醫(yī)學專題—動植物細胞器離心法分離課件

1、醫(yī)學專題動植物細胞器離心法分離實驗實驗4 動植物細胞器分離動植物細胞器分離(fnl)、制備與觀察、制備與觀察 I 線粒體制備與活性鑒定【目的目的】1掌握分離(fnl)制備動物和植物細胞線粒體的方法。2對分離得到的線粒體進行活性鑒定?！驹碓怼縩線粒體（mitochondria）是真核細胞特有的，司能量轉換的重要細胞器。細胞中的能源物質脂肪、糖、部分氨基酸在此進行最終的氧化，并通過藕聯(lián)磷酸化生成ATP，供給細胞生理活動之需。第一頁，共二十六頁。醫(yī)學專題動植物細胞器離心法分離n將動植物組織制成勻漿，在適當?shù)膽腋〗橘|中用差速離心法可以分離細胞(xbo)線粒體。在一定的離心場中(選用離心機的一定轉速

2、)，球心顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質的黏度。在一均勻懸浮介質中離心一定時間，組織勻漿中的各種細胞器及其他內含物由于沉降速度不同將停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。細胞器沉降先后順序是細胞核、線粒體、溶酶體和其他微體、核糖體和大分子。第二頁，共二十六頁。醫(yī)學專題動植物細胞器離心法分離n懸浮介質通常采用緩沖(hunchng)的蔗糖溶液，它較接近細胞質的分散相，在一定程度上能保持細胞器的結構和酶的活性；pH7.2的條件下；亞細胞組分不容易重新聚集成團，有利于分離。整個操作過程樣品要保持在04，避免酶失活。

3、第三頁，共二十六頁。醫(yī)學專題動植物細胞器離心法分離n細胞器標記酶的測定是評價細胞器內膜組分和分離純度的主要依據(jù)，如線粒體內膜上分布(fnb)有細胞色素氧化酶，該酶使詹納斯綠B染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍綠色從而使線粒體顯色，而胞質中的染料被還原成無色。第四頁，共二十六頁。醫(yī)學專題動植物細胞器離心法分離n詹納斯綠B是一種活體染料，能對動、植物的細胞或組織在活體狀態(tài)下進行無毒害的染色。由于染料(堿性染料)的膠粒表面帶有陽離子，酸性染料的膠粒表面帶陰離子，而被染部分本身具有(jyu)陰離子或陽離子，這樣，它們彼此之間發(fā)生吸引作用，染料就被堆集下來。染色法可以顯示出活細胞內的某種天然結構存在的真實性，而不

4、影響細胞的生命活動和產生任何物理、化學變化以至引起細胞的死亡。第五頁，共二十六頁。醫(yī)學專題動植物細胞器離心法分離鼠肝線粒體的分離鼠肝線粒體的分離(fnl)【材料材料】鼠肝臟或豬肝臟?！緦嶒炗闷穼嶒炗闷贰?試劑：(1) 0.25 molL蔗糖+0.01 molL三羥甲基氨基甲烷(Tris)一鹽酸緩沖液(pH 7.4)： 0.1 molL三羥甲基氨基甲烷溶液(rngy) 10 mL 0.1 molL鹽酸 8.4 mL 加雙蒸水到100 mL，再加蔗糖使?jié)舛葹?.25 molL。(2) 0.34 molL蔗糖+0.01 molL Tris一鹽酸緩沖液(pH7.4)，配法同上。第六頁，共二十六頁。醫(yī)學

5、專題動植物細胞器離心法分離(3) 1詹納斯綠B(Janus green B)染液，稱取50 mg詹納斯綠B液溶于5mL生理鹽水中，稍微加熱使之溶解后，過濾，即為1原液。(4) 姬姆薩染液(Giemsa)： 稱取Giemsa粉0.5 g、甘油33 mL、純甲醇(ji chn)33 mL。先在Giemsa粉中加少量甘油，然后在研缽內研磨至無顆粒狀，再將剩余甘油倒入混勻，56左右保溫2 h，使其充分溶解，最后加甲醇混勻，成為Giemsa原液，保存于棕色瓶。使用時吸出少量用115molL磷酸緩沖液作1020倍稀釋。第七頁，共二十六頁。醫(yī)學專題動植物細胞器離心法分離(5) 115 molL磷酸緩沖液 (

6、pH 6.8)：115 molL磷酸二氫鉀(KH2PO4) 50 mL115 molL磷酸氫二鈉(Na2HPO4) 50 mL(6) 卡諾(k nu)(Cornay)固定液： 無水乙醇 6 mL 冰醋酸 1 mL 氯 仿 3 mL(7) 生理鹽水第八頁，共二十六頁。醫(yī)學專題動植物細胞器離心法分離2器具(qj)：n解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃勻漿器，尼龍織物(zhw)，刻度離心管，顯微鏡，冷凍高速離心機。第九頁，共二十六頁。醫(yī)學專題動植物細胞器離心法分離【實驗實驗(shyn)步驟步驟】1制備肝細胞勻漿：實驗前將鼠空腹12小時，擊頭處死，剖腹(pu f)取肝，迅速用生理鹽水洗凈血水，用濾紙吸干水，稱取

7、肝組織2 g，剪碎；用預冷的0.25 molL蔗糖溶液洗滌數(shù)次。然后按每克肝加4.5 mL預冷的0.25 molL蔗糖溶液的量，分數(shù)次添加蔗糖溶液，在04冰浴中用玻璃勻漿器將肝制成勻漿，用雙層紗布過濾。第十頁，共二十六頁。醫(yī)學專題動植物細胞器離心法分離2差速離心： 將0.34 molL蔗糖溶液4.5mL放入離心管，然后沿管壁小心地加入4.5mL鼠肝勻漿覆蓋(fgi)于上層。用冷凍控溫的高速離心按下圖順序進行差速離心。第十一頁，共二十六頁。醫(yī)學專題動植物細胞器離心法分離分離(fnl)細胞核：鼠肝勻漿700g離心(lxn)10 min 沉淀(細胞核及質膜碎片) 上清液(1) 洗滌(0.25 mol

8、L預冷蔗糖溶液5 mL洗滌2次，每次1000g離心15 min。 沉淀(細胞核及質膜碎片) 上清液(2)與上清(1)合并第十二頁，共二十六頁。醫(yī)學專題動植物細胞器離心法分離分離(fnl)線粒體：混合上清液10000g離心10 min沉淀(線粒體) 上清液(棄去)洗滌加預冷的0.25 molL蔗糖溶液(rngy)10 mL，10000g離心10 min沉淀(純化的線粒體) 上清液(棄去)第十三頁，共二十六頁。醫(yī)學專題動植物細胞器離心法分離3活性鑒定(jindng)： (1) 細胞核：取核沉淀1滴涂于載玻片，加入Carnoy固定液15 min，晾干。Giemsa染液染10 min，蒸餾水漂洗數(shù)秒，

9、用濾紙吸干水、用顯微鏡(40)檢查(jinch)，細胞核呈紫紅色，混雜的胞質為淺藍色碎片。(2) 線粒體： 取線粒體沉淀滴在載玻片上，勿太密。滴加1詹鈉斯綠溶液染液，10 min后用光學顯微鏡觀察，線粒體藍綠色，呈小棒狀或啞鈴狀。第十四頁，共二十六頁。醫(yī)學專題動植物細胞器離心法分離玉米玉米(ym)線粒體的分離線粒體的分離n從植物細胞分離線粒體，除了作線粒體功能測定外，在植物細胞遺傳工程中，常用于分離核外基因線粒體DNA等目的。n分離線粒體的方法仍采用均勻(jnyn)介質中的差速離心。介質中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA整合二價陽離子，Ca2除去后細胞間粘著解

10、體，促使組織分散成單個細胞。牛血清白蛋白(BSA)能包在細胞外面，并作為競爭性底物削弱蛋白酶的作用。第十五頁，共二十六頁。醫(yī)學專題動植物細胞器離心法分離【材料材料】玉米黃化幼苗(水稻、高粱等幼苗均可)?！緦嶒炗闷穼嶒炗闷贰?試劑(shj)：（1）分離介質：0.25mol/L蔗糖，50mmol/L的Tris-鹽酸緩沖液(pH7.4)，3mmol/LEDTA，0.75mg/mL牛血清白蛋白(BSA)。 50mmol/L的Tris-Hcl緩沖液(pH7.4)配法：50mL0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液與42mL 0.1mol/L鹽酸混勻后，加水稀釋至100mL。第十六頁，共二十六頁

11、。醫(yī)學專題動植物細胞器離心法分離（2）保存液：0.3mol/L甘露醇(pH7.4)（3）20次氯酸鈉(NaClO)溶液(rngy)。（4）1詹納斯綠B染液，用生理鹽水配制。2器材：溫箱、冰箱、紗布、瓷研缽、冷凍控溫高速離心機。第十七頁，共二十六頁。醫(yī)學專題動植物細胞器離心法分離【實驗實驗(shyn)步驟步驟】1玉米種子用20次氯酸鈉溶液浸泡10min消毒，清水沖洗30min，再浸泡清水15h。將種子平鋪在放有濕紗布(shb)的盤內，保持濕度，置溫箱28于暗處培育23d。待芽長到12cm長時剪下約15g，放041h。2加3倍體積分離介質，在瓷研缽內快速研磨成勻漿。3用多層紗布過濾，濾液經700g

12、離心10min。除去核和雜質沉淀。4取上清液10000g離心10min，沉淀為線粒體。再同上離心洗滌一次。5沉淀為線粒體，可存于0.3mol/L甘露醇中。注意以上勻漿化及離心均控制在04進行。6線粒體的觀察：取線粒體沉淀涂在清潔的載玻片上，不待干立即滴加1詹納斯綠B染色20min，放上蓋玻片，用顯微鏡觀察，線粒體是藍綠色圓形顆粒。第十八頁，共二十六頁。醫(yī)學專題動植物細胞器離心法分離【注意事項注意事項】n實驗全過程要求在04進行，如果使用非冷凍控溫的離心機，一般(ybn)只宜分離細胞核和線粒體，同時注意使樣品保持冷凍；盡可能充分破碎組織、縮短勻漿時間。整個分離過程不宜過長?！緦嶒瀳蟾鎸嶒瀳蟾妗縩

13、繪制線粒體示意圖。第十九頁，共二十六頁。醫(yī)學專題動植物細胞器離心法分離II 葉綠體的分離與熒光葉綠體的分離與熒光(ynggung)觀察觀察【目的目的】 了解葉綠體分離的一般原理和方法，并熟悉應用熒光顯微鏡方法觀察葉綠體熒光現(xiàn)象?！驹碓怼?葉綠體是植物細胞中較大的一種細胞器，能發(fā)生特有的能量轉換。利用低速離心機可以分離葉綠體，其分離在等滲溶液(035 molL氯化鈉或04 molL蔗糖溶液)中進行，目的是為了防止?jié)B透壓的改變引起葉綠體的損傷。將勻漿液在1000 rmin離心，去除其中的組織(zzh)殘渣和一些未被破碎的完整細胞，然后，3000 rmin離心，可獲得沉淀的葉綠體(混有部分細胞核

14、)。在室溫下進行分離要迅速。第二十頁，共二十六頁。醫(yī)學專題動植物細胞器離心法分離n某些物質(wzh)在一定短波長的光(如紫外光)的照射下吸收光能進入激發(fā)態(tài)，從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，就能在極短的時間內放射出比照射光波長更長的光(如可見光)，這種光就稱為熒光。若停止供能熒光現(xiàn)象立即停止。有些生物體內的物質受激發(fā)光照射后，可直接發(fā)出熒光(稱為自發(fā)熒光)，如葉綠素的火紅色熒光。有的生物材料本身不發(fā)熒光，但它吸收熒光染料后同樣也能發(fā)出熒光(稱為間接熒光)，如葉綠體吸附吖啶橙后可發(fā)橘紅色熒光。本實驗利用熒光顯微鏡對發(fā)熒光的葉綠體進行觀察。第二十一頁，共二十六頁。醫(yī)學專題動植物細胞器離心法分離【材料材料】 菠萊

15、葉片?！緦嶒炗闷穼嶒炗闷贰?試劑：蒸餾水，0.35 molL氯化鈉溶液，0.01吖啶橙。2器材：普通離心機，組織搗碎(do su)機，天平，熒光顯微鏡，顯微鏡，載玻片，蓋玻片，鑷子，接種針，目鏡測微尺，物鏡測微尺，恒溫箱，培養(yǎng)皿，濾紙，試管，試管架，移液管，滴管，燒杯，無熒光載片，蓋玻片，離心管。第二十二頁，共二十六頁。醫(yī)學專題動植物細胞器離心法分離【實驗實驗(shyn)步驟步驟】1選取新鮮的菠菜嫩葉，洗擦干后去除葉梗及粗脈，稱3g于0.35 molL氯化鈉溶液45mL中，置入組織搗碎機或研缽中。2利用組織搗碎機低速(5000 rmin)勻漿35 min，或研磨成勻漿。3用6層紗布過濾，濾液(

16、ly)盛于燒杯中。4取濾液4 mL在1000 rmin下離心2 min，棄去沉淀。5將上清液在3000 rmin下離心5 min棄去上清液，沉淀即為葉綠體(混有部分細胞核)。第二十三頁，共二十六頁。醫(yī)學專題動植物細胞器離心法分離6沉淀用0.35 molL氯化鈉溶液懸浮。7取葉綠體懸液l滴置于載玻片上，加蓋玻片后用普通(ptng)光學顯微鏡觀察。使用熒光顯微鏡觀察時，將葉綠體懸液滴在無熒光的載玻片上，再滴加l滴0.01吖啶橙熒光染料，蓋上無熒光的蓋玻片后即可觀察。8觀察葉綠體的形態(tài)結構、測量510個葉綠體的長軸和短軸、葉綠體發(fā)射熒光的現(xiàn)象。第二十四頁，共二十六頁。醫(yī)學專題動植物細胞器離心法分離【實驗報告實驗報告】n繪制普通光學顯微鏡下觀察的葉綠體形態(tài)示意圖，記錄(jl)熒光顯微鏡觀察的現(xiàn)象