文獻(xiàn)5,合成 飼料控制鋅濃度為 20mg/kg。正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組給予去離子水;補(bǔ)Zn 組給予 Zn 濃度為 20 mg/L 的含 ZnSO47H2O 去離子水;補(bǔ) VE 組每天以 50 mg/ kgVE 灌胃;Zn 和 VE 聯(lián)合補(bǔ)充組在給予 Zn

10、 濃度為 20mg/L 的含 ZnSO4 7H2O 去離子水的同時(shí)以 50mg/ kgVE 灌胃。 實(shí)驗(yàn)期間,密切觀察動(dòng)物進(jìn)食和飲水量變化,每周稱兩次體重,6 周后將 各組大鼠處死,切取心室壁肌組織,進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察。1.2.2 主要試劑即用型兔抗鼠 Livin 單克隆抗體(北京中杉生物技術(shù)有限公司);超 敏即用型 S P 通用型免疫組織化學(xué)試劑盒(福州邁新公司);DAB 顯 色試盒及多聚賴氨酸(北京中山生物技術(shù)有限公司)。1.2.3 免疫組織化學(xué) S P 法檢測(cè) Livin 相關(guān)抗原主要步驟： 組織切片 5 m，常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水洗; 3%過(guò)氧化氫，37孵育 10 min 以抑制內(nèi)

11、源性過(guò)氧化物酶活 性，PBS 洗 4×5min; 切片采用微波抗原修復(fù)(3 檔，10 min)，PBS 洗 4×5min; 正常羊血清 37孵育 10 min 以減少非特異性反應(yīng); 一抗 37孵育 1h，PBS 洗 4×5min; 生物素標(biāo)記的二抗，37孵育 10 min，PBS 洗 4×5min; 鏈霉菌抗生物素蛋白過(guò)氧化物酶復(fù)合物 37孵育 10 min， PBS 洗 4×5min; DAB 顯色液顯色，自來(lái)水沖洗終止反應(yīng); 蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。用 PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。1.2.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷以胞核或胞漿出現(xiàn)棕黃

12、色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。 陰性對(duì)照除細(xì)胞核染 成藍(lán)色外，胞漿內(nèi)無(wú)棕黃色反應(yīng)物。采用 HPIAS-2000 高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)(同濟(jì)千屏影像公司)對(duì) Livin 的表達(dá)進(jìn)行定量分析， 每張切片隨機(jī)選取 5 個(gè)完 整而不重疊的高倍鏡視野(×400)，測(cè)定每個(gè)視野下陽(yáng)性反應(yīng)的平均 光密度、陽(yáng)性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計(jì)算陽(yáng)性面積率。以每例 5 個(gè)視野的平均光密度、 陽(yáng)性面積率的平均值作為該例的測(cè)量值(陽(yáng)性 面積率=單位面積中陽(yáng)性反應(yīng)的總面積/單位面積中細(xì)胞的總面積× 100%)。1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理對(duì)各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性顆粒的平均光密度、 陽(yáng)性面積率作 單因素方差

13、分析和 SNK q 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為 0.05。2 結(jié)果Livin 的表達(dá) 正常對(duì)照組心肌細(xì)胞胞核和胞漿內(nèi)可見密集分布 的棕黃色顆粒，Livin 表達(dá)呈陽(yáng)性, 糖尿病對(duì)照組心肌細(xì)胞核和胞漿 內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒, Livin 表達(dá)呈陰性;糖尿病補(bǔ)鋅組心肌細(xì)胞 核和胞漿內(nèi)可見一些棕黃色顆粒, Livin 表達(dá)呈弱陽(yáng)性，糖尿病補(bǔ) VE 組結(jié)果與糖尿病補(bǔ)鋅組相同;糖尿病補(bǔ) Zn+VE 組心肌細(xì)胞核和胞漿內(nèi) 可見密集分布的棕黃色顆粒, Livin 表達(dá)呈陽(yáng)性。 圖像分析結(jié)果顯示見 表。糖尿病補(bǔ) Zn+VE 組與糖尿病對(duì)照組、糖尿病補(bǔ)鋅組及糖尿病補(bǔ) VE 組之間平均光密度及陽(yáng)性面積率的差異有顯著性意義

14、(P<0.05);糖尿病對(duì)照組與糖尿病補(bǔ)鋅組、糖尿病補(bǔ) VE 組之間平均光密度及陽(yáng)性 面積率的差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)，見表 1。表 1 糖尿病補(bǔ) Zn+VE 組、糖尿病對(duì)照組、糖尿病補(bǔ)鋅組及糖尿病補(bǔ) VE 組 Livin 表達(dá)的平 均光密度和陽(yáng)性面積率注： * 正常對(duì)照組與糖尿病對(duì)照組比較， P<0.05 ;# 糖尿病對(duì)照組與糖尿病補(bǔ) Zn+VE 組比較，P<0.05。3 討論近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)證明,絕大多數(shù)的 2 型糖尿病病人,無(wú)論胖 瘦,都客觀地存在著細(xì)胞總數(shù)的減少。細(xì)胞總數(shù)至少受以下 4 個(gè) 因素來(lái)調(diào)節(jié): 細(xì)胞的復(fù)制; 細(xì)胞的體積; 新的細(xì)胞生成 (比

15、如來(lái)自于胰腺導(dǎo)管上皮的新生細(xì)胞) ; 細(xì)胞的凋亡。每個(gè)因 素對(duì)于維持細(xì)胞總數(shù)的作用,都隨著生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段以及不同 的代謝負(fù)荷而改變,甚至在不同的種族都有所不同(這種差異在不同種 的小鼠之間都有所表現(xiàn))。高濃度 Glucose 使促凋亡和抗凋亡基因表 達(dá)失衡,繼而改變線粒體的穩(wěn)態(tài)、活化 caspase 系統(tǒng),啟動(dòng)不可逆轉(zhuǎn)的 凋亡過(guò)程810。臨床上主要分為 2 型,即 1 型糖尿病和 2 型糖尿病,為一類常見 病、多發(fā)病,發(fā)病率有愈來(lái)愈高的趨勢(shì)。世界各國(guó)糖尿病患病率均上 升,其中 90%為 2 型糖尿病。 WHO1997 年報(bào)告,全世界糖尿病患者 1.35 億。近 20 年來(lái),中國(guó)糖尿病患病率

16、從 1980 年的 0.67 %上升至 1997 年的 3.2 % ,上升近 5 倍11。在非傳染性疾病中,糖尿病死亡率僅次于 腫瘤和心血管病而居第三位。 胰島素治療使糖尿病急性并發(fā)癥死亡率 下降,但慢性并發(fā)癥死亡率卻因此而上升。其根本原因在于對(duì) 2 型糖 尿病的病因及發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)尚不清楚。 關(guān)于糖尿病的發(fā)病原因,1 型 糖尿病已研究得較為深入,可能與 HLA 系統(tǒng)、基因突變等有關(guān)。關(guān)于 2 型糖目前的認(rèn)識(shí)是由遺傳因素與環(huán)境因素共同作用,經(jīng)由胰島素抵 抗、細(xì)胞功能減退、臨床糖尿病等不同發(fā)展階段。糖尿病的發(fā)病較 為復(fù)雜,了解還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。糖尿病患者在無(wú)明顯微血管病變時(shí)也可出 現(xiàn)心力衰竭,表明糖尿

17、病患者心肌細(xì)胞本身可以發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能改變, 提示有心肌病的可能12。凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein,IAP)是一類重要 的抗細(xì)胞凋亡因子,該家族結(jié)構(gòu)的共同特點(diǎn)是 N 端含有一個(gè)或多個(gè)(目 前發(fā)現(xiàn)最多為 3 個(gè))串聯(lián)的桿狀病毒 IAP 重復(fù)序列(baculovirus IAP repeat, BIR),C 端含或不含有一個(gè)環(huán)指(ring finger)結(jié)構(gòu).目前人類 IAP 家族已發(fā)現(xiàn)有 8 個(gè)成員,即 NAIP,XIAP(ILP 1/MIHA),cIAP 1(HIAP 2/MI HB), cIAP 2 ( HIAP 1/MIHC ), survi

18、vin ( TIAP ), apollon(Bruce),ILP 2(Ts IAP)和 livin (ML IAP/KIAP) 。Livin 抗細(xì)胞凋亡作用：抗死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用: Vucic 等13將 livin 基因轉(zhuǎn)染乳腺癌 MCF7 細(xì)胞,證實(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì) Fas,TNFR1(tumor necrosis factor receptor 1),DR4 (death receptor 4)及 DR5 介導(dǎo)的細(xì)胞凋 亡具有顯著的抑制作用。 Kasof 等14將 livin 基因轉(zhuǎn)染 HeLa 細(xì)胞,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞可有效阻斷由 FADD(Fas associated protein with death do main),Bax,RIP,RIP3 及 DR6 誘導(dǎo)的細(xì)